何學(xué)彥　張　超(遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院普外科，貴州　遵義　563002)

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miR－503在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及對細(xì)胞增殖、凋亡的影響

何學(xué)彥張超1(遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院普外科，貴州遵義563002)

〔摘要〕目的探討microRNA－503( miR－503)在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。方法采用實時定量PCR( qPCR)檢測54例結(jié)直腸癌組織及4種結(jié)直腸癌細(xì)胞( SW480、Lovo、LS174T和HT－29)中的miR－503水平，分析結(jié)直腸癌組織miR－503表達(dá)與常見臨床病理參數(shù)的關(guān)系，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR－503模擬物( mimics)至miR－503水平最低的細(xì)胞，采用MTT法、流式細(xì)胞儀及Transwell法檢測過表達(dá)miR－503對細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期和侵襲的影響。結(jié)果54例結(jié)直腸癌組織的miR－503相對表達(dá)量為( 0．257±0．011)，低于癌旁組織( P＜0．05)，且miR－503水平與TNM分期、分化情況、腫瘤大小和術(shù)前癌胚抗原均有關(guān)( P＜0．05) ;與人正常結(jié)腸細(xì)胞系CCD－18Co相比，4種不同惡性程度結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、Lovo、LS174T和HT－29的miR－503相對表達(dá)量依次為( 0．342±0．072)、( 0．161±0．054)、( 0．260±0．041)和( 0．415± 0．086)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0．05) ;與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR－503 mimics后的細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率均升高，G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例均降低，穿膜細(xì)胞數(shù)減少( P＜0．05)。結(jié)論miR－503在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，且與結(jié)直腸癌的臨床病理參數(shù)有關(guān)，上調(diào)miR－503水平可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。

〔關(guān)鍵詞〕iR－503;結(jié)直腸癌;細(xì)胞;增殖;凋亡

1第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院普通外科

第一作者:何學(xué)彥( 1966－)，男，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸疾病研究。

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國發(fā)病率和死亡率均較高，確診患者大多數(shù)已為晚期，治療手段局限，預(yù)后較差〔1〕。microRNA( miR)是一種保守的內(nèi)源性非編碼基因，可調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，目前發(fā)現(xiàn)多種miRs在腫瘤組織中異常表達(dá)，且與其惡性行為調(diào)節(jié)有關(guān)，探討與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)的miRNA已成為腫瘤防治熱點(diǎn)〔2，3〕。miR－503已證實在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，且與患者預(yù)后較差有關(guān)〔4〕，同時可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移〔5〕，以上結(jié)果提示其可能在惡性腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用。目前尚無miR－503在結(jié)直腸癌中表達(dá)的報告，其在結(jié)直腸細(xì)胞中的功能尚不清楚，故本研究擬首先檢測miR－503在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法驗證其對細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。

1材料與方法

1. 1組織樣本收集本院2012年5月至2014年12月的結(jié)直腸癌術(shù)后標(biāo)本54例及5 cm處癌旁無瘤黏膜組織，均經(jīng)病理證實且術(shù)前未接受放化療，其中男32例，女22例;年齡32～71歲，中位年齡56．5歲;腫瘤位置:結(jié)腸32例，直腸22例; TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期31例，Ⅲ、Ⅳ期23例;分化情況:中、低分化27例，高分化27例; 20例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1. 2試劑及儀器4種不同惡性程度的人結(jié)直腸癌細(xì)胞株( SW480、Lovo、LS174T和HT－29)及正常結(jié)腸細(xì)胞系CCD－18Co均購自上海中科院生化細(xì)胞所，RNA抽提試劑盒Trizol、脂質(zhì)體試劑Lipofectamine 2000TM購自美國Invitrogen公司，SYBR Green 2×Mix均購自寶生物(大連)工程有限公司，miR－503模擬物( mimics)由銳博生物(中國)公司設(shè)計合成，噻唑藍(lán)( MTT)購自美國Amresco公司。流式細(xì)胞儀FACS－CALIBUR型為美國BD公司產(chǎn)品，Prism 7000 PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1. 3實時定量PCR( qPCR)采用TRIzol法提取組織和細(xì)胞中的總RNA，以符合試驗要求的RNA為模板，利用AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為: 1630 min，42℃30 min，85℃5 min;在ABI Prism 7000實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性10 min，( 95℃15 s，60℃1 min)×40個循環(huán)。qPCR引物由Premier Primer 5．0 software設(shè)計: miR－503上游引物: 5'－CGCGGGATCGGGTCAGA－3'，下游引物: 5'－GGGAACATGTTGATCTCAG－3';內(nèi)參U6上游引物: 5'－CTCGCTTCGGCAGCACA－3'，下游引物: 5'－AACGCTTCACGAATTTGCGT－3'。2－△△Ct法測定組織和細(xì)胞中的miR－503表達(dá)情況。每組實驗重復(fù)3次。

1. 4細(xì)胞轉(zhuǎn)染待結(jié)直腸癌細(xì)胞匯合度約70%時，將細(xì)胞置于無RNA酶的EP管(含200 μl Opti－MEM培養(yǎng)基)，加入5 μl 50 nmol/L的miR－503 mimics進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染96 h采用qPCR法檢測miR－503水平。

1. 5 MTT法分別于轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，避光4 h，用加樣槍每孔加入DMSO 200 μl，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長下各孔吸光值( A)，其中未轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌細(xì)胞為對照組，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染miR－503 mimics的為轉(zhuǎn)染組，根據(jù)公式計算增殖抑制率，增殖抑制率( %) = 1－A轉(zhuǎn)染組/A對照組×100%。每組實驗重復(fù)3次。

1. 6流式細(xì)胞儀將細(xì)胞轉(zhuǎn)染48、96 h后按2×105個/ml的密度接種，24 h后收集用冷乙醇固定，加入RNase后按照BD試劑盒說明書步驟完成Annexin V－FITC/PI雙染或PI單染后，15 min后上機(jī)測定凋亡率和細(xì)胞周期。每組實驗重復(fù)3次。

1. 7 Transwell實驗將準(zhǔn)備好的12孔板嵌套Transwell小室，選取指數(shù)生長期細(xì)胞，用DMEM(含1%小牛血清)稀釋制備3．5×104個/ml的細(xì)胞懸液;細(xì)胞懸液按每孔100 μl加入Transwell小室，每組3孔，Transwell下室加入DMEM( 10%小牛血清) ;36 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液用棉簽拭去上室未穿膜的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色后，上室倒置于顯微鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。每組實驗重復(fù)3次。

1. 8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS18．0軟件處理。計量資料以x±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2. 1 miR－503水平與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系結(jié)直腸癌組織的miR－503相對表達(dá)量為( 0．257±0．011)，低于癌旁組織( P＜0．05)。54例結(jié)直腸癌組織中miR－503水平與TNM分期、分化情況、腫瘤大小和術(shù)前癌胚抗原( CEA)均有關(guān)，其中TNMⅢ、Ⅳ期，中、低分化，腫瘤大?。? cm和術(shù)前CEA＞5．0 ng/ml者的miR－503水平依次為0．121±0．009、0．112± 0．012、0．149±0．017和0．155±0．023，均低于相應(yīng)項目( 0．358± 0．032、0．402±0．049、0．392±0．031、0．327±0．030) ( P＜0．05)，miR－503水平與性別(男: 0．249±0．011，女: 0．268±0．014)年齡(≤50歲: 0．261±0．012，＞50歲: 0．253±0．009)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有: 0．251±0．025，無: 0．260±0．016)、腫瘤位置(結(jié)腸: 0．262± 0．017、直腸: 0．249±0．026)等其他參數(shù)無關(guān)( P＞0．05)。

2. 2 miR－503在不同惡性程度結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

與人正常結(jié)腸細(xì)胞系CCD－18Co相比，4種不同惡性程度結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、Lovo、LS174T和HT－29的miR－503相對表達(dá)量依次為( 0．342±0．072)、( 0．161±0．054)、( 0．260±0．041)和( 0．415±0．086)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0．05)，同時后續(xù)試驗選擇miR－503表達(dá)量最低的Lovo細(xì)胞。

2. 3過表達(dá)miR－503對Lovo細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染miR－503 mimics 96 h后采用qRT－PCR檢測Lovo細(xì)胞中miR－503水平，圖1A顯示較對照組，轉(zhuǎn)染組的miR－503表達(dá)量升高，且升高至對照組的( 6．124±0．024)倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0．05) ;圖1B顯示轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h后的增殖能力受抑制，增殖抑制率隨轉(zhuǎn)染時間延長而升高( P＜0．05)。

2. 4過表達(dá)miR－503對Lovo細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示對照組和轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48 h的Lovo細(xì)胞總凋亡率分別為( 4．92±0．83) %和( 21．75±2．61) %，而轉(zhuǎn)染96 h的總凋亡率分別為( 6．24±1．02) %和( 37．02±4．42) %，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48、96 h的總凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0．05)。

2. 5過表達(dá)miR－503對Lovo細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示與對照組相比，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染96 h后的G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期和G2/M期細(xì)胞比例均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0．05)。見表1。

2. 6過表達(dá)miR－503對Lovo細(xì)胞侵襲的影響Transwell法檢測結(jié)果顯示對照組和轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24 h的Lovo細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為( 87．1±7．2)和( 55．2±4．8)個，而轉(zhuǎn)染48 h的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為( 145．7±11．6)和( 87．0±8．4)個，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24、48 h的穿膜細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0．05)。見圖1。

表1過表達(dá)miR-503對Lovo細(xì)胞周期的影響( %)

圖1過表達(dá)miR-503后Lovo細(xì)胞的Transwell實驗圖

3討論

轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在多種細(xì)胞過程發(fā)揮重要作用，如發(fā)展，神經(jīng)發(fā)生和癌變〔6〕。miRNAs是一種重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，可抑制mRNA轉(zhuǎn)位并通過與靶基因mRNA 3'－UTR配對來誘導(dǎo)其斷裂〔3，7〕。異常表達(dá)的miRNAs及其靶基因調(diào)控紊亂是目前惡性腫瘤防治的研究熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)miRNAs的異常調(diào)控可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及耐藥〔6〕。

miR－503是一個基因內(nèi)部miRNA，位于Xq26．3，屬于擴(kuò)展的miR－16家族〔8〕。miRNA芯片分析表明，與相應(yīng)正常組織相比，miR－503表達(dá)水平在不同腫瘤的趨勢存在差異，如在口腔癌，非小細(xì)胞肺癌、肝癌和子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)降低〔4，8～10〕，而在腎上腺皮質(zhì)癌，甲狀旁腺癌和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中表達(dá)升高〔11～13〕。生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)miR－503具有腫瘤抑制作用，如可抑制人頭頸部鱗癌細(xì)胞增殖及減少肝細(xì)胞癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔8，12〕。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的miR－503均為低表達(dá)，與在非小細(xì)胞肺癌及肝癌等腫瘤中的趨勢一致〔8，11〕，表明miR－503在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中起抑癌基因的作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR－503表達(dá)與TNM分期、分化情況、腫瘤大小和術(shù)前CEA均有關(guān)，且以上指標(biāo)惡性程度越高、其miR－503水平越低，同時也提示miR－503水平可能有助于結(jié)直腸癌的病情評估。

由于Lovo細(xì)胞的miR－503水平最低，故本研究選取了Lovo細(xì)胞并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR－503 mimics來上調(diào)其水平，以驗證miR－503在結(jié)直腸癌中的調(diào)控效果。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染成功且持續(xù)時間長，便于連續(xù)觀測細(xì)胞學(xué)行為變化。本研究結(jié)果表明miR－503可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移并誘導(dǎo)凋亡，且隨著轉(zhuǎn)染時間延長，抑制效應(yīng)也增強(qiáng)。Guo等〔5〕的研究發(fā)現(xiàn)miR－503可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，Peng等〔6〕發(fā)現(xiàn)miR－503對乳腺癌的增殖亦有抑制效果，結(jié)合以上研究和本結(jié)果得出miR－503對于惡性腫瘤具有較廣的抑制效果，針對miR－503設(shè)計的治療策略，不僅會使結(jié)直腸癌患者受益，而且對于其他惡性腫瘤的防治也亦有較大價值。本研究發(fā)現(xiàn)miR－503可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞周期阻滯，使絕大多數(shù)細(xì)胞停留在G0/G1期，這也可能是其抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的一個原因，可能與其靶基因在細(xì)胞周期中的調(diào)控作用有關(guān)。

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〔2015－02－13修回〕

(編輯徐杰)

·呼吸、消化系統(tǒng)疾病·

〔中圖分類號〕R734

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0369-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 053