藍(lán)景生　張　震羅　薇覃梓慶　趙艷英　(廣西民族醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西　南寧　53000)

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經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后慢復(fù)流老年患者白細(xì)胞介素－33/ST2信號(hào)通路表達(dá)及臨床意義

藍(lán)景生張震1羅薇1覃梓慶趙艷英(廣西民族醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣西南寧530001)

〔摘要〕目的探討經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入( PCI)后慢復(fù)流老年患者L－33/ST2信號(hào)通路的表達(dá)及意義。方法行PCI患者210例，入院后行心電圖檢查，常規(guī)測(cè)量血壓，檢測(cè)血糖、血脂、白細(xì)胞介素( IL)－33和ST2 mRNA和蛋白測(cè)定，所有患者接受PCI治療后根據(jù)術(shù)后心肌灌注分級(jí)分為慢復(fù)流組72例和正常血流組138例，分析IL－33和ST2 mRNA和蛋白表達(dá)與老年患者PCI術(shù)后慢復(fù)流的相關(guān)性。結(jié)果①慢復(fù)流組甘油三酯( TG)、總膽固醇( TC)和低密度脂蛋白( LDL)水平均較正常復(fù)流組顯著升高( P＜0．01或P＜0．05) ;②慢復(fù)流組IL－33、ST2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較正常復(fù)流組顯著升高( P＜0．01) ;③多因素Logistic回歸分析顯示TG、TC、LDL、IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白是PCI術(shù)后發(fā)生慢復(fù)流的危險(xiǎn)因素。結(jié)論IL－33和ST2表達(dá)水平升高可能導(dǎo)致PCI術(shù)后老年患者發(fā)生慢復(fù)流，因此IL－33/ST2信號(hào)通路可能參與PCI術(shù)后慢復(fù)流的發(fā)生。

〔關(guān)鍵詞〕經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入; IL－33/ST2信號(hào)通路

1右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科

第一作者:藍(lán)景生( 1969－)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事心肌疾病炎癥反應(yīng)研究。

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入( PCI)是治療急性心肌梗死( AMI)的主要措施之一，但是，PCI術(shù)后仍有30%～40%患者出現(xiàn)無復(fù)流( NR)、慢復(fù)流( SR)現(xiàn)象，嚴(yán)重影響患者臨床預(yù)后〔1〕。NR和SR可導(dǎo)致心肌梗死后更多發(fā)生充血性心力衰竭、惡性心律失常和心源性猝死等。冠心病是一種炎癥和自身免疫性疾病，其病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化( AS)，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在AS的形成過程中起著重要的作用〔2，3〕。白細(xì)胞介素( IL)－33是一種前炎性細(xì)胞因子，可與ST2受體結(jié)合而啟動(dòng)IL－33/ST2信號(hào)傳導(dǎo)通路，可調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答〔4，5〕。目前關(guān)于L－33/ST2信號(hào)通路與AMI老年患者PCI術(shù)后產(chǎn)生NR現(xiàn)象的相關(guān)研究較少。本文擬分析PCI術(shù)后SR患者IL－33/ST2信號(hào)通路表達(dá)及意義。

1資料與方法

1. 1一般資料2013年1月至2015年3月在本院心血管內(nèi)科行PCI的210例患者，其中男116例( 55．24%)，女94例( 44．76%)，年齡60～81歲，平均( 63．67±8．64)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①缺血性胸痛持續(xù)時(shí)間＞30 min，并且舌下含服硝酸甘油未緩解;②血清肌酸激酶或肌鈣蛋白升高＞正常上限2倍。排除標(biāo)準(zhǔn):①有AMI史、冠狀動(dòng)脈支架或搭橋術(shù)史的患者;②發(fā)病時(shí)間＞24 h;③對(duì)造影劑過敏的患者;④有嚴(yán)重肝腎功能障礙及凝血功能障礙的患者;⑤有急慢性感染性疾病或免疫性疾病的患者;⑥研究者認(rèn)為不適于參加本研究的患者。根據(jù)PCI術(shù)后心肌灌注分級(jí)分為SR組72例和正常血流組138例，以心肌灌注分級(jí)0～1級(jí)為SR，以2～3級(jí)為正常復(fù)流。

1. 2主要試劑與儀器Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司) ;兔抗人IL－33抗體( Cloud－Clone Corp公司) ;兔抗人ST2抗體(美國(guó)Abcam公司) ;辣根過氧化物酶( HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京Trans Gen公司) ; PCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR Mix(日本Taka Ra公司) ; EXL808全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO－TEK公司) ; ABI 7300熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司) ; GeneGenius全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Syngene公司) ; KodaK4000 MM顯像系統(tǒng)(美國(guó)Carestream Health公司) ; 7070全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi公司) ; Volcano－s5血管內(nèi)超聲儀(美國(guó)Volcano公司) ; IL－33、ST2和GAPDH內(nèi)參引物均由上海Generay Biotech公司合成，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

表1引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1. 3治療方法所有入選患者術(shù)前檢查后，立即給予患者阿司匹林300 mg、氯吡格雷300 mg雙抗血小板治療，并且應(yīng)用他汀類藥物降脂、低分子肝素鈣抗凝、硝酸酯類藥物擴(kuò)冠等治療。以右橈動(dòng)脈或右股動(dòng)脈為穿刺入路，按照標(biāo)準(zhǔn)冠脈內(nèi)支架置入術(shù)施行PCI。PCI術(shù)后均給予常規(guī)治療，嚴(yán)格臥床，持續(xù)動(dòng)態(tài)心電監(jiān)測(cè)，抗血小板聚集、抗凝、擴(kuò)冠、降脂等治療。

1. 4檢測(cè)指標(biāo)與方法所有入選患者在入院后行心電圖檢查，常規(guī)測(cè)量血壓，抽取靜脈血進(jìn)行血糖、血脂等測(cè)定，并進(jìn)行IL－33和ST2 mRNA和蛋白測(cè)定。

1. 4. 1血壓、血脂和血糖的測(cè)定常規(guī)水銀血壓計(jì)測(cè)量收縮壓和舒張壓，血脂測(cè)定采用日立7070全自動(dòng)生化分析儀，包括總膽固醇( TC)、甘油三酯( TG)、高密度脂蛋白( HDL)、低密度脂蛋白( LDL)。

1. 4. 2 IL－33和ST2 mRNA的測(cè)定外周血RNA采用Trizol試劑提取。沉淀細(xì)胞，裂解細(xì)胞，分離、沉淀、洗滌和溶解RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的A260 nm/A280 nm，1．5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。選擇1．8～2．0并且無降解的RNA樣品按反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑盒說明合成cDNA。在冰上配制RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系: Prime Script TMRT Enzyme Mix 1 μl，5×Prime ScriptTM緩沖液4 μl，OligodT Primer 1 μl，總RNA 6．0 μl，隨機(jī)引物1 μl，RNAse Freed H2O 7．0 μl，總反應(yīng)體系20 μl。反應(yīng)條件為37℃，15 min，再經(jīng)85℃，5 s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，獲得cDNA樣品。將cDNA產(chǎn)物擴(kuò)增在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，RT－PCR反應(yīng)按照試劑盒說明進(jìn)行。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性15 min; 95℃變性30 s，62℃退火31 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2－ΔΔCt法計(jì)算Toll樣受體( TLR) 2和TLR4 mRNA的表達(dá)量。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，然后Gene Genius全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中掃描分析結(jié)果。

1. 4. 3 IL－33和ST2蛋白的測(cè)定外周血加入放射免疫沉淀法( RIPA)細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞，離心10 min，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液( PBS)洗滌，超聲切割30 s后4℃2 000 r/min離心10 min，采用聚氰基丙烯酸正丁酯( BCA)法測(cè)各組蛋白濃度。用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與上樣緩沖液混合，煮沸10 min蛋白變性，每組取30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，采用脫脂奶粉封閉，一抗孵育1 h，二抗室溫孵育1 h，緩沖液洗膜3次，使用顯色試劑盒對(duì)底物進(jìn)行顯色、定影。上述反應(yīng)以β－actin作為內(nèi)參照，結(jié)果用KodaK 4000 MM顯像系統(tǒng)獲取圖像并測(cè)量條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與β－actin的比值作為各組產(chǎn)物相對(duì)表達(dá)值。

1. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)，Logistic回歸分析。

2結(jié)果

2. 1兩組臨床資料的比較兩組年齡、性別、危險(xiǎn)因素(高血壓、糖尿病、血脂紊亂、吸煙比例)、收縮壓( SBP)、舒張壓( DBP)、血糖和HDL差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0．05)，SR組TG、TC和LDL水平均較正常復(fù)流組顯著升高( P＜0．01或P＜0．05)。見表2。

2. 2兩組IL－33、ST2表達(dá)的比較SR組IL－33、ST2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較正常復(fù)流組顯著升高( P＜0．01)。見表3。

表2兩組臨床資料的比較〔n( %)±s〕

表2兩組臨床資料的比較〔n( %)±s〕

分組n　　性別男女年齡(歲)　　危險(xiǎn)因素高血壓　　糖尿病　　血脂紊亂　　吸煙SR組　72　 38( 52．78)　34( 47．22)　 64．34±8．95　 33( 45．83)　16( 22．22)　45( 62．50)　19( 26．39)正常復(fù)流組138　 78( 56．52)　60( 43．48)　 63．04±7．59　 64( 46．38)　29( 21．01)　69( 50．00)　43( 31．16) t或χ2/P值　－　0．268/0．605　1．107/0．051　 0．006/0．940　 0．041/0．840　 2．979/0．084　 0．518/0．472分組　n　 SBP( mmHg)　 DBP( mmHg)　　血糖( mmol/L)　 TC( mmol/L)　 TG( mmol/L)　 LDL( mmol/L)　 HDL( mmol/L) SR組　72　 135．42±16．74　 88．60±13．70　 5．17±1．24　 4．95±1．21　 1．83±0．82　 3．34±0．82　 0．84±0．17正常復(fù)流組138　 137．74±17．53　 87．54±14．25　 5．08±1．19　 4．59±1．18　 1．52±0．75　 2．84±0．79　 0．86±0．20 t或χ2/P值?。?．924/0．357　 0．518/0．605　 0．513/0．609　 2．080/0．039　 2．753/0．007　 4．297/0．000　 0．723/0．471

表3兩組IL-33、ST2表達(dá)的比較(±s)

表3兩組IL-33、ST2表達(dá)的比較(±s)

分組　n　IL－33ST2 mRNA　　蛋白mRNA　　蛋白SR組　72 0．84±0．12 1．14±0．24 0．59±0．08 0．79±0．11正常復(fù)流組　138 0．60±0．11 0．79±0．27 0．32±0．06 0．55±0．10 t值　?。?4．543　 9．254　 27．516　 15．947 P值　?。?．000　 0．000　 0．000　 0．000

表4 PCI術(shù)后SR的多因素Logistic回歸分析

2. 3 SR的多因素Logistic回歸分析見表4。以PCI術(shù)后有無出現(xiàn)SR為因變量，將性別、年齡、高血壓比例、糖尿病比例、血脂紊亂比例、患者吸煙比例、SBP、DBP、TG、TC、HDL、LDL、血糖、IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示TG、TC、LDL、IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白是PCI術(shù)后發(fā)生SR的危險(xiǎn)因素。

3討論

AMI是冠心病患者死亡的首要原因。AMI早期診斷和有效治療對(duì)于降低死亡率有重要的臨床意義。目前AMI主張積極、盡早進(jìn)行冠脈再通治療，PCI可以縮短心肌缺血時(shí)間，降低心肌梗死面積，保護(hù)心功能，改善臨床預(yù)后。但隨著介入治療的開展，無/復(fù)流現(xiàn)象隨之產(chǎn)生，最終導(dǎo)致不可逆的心肌壞死和心力衰竭。冠狀動(dòng)脈NR或SR現(xiàn)象的臨床表現(xiàn)取決于PCI靶血管供血心肌的范圍、患者心功能狀態(tài)及非PCI靶冠狀動(dòng)脈病變的程度。近年來對(duì)“NR/SR”防治措施研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的熱點(diǎn)研究課題之一，PCI后發(fā)生NR是院內(nèi)死亡和心肌梗死的強(qiáng)獨(dú)立預(yù)測(cè)因素〔6〕。冠狀動(dòng)脈NR/SR現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，但粥樣物質(zhì)造成冠狀動(dòng)脈遠(yuǎn)端的微栓塞、心肌缺血再灌注損傷、毛細(xì)血管床的部分壞死及內(nèi)皮功能障礙被認(rèn)為是其發(fā)生的主要機(jī)制。

目前認(rèn)為冠心病的發(fā)病過程也是一種炎癥反應(yīng)，是在體液調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上，血液中細(xì)胞因子、趨化因子等共同作用的結(jié)果，同時(shí)也與免疫細(xì)胞的激活和失衡密切相關(guān)。IL－33屬IL－1家族，主要在基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)〔7〕。IL－33作為一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，能夠多方面調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，其特異性受體是ST2〔8〕。ST2基因可編碼至少3種不同的亞型，當(dāng)心肌細(xì)胞受到機(jī)械或炎癥刺激時(shí)，可以大量表達(dá)ST2。IL－33通過結(jié)合受體ST2后IL－33/ST2通路被激活后調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，可促使Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可激活多種免疫細(xì)胞，促使Th2細(xì)胞分泌IL－4、IL－5、IL－13等〔9，10〕。IL－33/ST2通路與心力衰竭的相互關(guān)系在既往的許多研究中已經(jīng)證實(shí)。IL－33/ST2信號(hào)通路參與了眾多炎癥反應(yīng)性疾病的發(fā)展過程，提示這種通路也有可能對(duì)AS的發(fā)生發(fā)展及冠心病的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用。本研究顯示IL－33 mRNA、IL－33蛋白、ST2 mRNA和ST2蛋白是PCI術(shù)后發(fā)生SR的危險(xiǎn)因素。IL－33和ST2表達(dá)水平升高可能導(dǎo)致PCI術(shù)后老年患者發(fā)生SR，因此IL－33/ST2信號(hào)通路可能參與PCI術(shù)后SR的發(fā)生。

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〔2014－12－16修回〕

(編輯苑云杰)

基金項(xiàng)目:廣西自然科學(xué)基金( No．0640201)

〔中圖分類號(hào)〕R541. 4

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202( 2016) 02-0312-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 026