申　薇　梁冰鋒秦金金　李秋穎　付雪蓮　程建新(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北　石家莊　0500)

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那可丁聯(lián)合順鉑對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及凋亡的影響

申薇梁冰鋒1秦金金李秋穎付雪蓮程建新
(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊050011)

〔摘要〕目的探討那可丁聯(lián)合順鉑對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖抑制和凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞;用四甲基耦氮唑藍(lán)( MTT)法檢測SKOV3細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測分析細(xì)胞的周期變化、凋亡率及細(xì)胞中S期激酶關(guān)聯(lián)蛋白2 ( Skp2)與成纖維細(xì)胞生長因子－2( FGF－2)的表達(dá)情況。結(jié)果在一定范圍內(nèi)，那可丁對SKOV3細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，且存在著濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)( P＜0．05)。聯(lián)合用藥組SKOV3細(xì)胞凋亡率〔( 36．45±3．06) %，( 39．56±4．91) %〕高于順鉑組〔( 28．25±3．40) %〕( P＜0．05) ;與對照組相比，SKOV3細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例減少( P＜0．05)，G2/M期細(xì)胞比例增加( P＜0．05) ;各用藥組SKOV3細(xì)胞中Skp2和FGF－2的表達(dá)水平均低于對照組( P＜0．05)，其中聯(lián)合用藥組又低于順鉑組( P＜0．05)。結(jié)論那可丁提高了順鉑對SKOV3細(xì)胞的敏感性，其與順鉑聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤作用。

〔關(guān)鍵詞〕卵巢腫瘤;那可丁;順鉑; S期激酶關(guān)聯(lián)蛋白2;成纖維細(xì)胞生長因子－2

1河北女子職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系

第一作者:申薇( 1980－)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事婦科腫瘤診治研究。

卵巢癌嚴(yán)重危害女性的生命健康〔1〕。目前，除手術(shù)治療外，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是治療卵巢癌的主要手段，然而由于化療藥物血液、神經(jīng)等方面毒副作用以及化療引起的多藥耐藥性，嚴(yán)重影響了藥物的化療效果和臨床療效，甚至出現(xiàn)化療失敗〔2～4〕。因此，有必要尋找新型、毒副作用低的化療輔助藥物用以改善鉑類藥物的耐藥性，提高卵巢癌患者的生存率并改善其生活質(zhì)量。那可丁是一種來自于鴉片的鄰苯二甲酸異喹啉生物堿，結(jié)構(gòu)與秋水仙堿相似，一直作為鎮(zhèn)咳藥使用。近年來，研究證實(shí)那可丁具有抗腫瘤活性，并且該藥物與紫杉醇、阿霉素等藥物具有協(xié)同抗腫瘤作用〔5，6〕。本研究檢測那可丁與順鉑聯(lián)用對細(xì)胞增殖、凋亡及S期激酶關(guān)聯(lián)蛋白2( Skp2)與成纖維細(xì)胞生長因子－2( FGF－2)表達(dá)的影響。

1材料與方法

1. 1細(xì)胞株、試劑和儀器人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。注射用順鉑購自山東齊魯制藥廠，那可丁、胰蛋白酶、碘化丙啶( PI)染液購自美國Sigma公司，PBS緩沖液、RPMI－1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，二甲基亞砜( DMSO)購自天津化學(xué)試劑廠，胎牛血清購自杭州四季青公司，四甲基耦氮唑藍(lán)( MTT)購自洛陽華美生物工程公司，Skp2和FGF－2兔抗人單克隆抗體購自美國Epitomics公司。流式細(xì)胞儀，Epics－XLⅡ型，美國Beckman Coulter公司;酶標(biāo)儀，HT2－125500型，鄭州博賽生物工程公司。

1. 2方法

1. 2. 1細(xì)胞的培養(yǎng)與分組將人卵巢癌SKOV3細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶內(nèi)單層傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為:只加生理鹽水的對照組;單用那可丁( 5、10、20、40、80、160 μmol/L)組;單用順鉑( 10 μg/ml)組;那可丁與順鉑聯(lián)合應(yīng)用(那可丁20 μmol/L +順鉑10 μg/ml，那可丁40 μmol/L +順鉑10 μg/ml)組。

1. 2. 2 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，用0．25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2．5× 104個(gè)/ ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μl/孔(含5×103個(gè)細(xì)胞)，每組設(shè)3個(gè)平行孔。細(xì)胞分別加藥培養(yǎng)24、48和72 h后，加入MTT( 5 mg/ml) 20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，加入DMSO( 200 μl/孔)，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀測其在490 nm波長處的吸光度( OD)值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率( %) = ( 1－實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1. 2. 3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡率取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用無菌冷PBS離心洗滌3次，輕輕振蕩后，加70%酒精固定，4℃保存過夜。PBS離心洗滌細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，取1 ml細(xì)胞懸液，向其中加入PI染液，使其終濃度達(dá)到50 μg/ml PI，4℃避光染色30 min后上流式細(xì)胞儀檢測。分別應(yīng)用Muticycle AV軟件和Expo ADC軟件對細(xì)胞周期的時(shí)相分布和細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。

1. 2. 4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用無菌冷PBS離心洗滌3次，輕輕振蕩后，加70%酒精固定，4℃保存過夜。用PBS離心洗滌細(xì)胞2次，沉淀細(xì)胞后溶于100 μl PBS，分別加入Skp2和FGF－2兔抗人單克隆抗體100 μl，避光靜置60 min，加入鼠抗兔二抗工作液100 μl，對照組只加二抗。避光靜置60 min，流式細(xì)胞儀檢測SKOV3細(xì)胞中蛋白的表達(dá)量，以平均熒光強(qiáng)度表示蛋白的含量。

1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13．0軟件行方差分析，兩兩組間比較采用LSD法。

2結(jié)果

2. 1那可丁對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的增殖抑制率總體呈增高趨勢( P＜0．05)，但那可丁劑量組中40、80、160 μmol/L組間比較無顯著差異( P＞0．05)。那可丁作用于SKOV3細(xì)胞24、48、72 h的IC50值分別為46．77、22．66、19．08 μmol/L，隨著作用時(shí)間的延長那可丁對SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)( P＜0．05)，見表1，表明那可丁對SKOV3細(xì)胞的抑制存在時(shí)間和濃度依賴效應(yīng)。

表1那可丁作用于SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率(±s，%，n=3)

表1那可丁作用于SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率(±s，%，n=3)

與5 μmol/L那可丁組比較: 1) P＜0．05;與10 μmol/L那可丁組比較: 2) P＜0．05;與20 μmol/L那可丁組比較: 3) P＜0．05

那可丁(μmol/L)　 24 h　48 h　72 h 5　11．73±11．71　 15．44±9．36　 17．60±8．21 10　17．11±14．13　 20．97±13．371)　26．46±12．051)20　32．03±15．30　 37．82±9．901) 2)　40．62±4．221) 2)40　 60．59±12．281) 2) 3)　76．51±9．341) 2) 3)　88．83±3．631) 2) 3)80　 61．55±7．861) 2) 3)　88．10±2．641) 2) 3)　92．22±1．341) 2) 3)160　 61．45±5．761) 2) 3)　89．10±2．061) 2) 3)　93．91±1．001) 2) 3)

2. 2那可丁、順鉑及聯(lián)合應(yīng)用對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響與對照組相比，各用藥組SKOV3細(xì)胞的凋亡率均顯著增加( P＜0．05)，其中聯(lián)合用藥組又明顯高于那可丁單藥組及順鉑組( P＜0．05)。那可丁單用時(shí)，高劑量組高于低劑量組( P＜0．05)，見表2，表明那可丁與順鉑有協(xié)同誘導(dǎo)凋亡作用。

2. 3那可丁、順鉑及聯(lián)合應(yīng)用對SKOV3細(xì)胞周期的影響與對照組比，那可丁單藥組和聯(lián)合用藥組G0/G1期細(xì)胞比例減少，G2/M期細(xì)胞比例增加( P＜0．05)。隨著那可丁濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸減少，G2/M期細(xì)胞比例逐漸升高，那可丁單劑量組和聯(lián)合用藥組內(nèi)比較有顯著差異( P＜0．05)。那可丁單藥組和聯(lián)合用藥組G2/M期細(xì)胞比例顯著高于順鉑組( P＜0．05)，表明那可丁對SKOV3細(xì)胞具有G2/M期阻滯作用。見表2。

2. 4那可丁、順鉑及聯(lián)合應(yīng)用對SKOV3細(xì)胞Skp2和FGF－2蛋白表達(dá)的影響與對照組相比，各用藥組Skp2和FGF－2蛋白表達(dá)均降低( P＜0．05)。那可丁單用時(shí)，高劑量組Skp2和FGF－2蛋白表達(dá)低于低劑量組( P＜0．05)。聯(lián)合用藥組Skp2和FGF－2蛋白表達(dá)顯著低于順鉑組( P＜0．05)，見表3。

表2卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡及周期的變化(±s，%，n=3)

表2卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡及周期的變化(±s，%，n=3)

與對照組比較: 1) P＜0．05;與順鉑組比較: 2) P＜0．01;與20 μmol/L那可丁組比較: 3) P＜0．05;與20 μmol/L那可丁+順鉑組比較: 4) P＜0．05

組別細(xì)胞周期G0/G1期　S期　G2/M期　細(xì)胞凋亡率對照組　61．77±4．97　21．36±3．61　16．87±2．65　2．87±0．94順鉑組　50．12±10．76　48．03±10．77　1．85±0．25　28．25±3．401)20 μmol/L那可丁組　50．73±2．661)　26．67±2．78　22．53±2．531) 2)　10．59±2．991)40 μmol/L那可丁組　31．77±9．381) 3)　36．27±10．87　32．00±1．801) 2) 3)　19．67±4．011) 3)20 μmol/L那可丁+順鉑組　27．47±5．771)　35．70±11．44　37．17±6．661) 2)　36．45±3．061) 2)40 μmol/L那可丁+順鉑組　6．55±4．591) 4)　38．37±6．95　55．10±6．361) 2) 4)　39．56±4．911) 2)

表3卵巢癌SKOV3細(xì)胞中Skp2和FGF-2蛋白的表達(dá)(±s，n=3)

表3卵巢癌SKOV3細(xì)胞中Skp2和FGF-2蛋白的表達(dá)(±s，n=3)

與對照組比較: 1) P＜0．05;與20 μmol/L那可丁組比較: 2) P＜0．05;與順鉑組比較: 3) P＜0．05

組別　Skp2　FGF－2對照組　167．12±7．01　 287．05±10．55順鉑組　141．58±8．541)　260．57±9．231)20 μmol/L那可丁組　151．56±6．191)　268．78±7．561)40 μmol/L那可丁組　134．12±7．331) 2)　250．72±5．211) 2)20 μmol/L那可丁+順鉑組　125．45±3．721) 3)　242．25±4．931) 3)40 μmol/L那可丁+順鉑組　113．75±7．211) 3)　227．62±6．151) 3)

3討論

作為一種微管抑制劑，那可丁通過抑制微管動態(tài)不穩(wěn)定性、干擾腫瘤細(xì)胞有絲分裂來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖〔7〕，從而達(dá)到抗腫瘤的作用。那可丁不僅可以抑制非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多種癌細(xì)胞的增殖，而且對一些紫杉醇耐藥細(xì)胞也有較好的抑制作用，其作用機(jī)制目前尚不清楚，可能與抑制G2/M期有絲分裂及激活c－jun－氨基末端激酶( c－JNK)、p21參與、核轉(zhuǎn)錄因子( NF)－κB信號通路調(diào)節(jié)、半胱天冬氨酸酶( caspase)級聯(lián)反應(yīng)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血?。?( Bcl－2)下調(diào)等途徑有關(guān)。相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)表明，采用口服、注射等不同的給藥方式，那可丁對心、胸腺、十二指腸、腎、血液和骨髓等器官或組織沒有明顯的毒副作用，且與聯(lián)合藥品不產(chǎn)生交叉耐藥〔8，9〕。本研究結(jié)果顯示，那可丁可明顯抑制SKOV3細(xì)胞增殖，并呈劑量和時(shí)間的依賴性。那可丁與順鉑聯(lián)用可將SKOV3細(xì)胞阻滯于G2/M期，并增加SKOV3細(xì)胞的凋亡率，表明那可丁與順鉑聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤作用。

耐藥的產(chǎn)生與腫瘤細(xì)胞一些蛋白的高表達(dá)密切相關(guān)，Skp2 與FGF－2均是耐藥相關(guān)的蛋白，與腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Skp2是蛋白降解過程中特異的識別底物，介導(dǎo)降解其泛素化，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞從細(xì)胞周期的G0/G1期進(jìn)入到S期。它的過表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞不斷的進(jìn)行細(xì)胞周期，使本應(yīng)生理性凋亡的細(xì)胞不停地進(jìn)行分裂，促進(jìn)了基因的復(fù)制和細(xì)胞增殖〔10，11〕。FGF－2儲存于腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞中，在細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換中誘導(dǎo)并促進(jìn)G0/G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，促使纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的快速增殖與分化。FGF與受體結(jié)合形成的二聚體發(fā)生磷酸化，可激活自身內(nèi)在的酪氨酸蛋白激酶活性，活化磷脂酶C－蛋白激酶C( PLC－PKC)、磷脂酰肌醇3激酶－蛋白激酶B( PI3K－PKB)等多種不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)新生血管生成和正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等多種生物學(xué)行為〔12〕。本研究結(jié)果顯示，那可丁可明顯降低SKOV3細(xì)胞中Skp2和FGF－2蛋白的表達(dá)量，提示那可丁可能通過抑制腫瘤組織中Skp2和FGF－2蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡?？傊?，那可丁能抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的生長，且與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞的生長抑制具有協(xié)同作用，提示那可丁可考慮作為化療藥物順鉑的輔助用藥，為改善卵巢癌患者的化療效果，尋求新的臨床治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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〔2014－06－15修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

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·心、腦血管及代謝性疾病·

〔中圖分類號〕R737. 31

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202( 2016) 02-0303-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 023