袁帶秀舒麗霞　黃　蓉　(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南　吉首　46000)

?

杜仲黃酮對(duì)H22小鼠的抑瘤作用及其機(jī)制

袁帶秀1舒麗霞黃蓉(吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南吉首416000)

1吉首大學(xué)植物資源與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

第一作者:袁帶秀( 1975－)，女，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事民族藥用植物生理生化研究。

〔摘要〕目的研究杜仲黃酮體內(nèi)抗腫瘤作用，探討其可能作用機(jī)制。方法將小鼠肝癌H22細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)并于昆明小鼠腹腔內(nèi)傳代后，無菌接種于小鼠皮下，建立荷瘤小鼠模型。采取不同劑量杜仲黃酮( 200、100、50 mg/kg) ig給藥，每天1次，連續(xù)12 d; CTX組隔日ip給藥，給藥6次，計(jì)算抑瘤率、脾臟指數(shù);分離血清，ELSA法檢測(cè)血清腫瘤壞死因子( TNF)－α和白細(xì)胞介素( IL)－2，比色法檢測(cè)血清總抗氧化活力( T－AOC)和丙二醛( MDA)水平。結(jié)果與模型組比較，杜仲黃酮能顯著降低移植瘤瘤質(zhì)量( P＜0．05)，明顯升高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)( P＜0．05)，升高血清IL－2、TAOC水平，降低TNF－α、MDA水平。結(jié)論杜仲黃酮對(duì)H22移植瘤有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)IL－2和TNF－α等細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)荷瘤小鼠免疫功能，提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕杜仲;黃酮; H22;抗腫瘤;抗氧化

杜仲具補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血壓、安胎等諸多功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，杜仲中含有黃酮等多種生物活性物質(zhì)，具有抗癌、抗衰老、降血壓、抗菌消炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫等多種藥理作用〔1〕。本研究探討杜仲黃酮體內(nèi)抑瘤作用及可能機(jī)制。

1材料與方法

1. 1材料雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，清潔級(jí)，合格證號(hào): SCXK(湘) 2011－0003，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供;小鼠H22肝癌細(xì)胞株由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理系惠贈(zèng)。注射用環(huán)磷酰胺( CTX)購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;小鼠白細(xì)胞介素( IL)－2、腫瘤壞死因子( TNF)－αELSA試劑盒購(gòu)自上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;蛋白質(zhì)試劑盒、丙二醛試劑盒( MDA)和總體抗氧化活力( T－AOC)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所。杜仲葉采自吉首大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院教學(xué)樓旁邊，由該院陳功錫教授鑒定。

1. 2方法

1. 2. 1杜仲黃酮的制備將杜仲葉烘干，粉碎機(jī)將其粉碎后用65%乙醇超聲提取，提取液過濾;所得濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮，再在濃縮液中加入石油醚進(jìn)行除脂分液，把分液后的濾液下層倒入大孔樹脂，靜態(tài)吸附2 h以上，再用去離子水洗脫，90%左右乙醇解析2 h以上;解析液再進(jìn)行濃縮;用異丙醇洗2次，過濾，將濾液濃縮;加入甲醇除雜，最后得棕黃色的杜仲總黃酮。以蘆丁做對(duì)照，紫外分光光度計(jì)測(cè)得杜仲總黃酮的純度為83．61%。

1. 2. 2 H22肝癌移植瘤小鼠模型的建立常規(guī)方法復(fù)蘇H22小鼠肝癌細(xì)胞，取0．2 ml細(xì)胞懸液注射到雄性昆明小鼠腹腔內(nèi)，連續(xù)傳兩代。無菌操作取第2代腹水，用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，于昆明小鼠右股部行皮下無菌接種，接種量為每只0．2 ml。

1. 2. 3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理接種24 h后稱重分組，將小鼠隨機(jī)分為杜仲黃酮高、中、低劑量( 200、100、50 mg/kg)組和CTX組;每組10只。杜仲黃酮各給藥組ig給藥，每日1次，共12次; CTX組按20 mg/kg劑量隔日ip給藥1次，共6次;模型組則以生理鹽水替代藥物ig給以小鼠藥。各組動(dòng)物給藥第12天停藥，禁食不禁水16 h后處死。另取10只正常小鼠設(shè)為對(duì)照組，每天ig生理鹽水，共12 d。

1. 2. 4小鼠H22肝癌皮下移植瘤的抑瘤率、免疫器官指數(shù)以及血清相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定分別稱取小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。并稱取脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)。眼眶取血，分離血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA)法檢測(cè)血清TNF－α和IL－2，比色法檢測(cè)血清T－AOC和MDA水平。抑瘤率= (模型組瘤質(zhì)量－藥物組瘤質(zhì)量) /模型組瘤質(zhì)量;脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2. 1對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響杜仲黃酮對(duì)昆明小鼠H22實(shí)體瘤的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，其抗腫瘤效應(yīng)呈劑量依賴性，高劑量組的抑瘤率低于CTX組;與模型組比較，CTX組和杜仲黃酮高、中劑量組荷瘤小鼠瘤質(zhì)量顯著減輕( P＜0．05)，而杜仲黃酮高、中、低各劑量間無顯著差異( P＞0．05)。見表1。

表1杜仲黃酮對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用(±s，n=10)

表1杜仲黃酮對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用(±s，n=10)

與模型組比較: 1) P＜0．05

組別　　瘤質(zhì)量( g)　　抑瘤率( %)模型組　1．03±0．19　?。瑿TX組　0．41±0．051)　60．20杜仲黃酮低劑量組　0．66±0．12　35．90杜仲黃酮低中量組　0．57±0．121)　44．70杜仲黃酮高劑量組　0．54±0．121)　47．60

2. 2對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量及脾臟指數(shù)的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诙胖冱S酮高劑量組小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)與模型組比較差異顯著( P＜0．05)。杜仲黃酮高劑量組小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)與CTX組比較差異顯著( P＜0．05)。杜仲黃酮中劑量組脾臟指數(shù)與CTX組比較差異顯著( P＜0．05)。但杜仲黃酮各劑量組小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)之間比較差異不顯著( P＞0．05)。CTX組小鼠脾臟指數(shù)低于模型組，也低于杜仲黃酮各組，但差異不顯著( P＞0．05)。見表2。

2. 3對(duì)荷瘤小鼠血清TNF－α和IL－2水平的影響與對(duì)照組比較，模型組、CTX組及杜仲黃酮各劑量組小鼠TNF－α水平顯著升高( P＜0．05)，IL－2水平顯著降低( P＜0．05)。與模型組比較，CTX組和杜仲黃酮高劑量組小鼠TNF－α水平顯著降低( P＜0．05)，而杜仲黃酮高、中劑量組小鼠IL－2水平顯著升高( P＜0．05)。見表3。

2. 4對(duì)荷瘤小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清MDA水平顯著升高( P＜0．05)，但T－AOC水平變化差異不顯著。與模型組比較，CTX組小鼠血清MDA水平顯著降低( P＜0．05)，杜仲黃酮高、低劑量組小鼠血清T－AOC水平顯著升高( P＜0．05) ;杜仲黃酮高、低劑量組小鼠血清T－AOC也明顯高于CTX組( P＜0．05) ;杜仲黃酮高劑量組T－AOC與其低、中劑量組比較差異顯著( P＜0．05)。見表3。

表2杜仲黃酮對(duì)H22荷瘤小鼠的體質(zhì)量及脾臟指數(shù)的影響(±s，n=10)

表2杜仲黃酮對(duì)H22荷瘤小鼠的體質(zhì)量及脾臟指數(shù)的影響(±s，n=10)

與模型組比較: 1) P＜0．05;與CTX組比較: 2) P＜0．05

組別　　體質(zhì)量( g)實(shí)驗(yàn)前　　實(shí)驗(yàn)后脾臟指數(shù)( mg/g)模型組　19．90±0．16　 30．77±2．68　 3．78±0．49 CTX組　20．13±0．05　 30．53±1．96　 3．10±0．31杜仲黃酮低劑量組　20．00±0．17　 31．34±1．94　 4．23±0．31杜仲黃酮中劑量組　19．94±0．07　 32．44±2．15　 4．90±0．522)杜仲黃酮高劑量組　20．11±0．20　 33．28±2．001) 2)5．22±0．611) 2)

表3杜仲黃酮對(duì)H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平和抗氧化指標(biāo)的影響(±s，n=10)

表3杜仲黃酮對(duì)H22荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平和抗氧化指標(biāo)的影響(±s，n=10)

與對(duì)照組比較: 1) P＜0．05;與模型組比較: 2) P＜0．05;與CTX組比較: 3) P＜0．05;與杜仲黃酮低、中劑量組比較: 4) P＜0．05

組別　TNF－α( ng/ml)　IL－2( ng/ml)　T－AOC( U/ml)　MDA( nmol/ml)對(duì)照組　0．50±0．01　1．36±0．01　8．81±0．77　7．38±0．45模型組　0．79±0．041)　0．98±0．021)　8．19±0．58　12．58±0．801)CTX組　0．61±0．021) 2)　1．08±0．071)　7．69±0．79　9．95±0．251) 2)杜仲黃酮低劑量組　0．73±0．031) 3)　1．02±0．041)　11．76±1．091) 2) 3)　11．24±0．521)杜仲黃酮中劑量組　0．78±0．041) 3)　1．21±0．041) 2)　9．20±0．92　12．09±0．631) 3)杜仲黃酮高劑量組　0．67±0．031) 2) 4)　1．17±0．061) 2) 4)　13．29±1．111) 2) 3) 4)　11．54±0．711)

3討論

黃酮類化合物具有抑菌消炎、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌等諸多生理活性〔2〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50、100、200 mg/kg劑量的杜仲黃酮ig給藥12 d，均能抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，雖然其抑瘤作用不如CTX( 60%)強(qiáng)，但能減少因化療所致荷瘤小鼠體質(zhì)量減輕和免疫力下降等不良反應(yīng)，能夠提高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)，增加體質(zhì)量。

IL－2是由抗原活化的T細(xì)胞分泌的一種重要的淋巴因子，在機(jī)體的免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)中起重要作用〔3〕。IL－2的含量與細(xì)胞的免疫功能密切相關(guān)，因此，IL－2降低是腫瘤患者細(xì)胞免疫功能受損的一項(xiàng)重要標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌H22移植瘤小鼠血清IL－2水平較正常小鼠顯著降低，而杜仲黃酮給藥后荷瘤小鼠血清IL－2水平明顯升高。說明杜仲黃酮可改善荷瘤小鼠免疫指標(biāo)，提高機(jī)體抗腫瘤能力。

TNF－α是參與機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子〔4，5〕，在機(jī)體抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用。一方面，TNF－α可通過抑制腫瘤血管生成等間接途徑影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，另一方面，還可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡〔6〕。本研究結(jié)果表明，肝癌H22移植瘤小鼠血清TNF－α水平較正常小鼠升高，而杜仲黃酮給藥后荷瘤小鼠血清TNF－α水平卻降低，趨向于正常水平，說明杜仲黃酮抗腫瘤作用時(shí)，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)目的減少，引起腫瘤細(xì)胞分泌到循環(huán)系統(tǒng)中TNF－α等細(xì)胞因子水平相應(yīng)降低。因此，TNF－α變化可能反映了杜仲黃酮抗腫瘤作用的藥用效果，至于TNF－α變化本身是否參與了其抗腫瘤的病理生理過程，還需進(jìn)一步的研究探討。

研究已證明自由基與人類腫瘤的發(fā)生，發(fā)展及防治密切相關(guān)。MDA是脂褐質(zhì)形成過程中的中間產(chǎn)物，其含量可間接反映機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生情況和細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度;而T－AOC反映的是機(jī)體總的抗氧化能力，它的下降表明機(jī)體整體的抗氧化能力降低了。本研究結(jié)果顯示，杜仲黃酮能降低H22荷瘤小鼠血清MDA水平，提高T－AOC活力，表明杜仲黃酮抗腫瘤作用還可能與其抗氧化作用有關(guān)。

綜上，杜仲黃酮對(duì)H22移植瘤有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與其增強(qiáng)荷瘤小鼠免疫功能，調(diào)節(jié)IL－2和TNF－α等細(xì)胞因子的分泌，提高機(jī)體抗氧化能力有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

1吳春，胡小妹，陳林林，等．杜仲黃酮的提取及抗氧化活性研究〔J〕．哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004; 20( 5) : 509－11．

2唐栩，許東暉，梅雪婷，等．126種黃酮類天然活性成分的藥理研究進(jìn)展〔J〕．中藥材，2003; 26( 1) : 46－54．

3艾金霞，崔煥波．SBHL對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及免疫功能的影響〔J〕．中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010; 14( 6) : 828－30．

4唐秀能，張志偉，黃仁彬，等．柿葉水提物抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究〔J〕．中國(guó)藥師，2009; 12( 1) : 31－3．

5肖順漢，劉明華，鐘琳，等．克癌新對(duì)荷瘤小鼠IL－2、IL－6、IL－12和TNF－α水平的影響〔J〕．中藥藥理與臨床，2008; 24( 2) : 82－4．

6李俊，傅恩賜，許愛華，等．GBEE對(duì)荷瘤小鼠IL－2、IL－12、TNF－α及TGF－α水平的影響〔J〕．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2012; 28( 5) : 415－7．

〔2014－05－17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

〔中圖分類號(hào)〕R285. 5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202( 2016) 02-0291-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 016

基金項(xiàng)目:湖南省教育廳科研項(xiàng)目( No．12C0301) ;植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助( No．13jdzb095)