葛文亮， 王文彬， 胥傳來(lái)

（1.無(wú)錫市第二人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫214002；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

基于磁性納米粒子的糧油制品真?zhèn)舞b別技術(shù)研究

葛文亮1， 王文彬2， 胥傳來(lái)2

（1.無(wú)錫市第二人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫214002；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

通過(guò)PCR檢測(cè)食用油中內(nèi)源性DNA是鑒定食用植物油品種真實(shí)屬性，檢測(cè)食用油摻假的一種有效方法。然而由于精煉的食用油中DNA含量極低，如何有效富集食用油中的DNA是實(shí)現(xiàn)PCR鑒別糧油的關(guān)鍵。因此，作者研究了磁珠法富集食用油中的DNA并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)芝麻油、菜籽油、稻米油的內(nèi)源基因。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)5次乳化后和磁珠進(jìn)一步富集水相中的DNA，實(shí)時(shí)熒光PCR成功檢測(cè)到了食用油中的內(nèi)源性基因，瓊脂糖凝膠電泳分析進(jìn)一步證明實(shí)現(xiàn)了上述3種食用植物油的定性鑒定。

磁珠；PCR；食用油；DNA提取

食用油脂是我國(guó)重要的糧油產(chǎn)品，也是居民不可缺少的營(yíng)養(yǎng)品之一[1]。我國(guó)的食用植物油主要有大豆油、菜籽油、花生油、芝麻油、稻米油、棕櫚油、橄欖油、茶油等。由于價(jià)格差異，近年來(lái)市場(chǎng)上食用油中如芝麻油、稻米油中常常出現(xiàn)摻假甚至造假的現(xiàn)象，給市場(chǎng)環(huán)境和消費(fèi)者帶來(lái)極大的負(fù)面影響。因此，建立主要糧油品種鑒定方法，實(shí)現(xiàn)摻假檢測(cè)是十分必要的。

目前，氣相色譜法[2-4]、紫外分光光度法[5]、紅外光譜法[6]、拉曼光譜法[7]以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）[8-9]已被研究用于糧油摻假的檢測(cè)。在這些方法中，PCR方法相對(duì)簡(jiǎn)便而且根據(jù)品種的保守基因不同設(shè)計(jì)引物，可以適用于所有食用油的鑒別[10]。而由于DNA本身易溶于水，經(jīng)過(guò)水化、水洗等精煉過(guò)程后食用油中DNA的殘留量很低[11]。因此，有效提取、富集食用油中的DNA是影響PCR成功鑒別糧油的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的DNA提取方法無(wú)法將食用油中低含量的DNA片段提取并用PCR檢測(cè)到，而磁性納米材料用于提取DNA的優(yōu)勢(shì)主要是自身粒徑較小、比表面積大、分散性好，與DNA結(jié)合效率高，同時(shí)具有超順磁性，操作簡(jiǎn)便、迅速[12-13]。目前磁珠多用于提取微生物等的基因組DNA，而用于提取糧油樣品DNA的研究比較少。作者以多次乳化和磁珠富集為基礎(chǔ)建立了糧油中DNA提取方法并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR成功鑒定了芝麻油、菜籽油、稻米油以及調(diào)和油中的這幾種糧油成分，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行了進(jìn)一步確認(rèn)了檢測(cè)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

芝麻油、菜籽油、稻米油以及調(diào)和油：市售（見(jiàn)表1）；乙二胺四乙酸（EDTA）：購(gòu)于Sigma公司；氯仿（AR），聚乙二醇 20000（PEG20000），無(wú)水乙醇（AR）：購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)公司；表面羧基修飾的磁珠（500 nm）：作者所在實(shí)驗(yàn)室合成；實(shí)時(shí)熒光PCR超混液：諾唯贊公司產(chǎn)品；檢測(cè)芝麻油、菜籽油、稻米油內(nèi)源基因所用引物序列：生工生物有限公司合成。

1.2 主要儀器

CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)系統(tǒng)：Bio-Rad公司產(chǎn)品；恒溫烘箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；搖床：江蘇金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司產(chǎn)品；Heal Force Neofuge 18R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海力新儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 磁性納米材料 表面帶COOH磁珠的制備是采用溶劑熱法加入檸檬酸鈉一步法制備[14-15]。該制備方法步驟簡(jiǎn)單，合成的粒子分散性好，較為穩(wěn)定。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法建立及優(yōu)化 芝麻[16]、菜籽[17-18]、稻米[16]的內(nèi)源基因?qū)?yīng)的引物序列參考文獻(xiàn)獲得并由上海生工生物有限公司合成，并列于表2。芝麻、菜籽、稻米用液氮在陶瓷研缽中研磨，然后采用天根（北京）植物基因組DNA提取試劑盒提取種子中的基因組DNA。將提取的基因組DNA用滅菌的超純水進(jìn)行3倍梯度稀釋后作為模板DNA。RT-PCR采用 20 μL體系，即 10 μL 2X 的VazymeTMSuperMix，0.4 μL 10 μmol/L的正向引物，0.4 μL 10 μmol/L的反向引物，模板DNA 2 μL，7.2 μL的滅菌超純水。之后用移液槍混勻樣品并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確證。由于采用的RT-PCR超混液中已含有適宜濃度的Taq DNA酶、dNTPs、MgCl2、熒光染料、反應(yīng)緩沖液等，影響實(shí)驗(yàn)效果的主要因素即為引物濃度和PCR擴(kuò)增條件（退火溫度）。因此，實(shí)驗(yàn)研究了引物濃度，退火溫度對(duì)RT-PCR的影響。

1.3.3 磁珠法提取食用植物油中DNA 取15 mL pH 8.5的 50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA到50 mL離心管中，加入30 mL食用油樣品，充分震蕩后置于搖床上，室溫震蕩條件下乳化1 h。8 000 r/min，10 min離心，去除上層油脂并添加30 mL食用油樣品。重復(fù)步驟1和2直至乳化150 mL食用油樣品。如離心后出現(xiàn)水油乳化層，可通過(guò)65℃溫浴破乳，吸去剩余乳化層并添加pH 8.5的50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA使得水相體積保持在15 mL。向乳化后的水相中添加等體積的氯仿，充分混勻后8 000 r/min離心10 min保留下層水相。該步驟可重復(fù)一次以保證充分去除水相中的食用油，避免磁珠發(fā)生聚集降低產(chǎn)率。1 mL水相中加入550 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%PEG和6 mol/L NaCl溶液，100 μL 10%的SDS，30 μL磁珠，70℃水浴15 min。磁分離去除上清，并用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌磁珠3次，37℃烘箱15 min烘干后加入50 μL pH 7.3的10 mmol/Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，65℃水浴15 min。磁分離，吸取上清即為提取的糧油樣品DNA。研究所用磁珠為粒徑在400~500 nm，表面修飾的Fe3O4磁性材料，與市售磁珠相比分散性，磁相應(yīng)性更好，-COOH修飾的磁珠比-OH、-NH2修飾的磁珠相比提取效果更好。針對(duì)目前糧油DNA提取樣品量大、提取效率低的特點(diǎn)，首先采用轉(zhuǎn)相的方法將油中殘留DNA富集到水相，再利用磁珠超順磁性和快速、高效富集DNA的特點(diǎn)從較少糧油樣本中成功提取了DNA，方便后續(xù)采用PCR手段檢測(cè)糧油種屬特性、轉(zhuǎn)基因等。

1.3.4 糧油內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立 磁珠提取食用油中DNA后參考1.3.1中的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻、菜籽、稻米種子內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)方法建立及優(yōu)化

提取的種子基因組DNA經(jīng)微量紫外（Thermo scientific，上海）測(cè)定提取DNA的A260nm/A280nm均在1.7~1.9之間，質(zhì)量濃度在0.66~1.2 μg/L之間，滿足實(shí)驗(yàn)需要。實(shí)驗(yàn)采用的靶標(biāo)基因2S Albumin、SPS、PE3-PEPcase分別是芝麻、稻米、菜籽的內(nèi)源基因，具有種屬特異性，選用這些靶標(biāo)基因和對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)可以很好的區(qū)分不同糧油作物的品種，從而提高糧油品種鑒定的特異性和準(zhǔn)確性。引物濃度的優(yōu)化說(shuō)明400 nmol/L/L時(shí)容易出現(xiàn)引物二聚體的情況；引物濃度在200 nmol/L/L時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度適中，并可以減少引物二聚體的影響；引物濃度在100 nmol/L/L時(shí)熒光強(qiáng)度顯著下降至1 000左右。因此RT-PCR體系中最終使用的引物濃度為200 nmol/L/L。退火溫度對(duì)于擴(kuò)增效率和減少引物二聚體影響較大，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)于芝麻基因組DNA擴(kuò)增，60℃時(shí)RT-PCR效率較高。但對(duì)于稻米和油菜籽基因組DNA擴(kuò)增，退火溫度為55℃時(shí)RT-PCR擴(kuò)增效率比58℃和60℃時(shí)高。優(yōu)化后芝麻、菜籽、稻米種子內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR的擴(kuò)增條件見(jiàn)表3。

優(yōu)化后芝麻、菜籽、稻米種子內(nèi)源基因RT-PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線如圖1所示。芝麻內(nèi)源基因2S Albumin RT-PCR擴(kuò)增在33個(gè)循環(huán)以后的擴(kuò)增梯度較差，產(chǎn)物的解鏈溫度為81.5℃。大米內(nèi)源基因SPS RT-PCR擴(kuò)增在36個(gè)循環(huán)以后的擴(kuò)增梯度較差，產(chǎn)物的解鏈溫度為81℃。油菜種子內(nèi)源基因PE3-PEPcase RT-PCR擴(kuò)增在30個(gè)循環(huán)以后的擴(kuò)增梯度較差，產(chǎn)物的解鏈溫度為83℃。單一的溶解溫度說(shuō)明擴(kuò)增的特異性較好，引物二聚體影響較小。

瓊脂糖凝膠電泳（圖2）分析實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物表明RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，擴(kuò)增產(chǎn)量隨原始基因組濃度（自左向右）降低而降低；芝麻內(nèi)源基因2S Albumin擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量在75 bp左右，與文獻(xiàn)報(bào)道66 bp一致[16]。大米內(nèi)源SPS基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量在75~100 bp之間，與文獻(xiàn)報(bào)道81 bp一致[16]。油菜種子內(nèi)源PE3-PEPcase基因擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量在100~150 bp之間。產(chǎn)物長(zhǎng)度與文獻(xiàn)報(bào)道121 bp一致[17-18]。因此，芝麻、稻米、菜籽種子內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系成功建立，可以用于芝麻油、稻米油、菜籽油中內(nèi)源基因的擴(kuò)增。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定純芝麻油、菜籽油、稻米油糧油品種

純芝麻油、菜籽油、稻米油樣品均先采用磁珠法進(jìn)行提取并用于RT-PCR檢測(cè)。擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度（圖3）以及瓊脂糖凝膠電泳（圖4）顯示檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)種子基因組擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度和片段大小保持一致，進(jìn)而說(shuō)明測(cè)試的3種芝麻油、3種菜籽油、3種稻米油可以成功擴(kuò)增出芝麻油、油菜籽、大米相應(yīng)的內(nèi)源基因。由于購(gòu)買(mǎi)的食用油既有壓榨工藝也有溶劑浸出，說(shuō)明不同工藝下的純芝麻油、菜籽油、稻米油中DNA均可以用已建立的磁珠法提取出來(lái)，并實(shí)現(xiàn)這3種食用植物油的品種的鑒定。

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定調(diào)和油中芝麻油、菜籽油、稻米油成分

為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法可以鑒定糧油品種真實(shí)性，3種調(diào)和油糧油樣品均先采用磁珠法進(jìn)行提取并用于RT-PCR檢測(cè)。擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度（圖5）以及瓊脂糖凝膠電泳（圖6）顯示3種調(diào)和油中均可以檢測(cè)到芝麻內(nèi)源基因，與商品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)一致；僅福臨門(mén)五谷調(diào)和油可以檢測(cè)到大米內(nèi)源基因，與商品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)一致（金龍魚(yú)調(diào)和油和香滿園調(diào)和油成分標(biāo)識(shí)中無(wú)稻米油成分）；3種調(diào)和油中均可以檢測(cè)到油菜內(nèi)源基因，其中金龍魚(yú)調(diào)和油和福臨門(mén)調(diào)和油與商品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)一致，香滿園調(diào)和油中標(biāo)識(shí)未含有菜籽油但檢出菜籽油內(nèi)源基因，具體原因需要進(jìn)一步確認(rèn)。所有檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)種子基因組擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度和片段大小保持一致，表明測(cè)試的3種調(diào)和油中芝麻油、菜籽油、稻米油成分的內(nèi)源基因可以成功擴(kuò)增出，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)于調(diào)和油中糧油品種的鑒定。

3 結(jié)語(yǔ)

PCR方法鑒定糧油品種和摻假，具有適應(yīng)性強(qiáng)、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)。食用油經(jīng)過(guò)壓榨、高溫或者化學(xué)溶劑處理，基因組DNA含量極低且多分解為小片段，普通的基因組DNA提取方法無(wú)法提取糧油樣品中的DNA。針對(duì)這些特點(diǎn)，作者首先通過(guò)乳化將油相中DNA轉(zhuǎn)移到水相中，再利用磁納米粒子的超順磁性以及其在高鹽濃度下可以特異性吸附DNA的特點(diǎn)進(jìn)一步富集水相中DNA。該方法具有成本低、DNA富集效率高、樣本量小、簡(jiǎn)便、適合高通量的特點(diǎn)。研究結(jié)果表明，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，市場(chǎng)上純芝麻油、菜籽油、稻米油以及調(diào)和油中的這些成分均可檢出，該方法為糧油品種真實(shí)性表征和摻假檢測(cè)提供了有效手段。

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科技信息

加拿大批準(zhǔn)廣布肉毒桿菌M35作為抑菌防腐劑

據(jù)加拿大衛(wèi)生部消息，10月13日加拿大衛(wèi)生部發(fā)布公告，批準(zhǔn)廣布肉毒桿菌（Carnobacterium divergens）M35作為防腐劑用于部分食品。

據(jù)了解，加拿大衛(wèi)生部收到一項(xiàng)食品添加劑申請(qǐng)，請(qǐng)求采用廣布肉毒桿菌M35抑制即食冷熏三文魚(yú)切片與即食冷熏鱒魚(yú)切片當(dāng)中的李斯特菌。

經(jīng)過(guò)相應(yīng)評(píng)估，加拿大衛(wèi)生部認(rèn)為，廣布肉毒桿菌M35作為李斯特菌抑制劑是安全的。加拿大衛(wèi)生部于6月7日就此發(fā)布提案，并設(shè)定了75天的評(píng)議期。在評(píng)議期內(nèi)，加拿大衛(wèi)生部收到一項(xiàng)意見(jiàn)，然而并未收到與加拿大衛(wèi)生部安全性評(píng)估不一致的資料。

因此，加拿大衛(wèi)生部批準(zhǔn)廣布肉毒桿菌M35作為抑制李斯特菌的防腐劑，用于即食冷熏三文魚(yú)切片與即食冷熏鱒魚(yú)切片。

［信息來(lái)源］食品伙伴網(wǎng).加拿大批準(zhǔn)廣布肉毒桿菌M35作為抑菌防腐劑[EB/OL].(2016-10-14).http://news. foodmate.net/2016/10/399565.html

Identification of Authenticity of Sesame Oil,Rapeseed Oil and Rice Oil Based on the Magnetic Beads

GE Wenliang1， WANG Wenbin2， XU Chuanlai2
（1.Wuxi No.2 People's Hospital，Wuxi 214002，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The detection of endogenous genes using PCR is one of the effective methods to detect the variety of edible vegetable oil and identify their adulteration.Due to the extremely low content of DNA in the refined oil,the effective extraction method to concentrate DNA is the crucial challenge concerning the authenticity identification based on PCR.The DNA concentrated method based on magnetic beads was established in this paper.DNA was extracted using this method from the edible oil including sesame oil,rapeseed oil and rice oil.Their endogenous genes was then characterized by real-time fluorescence PCR.The endogenous genes were successfully detected using concentrated DNA extracted after five emulsifications and further by magnetic beads.The results were further confirmed by the agarose gel electrophoresis.The qualitative identification of edible oil using magnetic beads was achieved.

Magnetic beads,PCR,edible vegetable oil,DNA extraction

TS 225.1；TS 207.3

A

1673—1689（2016）11—1224—08

2015-02-16

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAC01B07）。

葛文亮（1965—），男，江蘇無(wú)錫人，主任技師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與免疫學(xué)研究。E-mail：2324999898@qq.com