楊乾栩, 和智君, 楊 蕾, 張?zhí)鞐潱?曽曉鷹, 王保興, 楊 清*
(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心,云南 昆明 650231;2.昆明理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明650500)
1.2.3 緩沖溶液配置 精確稱量檸檬酸19.21 g,檸檬酸鈉29.41 g,分別加入1 L純凈水,即配置為0.1 mol/L緩沖溶液。量取0.7、3.2、4.6、5.7、6.6、8.0、9.3和10.0 mL的檸檬酸,并分別加入9.3、6.8、5.4、4.3、3.4、2.0、0.7和0.0 mL的檸檬酸鈉中,即配置得pH分別為6.6、5.4、4.8、4.4、4.0、3.4、3.0、2.0的檸檬酸-檸檬酸納緩沖溶液。
1.2.4 單一酶作用參數(shù)考察 稱量果膠酶、酸性蛋白酶、纖維素酶各960 mg,分別溶解于60 mL緩沖溶液中為母液,其中果膠酶和酸性蛋白酶分別溶于pH3.4的緩沖溶液,纖維素酶溶于pH 4.8的緩沖溶液;將各母液依次二倍稀釋為16,8,4,2,0.4 mg/ mL。取30 mL酶液,噴灑于120 g煙梗上,此時(shí)每個(gè)煙梗中酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.4%,0.2%,0.1%,0.05%,0.01%;將處理后的煙梗裝密封袋,于48℃下,保存6~24 h。
1.2.5 單一酶水解模型建立 通過單一酶作用參數(shù)試驗(yàn),確定每個(gè)酶作用的最佳濃度和時(shí)間后,固定每個(gè)酶作用時(shí)間為所有酶中最優(yōu)作用時(shí)間最長(zhǎng)者為準(zhǔn),作弄濃度為每個(gè)酶各自的最優(yōu)濃度,考察不同pH和溫度條件下,每個(gè)酶的水解率。
水解率=(對(duì)照樣品被檢測(cè)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)-被檢測(cè)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))/對(duì)照樣品被檢測(cè)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)
試驗(yàn)所選3種酶的pH和溫度范圍分別為2.5~ 6.0,10~60℃,最優(yōu)pH值和溫度分別是3.5~4.8,50℃,因此試驗(yàn)參數(shù)圍繞此范圍設(shè)定如下均勻試驗(yàn)(見表2)。
復(fù)合酶條件優(yōu)化對(duì)煙梗品質(zhì)提升研究
楊乾栩1, 和智君1, 楊 蕾2, 張?zhí)鞐?, 曽曉鷹1, 王保興1, 楊 清*1
(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心,云南 昆明 650231;2.昆明理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明650500)
為提升煙梗品質(zhì),降低煙梗中大分子蛋白質(zhì)、果膠和纖維素含量,發(fā)展了煙梗的酸性蛋白酶-果膠酶-纖維素酶的復(fù)合酶水解方法,并采用全局搜索方法對(duì)復(fù)合酶的水解條件進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證。結(jié)果表明:不同酶對(duì)不同參數(shù)的響應(yīng)不同,3個(gè)酶對(duì)pH均很敏感,尤以酸性蛋白酶最為敏感,作用區(qū)間較窄,果膠酶和纖維素酶對(duì)溫度較為敏感,酸性蛋白酶受溫度影響較小。整體上,3個(gè)酶在限定范圍內(nèi)達(dá)到最優(yōu)水解率時(shí)的作用參數(shù)均不相同;參數(shù)優(yōu)化后的復(fù)合酶對(duì)煙梗中的大分子物質(zhì)具有較好的水解效果,總水解效率達(dá)28.34%,且感官品質(zhì)較好;復(fù)合酶處理后的煙梗,其品質(zhì)提升較為明顯;結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)特點(diǎn),感官品質(zhì)需求,及煙梗中蛋白、果膠和纖維素含量特點(diǎn),可以有目的的在限定條件下優(yōu)化煙梗水解效率及方向。
復(fù)合酶;參數(shù)優(yōu)化;煙梗;水解率
煙梗是卷煙生產(chǎn)中重要的副產(chǎn)物,約占煙葉的20%~25%。由于添加煙梗的卷煙其木質(zhì)氣嚴(yán)重、灼熱感較強(qiáng)、刺激性較大,極大限制了煙梗的使用,使得煙梗的利用率一直較低,造成了資源的浪費(fèi)。
從化學(xué)成分的角度來看,煙梗具有與煙葉基本一致的化學(xué)信息,但不同成分含量差異顯著。其中,煙梗中含量明顯高于煙葉且對(duì)感官品質(zhì)不利的主要成分有木質(zhì)素、纖維素、蛋白、果膠等大分子含量顯著高于煙葉(圖1)。因此發(fā)展可降低煙梗中主要大分子含量的方法,對(duì)轉(zhuǎn)化煙?;瘜W(xué)成分向煙葉趨近,提升煙梗品質(zhì)有重要作用。由于酶的選擇專一性,因此煙梗的酶前處理研究也是煙梗前處理的研究熱點(diǎn)[1-5]。
通過已有研究不難發(fā)現(xiàn),單一酶由于可以最大條件調(diào)節(jié)其作用參數(shù),因而對(duì)其目標(biāo)降解物具有較強(qiáng)的水解效果。復(fù)合酶在作用時(shí),雖然每個(gè)酶不能達(dá)到各自最大的水解效果,但由于不同酶的共同作用,其整體水解后煙梗或梗絲品質(zhì)往往具有較大提升,在生產(chǎn)中應(yīng)用往往應(yīng)用更大。然而從目前的煙梗酶水解參數(shù)選擇研究來看,均是通過有限次數(shù)的水解參數(shù)試驗(yàn)選定較優(yōu)的參數(shù)組合,未考慮到不同參數(shù)間的交互作用。針對(duì)目前研究尚存在的不足,作者發(fā)展了基于酶水解數(shù)學(xué)模型的復(fù)合酶的參數(shù)優(yōu)化方法,并根據(jù)不同的條件優(yōu)化了復(fù)合酶作用的水解參數(shù)。研究結(jié)果表明,數(shù)學(xué)模型可以從一定范圍內(nèi)對(duì)單酶和復(fù)合酶水解效果有較好的擬合效果。根據(jù)模型,并結(jié)合實(shí)際情況,可以在限定條件下考察復(fù)合酶的最佳水解條件,達(dá)到最佳水解效率。
1.1 材料、試劑和儀器
2008年紅大GBBX煙梗:紅河卷煙廠產(chǎn)品;酸性蛋白酶,果膠酶,纖維素酶:和氏璧生物試劑公司產(chǎn)品。
Milli-Q超純水系統(tǒng):美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品;XP404S型電子天平 (感量:0.1 mg):瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)酶選擇 根據(jù)和氏璧生物試劑公司官網(wǎng)提供的酶最優(yōu)參數(shù)范圍(表1),以pH和溫度為主要參考因素,結(jié)合最終復(fù)合酶所需的參數(shù)一致性原則,選擇果膠酶(pH 3.2~5.0,10~50℃),纖維素酶(pH 4.0~5.5,30~60℃),酸性蛋白酶 (pH 2.5~ 6.0,10~55℃)為最終的試驗(yàn)酶。
1.2.2 蛋白質(zhì)、果膠、纖維素檢測(cè)方法 蛋白質(zhì)的測(cè)定參照 《煙草及煙草制品 蛋白質(zhì)的測(cè)定 連續(xù)流動(dòng)法》YC/T 249-2008進(jìn)行;果膠的測(cè)定參照文獻(xiàn)[4-5]的相關(guān)方法進(jìn)行;樣品中的纖維素的測(cè)定參照《煙草及煙草制品中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸洗木質(zhì)素的測(cè)定洗滌劑法》YC/T 347-2010進(jìn)行。
1.2.3 緩沖溶液配置 精確稱量檸檬酸19.21 g,檸檬酸鈉29.41 g,分別加入1 L純凈水,即配置為0.1 mol/L緩沖溶液。量取0.7、3.2、4.6、5.7、6.6、8.0、9.3和10.0 mL的檸檬酸,并分別加入9.3、6.8、5.4、4.3、3.4、2.0、0.7和0.0 mL的檸檬酸鈉中,即配置得pH分別為6.6、5.4、4.8、4.4、4.0、3.4、3.0、2.0的檸檬酸-檸檬酸納緩沖溶液。
1.2.4 單一酶作用參數(shù)考察 稱量果膠酶、酸性蛋白酶、纖維素酶各960 mg,分別溶解于60 mL緩沖溶液中為母液,其中果膠酶和酸性蛋白酶分別溶于pH3.4的緩沖溶液,纖維素酶溶于pH 4.8的緩沖溶液;將各母液依次二倍稀釋為16,8,4,2,0.4 mg/ mL。取30 mL酶液,噴灑于120 g煙梗上,此時(shí)每個(gè)煙梗中酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.4%,0.2%,0.1%,0.05%,0.01%;將處理后的煙梗裝密封袋,于48℃下,保存6~24 h。
1.2.5 單一酶水解模型建立 通過單一酶作用參數(shù)試驗(yàn),確定每個(gè)酶作用的最佳濃度和時(shí)間后,固定每個(gè)酶作用時(shí)間為所有酶中最優(yōu)作用時(shí)間最長(zhǎng)者為準(zhǔn),作弄濃度為每個(gè)酶各自的最優(yōu)濃度,考察不同pH和溫度條件下,每個(gè)酶的水解率。
水解率=(對(duì)照樣品被檢測(cè)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)-被檢測(cè)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))/對(duì)照樣品被檢測(cè)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)
試驗(yàn)所選3種酶的pH和溫度范圍分別為2.5~ 6.0,10~60℃,最優(yōu)pH值和溫度分別是3.5~4.8,50℃,因此試驗(yàn)參數(shù)圍繞此范圍設(shè)定如下均勻試驗(yàn)(見表2)。
1.2.6 水解模型建立及參數(shù)估計(jì) 采用Levenberg-Marquardt算法,以均方根(RMSE)和R2(R-Square)為目標(biāo)函數(shù),選擇適合每個(gè)酶的關(guān)于pH和水解溫度的最佳數(shù)學(xué)模型。
1.2.7 復(fù)合酶解參數(shù)優(yōu)化 采用全局搜索算法(GlobalSearch),以水解率倒數(shù)為目標(biāo)函數(shù),對(duì)復(fù)合酶水解方程在限定條件下進(jìn)行最大值求解。
1.2.8 感官評(píng)價(jià) 參照《卷煙 第四部分:感官技術(shù)要求》(GB5606.4-2005)對(duì)煙梗樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)分析。
2.1 酶作用時(shí)間及濃度考察
圖2反映了不同酶隨作用時(shí)間及作用濃度的水解效率變化。從圖中來看,不同參數(shù)對(duì)不同酶的影響不盡相同。酸性蛋白酶水解效率從6~24 h逐漸增加,但增長(zhǎng)率有所減少。但在酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%至0.4%范圍內(nèi)穩(wěn)步增加,且增長(zhǎng)率亦逐步增加;對(duì)于果膠酶,其在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)和作用時(shí)間較低時(shí)的水解效率均較低且誤差較大,在較長(zhǎng)作用時(shí)間和較大質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí),可達(dá)到12%左右的水解率;纖維素酶水解效率與水解時(shí)間的關(guān)系同酸性蛋白酶較為相似,但從酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)來看,其水解效率則隨酶使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后減小,但整體差異并不明顯。
從上面的分析來看,3個(gè)酶的作用時(shí)間均在24 h時(shí),具有較好的水解效率。酸性蛋白酶和果膠酶作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí),纖維素酶的作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%時(shí),具有較好的水解效率。通過作用參數(shù)的單因素分析,確定了下一步每個(gè)酶作用的時(shí)間及質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
2.2 單一酶水解方程
表3是固定水解時(shí)間為24 h,酸性蛋白酶和果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%,纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%時(shí),3個(gè)酶在不同pH和溫度條件下的水解率。
圖3反映了3個(gè)酶的水解率關(guān)于pH和水解溫度的三維網(wǎng)狀圖。從圖中來看,酸性蛋白酶的水解率受pH影響極大,其適合pH范圍在3.4~4.1間,此區(qū)間水解率為9%~12%,當(dāng)pH為3.7時(shí),達(dá)到最大水解率12.1%,溫度對(duì)酸性蛋白酶水解率影響極小(圖3(a));果膠酶的最適pH范圍在3.0~4.2之間,最適溫度在35~55℃,此區(qū)間水解率為9%~ 10%,其中在水解溫度46℃,pH 3.5時(shí),達(dá)到最大水解率9.9%(圖3(b));纖維素酶的最適pH范圍在2.9~3.9之間,最適溫度在34~50℃,此區(qū)間水解率大于9%,其中在水解溫度42.5℃,pH 3.3時(shí),達(dá)到最大水解率9.7%(圖3(c))。
整體上pH對(duì)3個(gè)酶的水解率影響較大,尤其對(duì)酸性蛋白酶的影響最大,在pH 3.0~4.5范圍之外,水解率已小于4%,只有接近1.5個(gè)pH跨度的有效區(qū)間,而對(duì)于果膠酶和纖維素酶,則有接近3~4個(gè)跨度的區(qū)間;溫度對(duì)3個(gè)酶的水解率影響較少,尤其對(duì)酸性蛋白酶幾乎沒有影響。在試驗(yàn)范圍內(nèi),溫度對(duì)果膠酶和纖維素酶的水解率都呈現(xiàn)逐漸遞減的效果。
2.3 復(fù)合酶水解參數(shù)優(yōu)化
3酶混合后,作用時(shí)間設(shè)置為24 h,各酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)置為各自的最優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù),在不考慮存在的協(xié)同效應(yīng)時(shí),如果定義總水解率為蛋白質(zhì)水解率、果膠水解率和纖維素水解率之和,則總水解率方程如下:
可以看出,由于蛋白質(zhì)水解率、果膠水解率、纖維素水解率均是關(guān)于溫度T和pH的函數(shù),煙梗的總水解率實(shí)際上也是關(guān)于溫度T和pH的函數(shù)。
圖4是煙梗總水解率關(guān)于水解溫度和水解pH的等高線圖。從圖中來看煙梗的總水解率,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)與水解溫度和水解pH均表現(xiàn)為開口朝上的拋物線關(guān)系,說明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),煙??偹饴逝c水解溫度和水解pH均表現(xiàn)為先增加后減小的關(guān)系,在試驗(yàn)參數(shù)范圍內(nèi),煙梗總水解率有最大值。
從影響作用大小上來看,沿pH方向的等高線較密,變化較快,反映pH對(duì)煙??偹饴视绊戄^大,而相應(yīng)的水解溫度對(duì)煙??偹饴视绊戄^小。說明整體上,pH對(duì)復(fù)合酶的影響較為重要,需要嚴(yán)格控制。
采用全局搜索算法(GlobalSearch)對(duì)煙??偹饴蔬M(jìn)行最大值求解,參數(shù)設(shè)置為:初始值[25,3],最低邊界[20,1],最高邊界[70,7]。經(jīng)全局算法搜索,當(dāng)水解溫度為43.8°C,水解pH為3.7時(shí),具有最大的水解效率達(dá)31.64%,此時(shí)煙梗中蛋白質(zhì)、果膠和纖維素的水解率分別為12.09%、9.9%和9.65%。
2.4 復(fù)合酶處理的煙?;瘜W(xué)成分
表4是,在溫度43.8℃,pH 3.7條件下,煙梗經(jīng)復(fù)合酶處理后的果膠、蛋白質(zhì)和纖維素的理論水解值和實(shí)際水解情況比較結(jié)果。
實(shí)際檢測(cè)結(jié)果表明,蛋白質(zhì)、果膠和纖維素的水解率的理論值要略小于實(shí)際值,其原因可能是復(fù)合酶的構(gòu)建,使得酶的實(shí)際作用濃度小于其理論濃度。從總水解率差異來看,作者構(gòu)建的復(fù)合酶水解模型,可以較好的預(yù)測(cè)總水解率,具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。
2.5 復(fù)合酶處理梗絲品質(zhì)
按照優(yōu)化后的參數(shù),對(duì)煙梗進(jìn)行了復(fù)合酶處理,并對(duì)處理前后的煙梗制絲后進(jìn)行了其感官品質(zhì)分析,其中總分的計(jì)算參照下面公式:
感官質(zhì)量總分=(香氣質(zhì)×0.3+香氣量×0.3+雜氣×0.08+刺激性×0.15+余味×0.17)×11.1
從表5可見,經(jīng)復(fù)合酶處理后煙梗的感官質(zhì)量總分上提升約2分,其中在雜氣改善、刺激性降低和余味上提升明顯,具有較好的應(yīng)用前景。
作者研究了復(fù)合酶限定條件下的水解參數(shù)優(yōu)化方法,在較少的試驗(yàn)次數(shù)下,即可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)合酶最大水解效率時(shí)水解參數(shù)的準(zhǔn)確估計(jì),避免了單因素參數(shù)試驗(yàn)的結(jié)果不準(zhǔn)確性。結(jié)果表明:酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶對(duì)pH均比較敏感,對(duì)溫度則只要在70℃下,效果均較好。整體上,3個(gè)酶在限定范圍內(nèi)達(dá)到最優(yōu)水解率時(shí)的作用參數(shù)均不相同;經(jīng)水解參數(shù)優(yōu)化后,復(fù)合酶的總水解效率達(dá)28.34%,且感官品質(zhì)較好;經(jīng)復(fù)合酶處理后的煙梗,其感官品質(zhì)提升較為明顯,可用性提升較大;如果結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)特點(diǎn),感官品質(zhì)需求,及煙梗中蛋白、果膠和纖維素含量特點(diǎn),設(shè)定最合理的目標(biāo)函數(shù),可以有目的的在限定條件下優(yōu)化煙梗水解效率及方向。
[1]林凱.酶法對(duì)煙梗絲降解效果的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(11):6500-6501. LIN Kai.Research on degradation effect of tobacco stem-silk by enzyme treatment[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2011,39(11):6500-6501.(in Chinese)
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科技信息
韓國(guó)天然氨基酸制造技術(shù)取得成功
2016年10月9日首爾韓聯(lián)社報(bào)道,韓國(guó)食品研究院功能性食品研究總部金鐘泰博士研究組的天然肉類蛋白質(zhì)“氨基20”(amino 20)生產(chǎn)技術(shù)取得成功。
本次新開發(fā)的天然肉類蛋白質(zhì)“氨基20”采用高壓酶加水分解技術(shù),將日常生活中不太受人們歡迎的豬牛后腿肉、雞胸脯肉等保證其不氧化、不腐爛的環(huán)境下迅速合成蛋白質(zhì)。這種天然蛋白質(zhì)含有人類身體必需的9種 氨基酸和非必需的11種氨基酸。另外,和原有的氨基酸相比,天然氨基酸更容易被人體吸收,對(duì)消化不良患者及老弱病殘有著很好的治療效果。
該項(xiàng)研究將申請(qǐng)國(guó)際專利2項(xiàng),并在韓國(guó)國(guó)內(nèi)注冊(cè)專利完畢后進(jìn)行產(chǎn)業(yè)技術(shù)轉(zhuǎn)讓,預(yù)計(jì)2017年開始正式投入商業(yè)化生產(chǎn)。據(jù)預(yù)測(cè),2018年蛋白質(zhì)銷售市場(chǎng)將實(shí)現(xiàn)40兆韓幣的市場(chǎng)價(jià)值。
[信息來源]食品伙伴網(wǎng).韓國(guó)天然氨基酸制造技術(shù)取得成功 [EB/OL].(2016-10-11).http://news.foodmate.net/2016/ 10/399028.html
Optimization of Mixed Enzymes to Improve the Quality of Tobacco Stems
YANG Qianxu1, HE Zhijun1, YANG Lei2, ZHANG Tiandong1,ZENG Xiaoying1, WANG Baoxing1, YANG Qing*1
(1.R&D Center,China Tobacco Yunnan IndustrialCo.,Ltd.,Kunming 650231,China;2.College of Enviromental Science and Engineering,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)
The study aimed to optimize the hydrolysis parameters for mixed enzymes to improve the quality of tobacco stems and reduce the contents of macromolecules protein,pectin and cellulose. Results showed that acid protease was more sensitive to pH than pectease and cellulase but much less affected by temperature.The optimized parameters resulted in the better degradation of macromolecules with a total hydrolysis efficiency of 28.34%and significantly improved the sensory quality of tobacco stems.These indicated that hydrolysis rate and direction of tobacco stems could be changed according to industrial manufacturing,the requirement of sensory quality and the contents of macromolecules.
mixed-enzyme,parameter optimization,tobacco stems,hydrolysis rate
TS 4
A
1673—1689(2016)11—1206—06
2015-01-02
云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目(20146CP03,2013GY02)。
楊乾栩(1987—),男,內(nèi)蒙古呼倫貝爾人,理學(xué)博士,工程師,主要從事煙草化學(xué)、香精香料研究。E-mail:18314300710@126.com
*通信作者:楊 清(1973—),男,云南紅河人,理學(xué)碩士,高級(jí)工程師,主要從事卷煙產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail:hkkxl@tom.com