楊　爽， 尹　姣， 張炬紅， 李克斌， 席景會(huì)*

1吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

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一種適合稻水象甲雙向電泳的蛋白質(zhì)提取方法

楊爽1， 尹姣2， 張炬紅1， 李克斌2， 席景會(huì)1*

1吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

摘要:【背景】蛋白樣品制備是2-DE蛋白組學(xué)研究的關(guān)鍵步驟，無(wú)雜質(zhì)、高純度的蛋白樣品是獲得良好的2-DE結(jié)果的基礎(chǔ)。選擇合適于昆蟲(chóng)蛋白組學(xué)研究的常規(guī)蛋白提取方法是2-DE研究的前提?！痉椒ā客ㄟ^(guò)飽和酚法和TCA-丙酮法提取稻水象甲成蟲(chóng)總蛋白，比較2種方法的優(yōu)缺點(diǎn),以回避昆蟲(chóng)組織蛋白提取時(shí)可能出現(xiàn)的問(wèn)題?！窘Y(jié)果】TCA-丙酮法的蛋白質(zhì)產(chǎn)率(14.55 μg·mg-1)顯著高于飽和酚法(9.30 μg·mg-1)，2種方法獲得的SDS-PAGE條帶結(jié)果相近，且高豐度表達(dá)蛋白在TCA-丙酮中更高表達(dá)；飽和酚的2-DE圖譜蛋白點(diǎn)清晰，TCA-丙酮法2-DE圖譜蛋白點(diǎn)規(guī)則但背景模糊，出現(xiàn)多條橫紋?！窘Y(jié)論與意義】飽和酚法適合稻水象甲成蟲(chóng)蛋白組學(xué)的研究。這2種方法也能適用于其他昆蟲(chóng)，但不同的昆蟲(chóng)體內(nèi)有不同的干擾組分來(lái)干擾蛋白質(zhì)的提取，所以獲得的蛋白純度及提取得率可能并不一樣。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了2種蛋白提取方法對(duì)2-DE研究的影響，并為稻水象甲成蟲(chóng)的蛋白組學(xué)研究提供了一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞:2-DE; 蛋白提?。?稻水象甲； TCA-丙酮； 飽和酚

隨著昆蟲(chóng)基因組學(xué)計(jì)劃的實(shí)施，昆蟲(chóng)分子生物學(xué)研究已進(jìn)入后基因組時(shí)代，這一轉(zhuǎn)變的顯著標(biāo)志之一是蛋白質(zhì)組學(xué)的興起(Tyers & Mann，2003)。蛋白質(zhì)組學(xué)的重要研究技術(shù)是雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)和質(zhì)譜鑒定(Lietal.,2006)。2-DE是蛋白質(zhì)組學(xué)中的重要分離技術(shù)，盡管蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)進(jìn)展迅速，2-DE仍是進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品分離不可或缺的技術(shù)(Sapetal.,2015)。蛋白質(zhì)樣品的制備是進(jìn)行后續(xù)2-DE分析的關(guān)鍵，也是進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提(翁瑜等，2005; Campbelletal.,2008)。

由于昆蟲(chóng)組織中含有幾丁質(zhì)、色素、醌類及其他種次生代謝產(chǎn)物，使得蛋白質(zhì)圖譜的分辨率低，較難取得重復(fù)性好的2-DE圖譜。昆蟲(chóng)總蛋白的提取方法較多，已報(bào)道的有直接裂解法、三氯乙酸(TCA)—丙酮沉淀法、聚乙二醇(PEG)和飽和酚提取法等(安少利等，2010； 賈俊峰等，2009； 劉遙，2014)。由于生物組織成分復(fù)雜，沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)且泛用的提取方法能適用于大部分蟲(chóng)體，因此選擇合適的蛋白質(zhì)提取方法是做好雙向電泳試驗(yàn)的基礎(chǔ)(Panetal.,2013)。

稻水象甲LissorhoptrusoryzophilusKuschel屬鞘翅目Coleoptera象甲科Cuidae。原產(chǎn)于美國(guó)密西西比河流域，1959年從美國(guó)南部擴(kuò)散到加利福尼亞州。1976年入侵日本，1980韓國(guó)，2004年意大利，對(duì)全球水稻生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅(Jiangetal.,2008)。我國(guó)于1988年在河北省唐山市唐海縣首次發(fā)現(xiàn)稻水象甲，其后稻水象甲迅速傳播，1990年臺(tái)灣、天津市、北京市,1991年遼寧省,1992年山東省,1993年浙江及吉林省先后出現(xiàn)該蟲(chóng)，隨后又蔓延至安徽、江蘇、福建、江西、湖南、廣東、廣西及山西等省(區(qū))，是我國(guó)糧食作物重點(diǎn)治理的檢疫性害蟲(chóng)之一 (鄧根生等，2005； 商晗武和張志濤，2004； Jiang & Cheng,2003)。

本試驗(yàn)以稻水象甲為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)了不同的蛋白質(zhì)樣品制備方法，并對(duì)2-DE的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了適合稻水象甲成蟲(chóng)蛋白提取的方法，為稻水象甲蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

稻水象甲雌成蟲(chóng)于2015年6月采自長(zhǎng)春周邊水稻田，采集后放入離心管內(nèi)，每管20頭分裝，稱重后置于-80 ℃冰箱待用。

1.2稻水象甲總蛋白提取

1.2.1TCA-丙酮沉淀法參考Méchinetal. (2007)的方法，取-80 ℃凍存的成蟲(chóng)20頭，置于液氮中充分研磨，加入1 mL -20 ℃預(yù)冷的10% TCA-丙酮，震蕩混勻30 s，-20 ℃冷藏2 h；4 ℃、15000 r·min-1離心15 min，棄上清；沉淀用1 mL冷丙酮充分懸浮，-20 ℃冷藏30 min；4 ℃、15000 r·min-1離心5 min，棄上清；沉淀用1 mL 80%冷丙酮充分懸浮，-20 ℃冷藏30 min；4 ℃、15000 r·min-1離心5 min，棄上清；將沉淀干燥2 min，蛋白沉淀置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2飽和酚提取法參考Faurobertetal.(2007)的方法，取-80 ℃凍存的成蟲(chóng)20頭，置于液氮中充分研磨，分別加入-20 ℃預(yù)冷的10%TCA-丙酮、甲醇和80%丙酮溶液進(jìn)行懸浮及洗滌，棄上清，沉淀室溫干燥2 min；加入等體積的飽和酚溶液和dense SDS buffer (0.1 mol·L-1pH 8.0 Tris-HCl、2% SDS、2% β-巰基乙醇、30% 蔗糖)，混勻震蕩，4 ℃、15000 r·min-1離心5 min，取酚層加入5倍體積的0.1 mol·L-1乙酸銨溶液，-20 ℃沉淀2 h；4 ℃ 15000 r·min-1離心15 min，沉淀用80% 丙酮洗滌2～3次，將沉淀干燥，蛋白沉淀置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3蛋白濃度測(cè)定

取凍存的蛋白質(zhì)沉淀，加入適量水化液lysis buffer (5 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、2% SB 3-10、2% CHAPS、5 mmol·L-1TCEP、20 mmol·L-1DTT、0.002%溴酚藍(lán))懸浮沉淀，30 ℃孵育1.5 h；13000 r·min-1離心30 min，吸取上清液測(cè)定蛋白濃度。

參照Bradford (1976)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4SDS-PAGE凝膠電泳

分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%。采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行染色。染色后的凝膠用Epson Expression 10000XL掃描儀掃描。

1.5雙向凝膠電泳

膠條水化：取300 μg蛋白質(zhì)溶液、6.8 μL IPG buffer，用水化液lysis buffer補(bǔ)足到340 μL，置于離心管中充分混勻，將18 cm pH 4～7的IPG膠條覆蓋于該溶液上方，被動(dòng)水化16 h。第一向等電聚焦：聚集溫度設(shè)置為17 ℃、500 V、1 h；1000 V、1 h；4000 V、1 h；8000 V、1 h；8000 V、4 h。膠條平衡：在膠條平衡緩沖液(6 mol·L-1尿素、2% SDS、30% 甘油、50 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.8、0.002% 溴酚藍(lán))中分別加入1% DTT和2.5% 碘乙酰胺溶液，搖床震蕩平衡15 min。第二向垂直電泳：恒壓300 V、10 mA、30 min；恒壓300 V、26 mA、8.5 h。使用銀染方法進(jìn)行凝膠染色(Yanetal.,2000)。染色后用Epson Expression 10000 XL掃描儀掃描，利用ImageMasterTM 2D Platinum 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，每種提取方法重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.12種方法蛋白產(chǎn)率分析

飽和酚法提取的蛋白為白色固體，TCA-丙酮法提取的蛋白質(zhì)為淡黃色固體，這2種蛋白固體在經(jīng)水化液溶解離心后，均有一部分不溶的果凍狀沉淀。2種方法提取稻水象甲總蛋白的產(chǎn)率如圖1所示。飽和酚法蛋白產(chǎn)率為9.30 μg·mg-1，TCA-丙酮沉淀法蛋白產(chǎn)率為14.55 μg·mg-1。利用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件，使用ANOVA/LSD方法分析和檢驗(yàn)，通過(guò)方差分析，表明TCA-丙酮沉淀法蛋白產(chǎn)率顯著高于飽和酚法(P<0.05)。

2.22種方法提取蛋白的SDS-PAGE分析

對(duì)飽和酚提取法和TCA-丙酮法提取的稻水象甲成蟲(chóng)全蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE電泳，蛋白上樣量相同。結(jié)果如圖2所示，2種方法獲得的蛋白條帶數(shù)基本一致，14.4～116.2 ku范圍內(nèi)條帶呈均勻分布。14.4～35.0 ku之間條帶顏色略淺，此范圍內(nèi)的蛋白含量較低；35.0 ～116.2 ku范圍內(nèi)條帶清晰可見(jiàn)，蟲(chóng)體蛋白分子主要位于此區(qū)域，其中45.0 ku處的蛋白高豐度表達(dá)。

在14.4～25.0 ku間，飽和酚條帶淺于TCA-丙酮條帶，說(shuō)明飽和酚法在此處的蛋白損失大于TCA-丙酮;在45.0 ku以及116.2 ku以上的條帶，飽和酚條帶均淺于TCA-丙酮條帶，說(shuō)明這些區(qū)域飽和酚提取法的蛋白損失均高于TCA-丙酮法。

2.32種提取法總蛋白雙向凝膠電泳分析

TCA-丙酮及飽和酚法提取總蛋白的2-DE電泳圖譜如圖3所示。2種方法提取的蛋白圖譜中蛋白點(diǎn)分布基本一致，35.0～116.2 ku區(qū)間內(nèi)的蛋白點(diǎn)較14.4 ～35.0 ku更多且密集，與SDS-PAGE結(jié)果吻合。TCA-丙酮法蛋白圖譜蛋白點(diǎn)數(shù)為697±15，飽和酚蛋白圖譜蛋白點(diǎn)數(shù)為659±13，經(jīng)ANOVA/LSD方法分析和檢驗(yàn)，結(jié)果差異不顯著(P>0.05)。TCA-丙酮蛋白圖譜背景模糊，在45.0～116.2 ku處出現(xiàn)多條橫紋，在45.0 kDa出現(xiàn)彌散條帶及高豐度表達(dá)蛋白，此結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果相吻合。高豐度表達(dá)的蛋白點(diǎn)M影響周圍蛋白的正常顯示，說(shuō)明蛋白中的雜質(zhì)較多，影響了2-DE的分辨率及清晰度(圖3A)；而飽和酚法蛋白圖譜背景清晰，圓形蛋白點(diǎn)規(guī)則飽滿，說(shuō)明飽和酚的2-DE圖譜質(zhì)量更高(圖3B)。

3討論

蛋白樣品制備是2-DE試驗(yàn)的重要步驟，很大程度上影響了2-DE的重復(fù)性及2-DE圖譜的分辨率和靈敏度(杜鵬等，2005； 談旭翡和陳智，2008)。大部分蛋白可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)可溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中。TCA-丙酮法最早用于植物蛋白的提取，是目前常用的蛋白提取方法。此方法以有機(jī)溶劑丙酮為核心，通過(guò)多次離心及三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)，著力于對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀及脂質(zhì)的去除，對(duì)多糖、色素等雜質(zhì)去除效果一般，因此蛋白質(zhì)沉淀為淡黃色，近似稻水象甲的體色(安少利等，2010)。飽和酚法則是利用兩相溶液對(duì)蛋白進(jìn)行提取，多糖和色素等雜質(zhì)可溶于水相，蛋白質(zhì)進(jìn)入酚層，因此提取的蛋白質(zhì)中沒(méi)有這些物質(zhì)的干擾而呈白色。

2-DE結(jié)果會(huì)出現(xiàn)很多問(wèn)題，如背景模糊帶色、橫紋、縱紋、彌散條帶及蛋白點(diǎn)不規(guī)則等。出現(xiàn)這些問(wèn)題的原因和蛋白樣品制備、2-DE條件不當(dāng)有關(guān)。在2-DE步驟一定的情況下，背景模糊的原因可能是蛋白質(zhì)樣品純度不夠。蛋白質(zhì)樣品中混有的鹽分、核酸，蛋白質(zhì)溶解不好會(huì)造成橫紋的出現(xiàn)(舒海燕等，2009)。TCA-丙酮沉淀法中因?yàn)榻?jīng)過(guò)多次沉淀，易造成蛋白質(zhì)溶解性不好；飽和酚法中的SDS和β-巰基乙醇為還原劑，SDS還能作為去污劑，能有效去除蛋白質(zhì)中的陰離子，促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解。高豐度表達(dá)蛋白的存在會(huì)導(dǎo)致彌散條帶，掩蓋2-DE圖譜中的一些位點(diǎn)的識(shí)別，并且限制低豐度蛋白的裝載容量(談旭翡和陳智，2008)。本試驗(yàn)中，2種方法的2-DE圖譜中的45.0 ku附近均出現(xiàn)了高豐度表達(dá)蛋白及彌散條帶，昆蟲(chóng)樣品中高豐度蛋白的存在對(duì)其他蛋白，尤其是低豐度蛋白的檢測(cè)影響較大，高豐度表達(dá)蛋白的去除也是2-DE試驗(yàn)的難題之一。

本試驗(yàn)通過(guò)TCA-丙酮沉淀法和飽和酚法提取了稻水象甲成蟲(chóng)總蛋白，應(yīng)用雙向電泳技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TCA-丙酮能取得較高的蛋白產(chǎn)率，但飽和酚法能獲得更適合的稻水象甲成蟲(chóng)全蛋白，試驗(yàn)中可以得到蛋白點(diǎn)規(guī)則、背景干凈清晰、分辨率高的2-DE圖譜，更適合稻水象甲成蟲(chóng)蛋白組學(xué)的研究。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因與TCA-丙酮法及飽和酚法提取蛋白的原理相關(guān)，然而對(duì)于某種樣品蛋白質(zhì)提取方法的選擇，并不能一概而論。

目前尚沒(méi)有稻水象甲總蛋白質(zhì)提取的相關(guān)報(bào)道，而在鞘翅目昆蟲(chóng)的蛋白提取方面，魏振鑫(2015)發(fā)現(xiàn)TCA-丙酮沉淀法能更好地去除暗黑鰓金龜HolotrichiaparallelaMotschulsky觸角蛋白中的鹽離子，且SDS-PAGE條帶清晰；Hidalgo-Galianaetal.(2014)在龍虱Agabusramblae的雙向電泳研究中，采用尿素裂解液液氮研磨法獲取了清晰的2-DE圖譜。出現(xiàn)這些不同方法選擇的原因是不同蛋白提取方法的針對(duì)性不同，且昆蟲(chóng)組織成分的復(fù)雜性，并沒(méi)有統(tǒng)一且標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)提取高質(zhì)量的蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)利用改進(jìn)的飽和酚法對(duì)稻水象甲總蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，通過(guò)蛋白質(zhì)雙向電泳，獲得了高分辨率、重復(fù)性好的凝膠圖譜，在圖譜上顯示的蛋白點(diǎn)在650以上，為稻水象甲蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯:郭瑩)

A protein extraction method suitable for 2-DE analysis of rice water weevil

Shuang YANG1, Jiao YIN2, Ju-hong ZHANG1, Ke-bin LI2, Jing-hui XI1*

1CollegeofPlantScience,JilinUniversity,Changchun,Jinlin130062，China;2StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China

Abstract:【Background】 Protein sample preparation is a central step in a 2-DE proteomics as pure protein samples are necessary. There is a need to establish a routine protocol for the application of proteomics analysis in insects. 【Method】 This study focused on the specific protein extraction problems in insect tissued and evaluated two protocols to bypass them. The methods of phenol extraction (PE) and TCA/acetone precipitation (TCA) were evaluated for proteins isolation from adult rice water weevil,LissorhoptrusoryzophilusKuschel. 【Result】 TCA method yielded a greater protein extraction rate (14.55 μg·mg-1) than the PE protocols (9.30 μg·mg-1). The two methods got similar SDS-PAGE results but the expression of protein was higher in TCA than PE; For 2-DE, the PE protocol was optimal, resulting in good background and clear protein spots and TCA had an indistinct background and occurred a few bands were present. 【Conclusion and significance】 Among the applied methods, PE precipitation extraction was found to be more suitable than TCA for rice water weevil proteomic analysis. These protocols should also be applicable to other insects. Different insects can vary considerably in the amounts and types of interfering compounds they produce, so the results of protein extraction rate and purity in different insects should be assessed. The study proves that various protein extraction methods result in different protein rates and 2-DE products. It provides basic protocols for proteomic analysis of adult rice water weevil.

Key words:2-DE; protein extraction; rice water weevil; TCA-acetone; tris-phenol

收稿日期(Received)：2015-10-12接受日期(Accepted)： 2015-11-10

基金項(xiàng)目:國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)(2014ZX0801101B)； 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201576)； 吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150309006NY、20130102045JC)

作者簡(jiǎn)介:楊爽， 男， 博士研究生。 研究方向: 稻水象甲抗寒機(jī)理。 E-mail: 664867025@qq.com *通訊作者(Author for correspondence), E-mail: jhxi1965@jlu.edu.cn

DOI:10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.02.011