劉銘+彭玲+楊盛清+田大倫

摘 要 為用蛋白質(zhì)組學(xué)方法初步分析血水草根蛋白質(zhì)的表達(dá)，提取血水草根的蛋白質(zhì)，經(jīng)雙向凝膠電泳分離、考馬斯亮藍(lán)染色后，切取分離較好的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF-TOF）分析和數(shù)據(jù)庫(kù)（IPI）檢索， 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定.成功鑒定了28個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中具有明確功能的蛋白質(zhì)17種，分別屬于DNA復(fù)制酶、翻譯調(diào)控蛋白、代謝酶、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白；另外11種為未知功能蛋白.

關(guān)鍵詞 血水草； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 雙向電泳； 質(zhì)譜

中圖分類(lèi)號(hào) Q51 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2016）05-0022-05

Abstract To analyze the protein expression in Eomecon chionantha Hance roots with the proteomics approach， all proteins were extracted and separated by two-dimensional gel electrophoresis（2-DE）， and stained with coomassie brilliant blue G250 to produce a high resolution and reproducible 2-DE image. Protein spots selected from this image were identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry and tandem mass spectrometry （MALDI-TOF-TOF）. The mass spectrometric data were used to identify the proteins through searches of the IPI protein sequence database. A total of 28 protein spots were successfully identified， 17 of which were classified with various functional characteristics such as DNA replicase， translation regulating proteins， metabolism enzymes， and cytoskeleton proteins. Eleven unknown proteins were identified as well.

Key words Eomecon chionantha Hance； proteomics； 2-DE； mass spectrometry

近年來(lái)，隨著植物基因組學(xué)以及高通量的蛋白質(zhì)分析鑒定技術(shù)的發(fā)展，使得植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成為植物生物學(xué)研究重要內(nèi)容[1-2].大部分植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究集中在擬南芥、水稻等植物[3-6]，其他植物不同組織器官如種子、葉、根等蛋白質(zhì)組學(xué)研究也有較多報(bào)道 [7-9].血水草（Eomecon chionantha Hance，1884）是我國(guó)獨(dú)屬、獨(dú)種的特有物種[10]，系罌粟科白屈菜族血水草屬植物，廣泛分布在我國(guó)長(zhǎng)江流域、西南、華南、華東地區(qū).血水草包含多種生物堿，主要分布在根及根莖中，生物堿是其重要有效成分 [11].本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)首次對(duì)血水草根的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行探討，為血水草的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 材料

血水草采自湖南省益陽(yáng)市桃江縣飛山崖，采摘時(shí)間為秋季，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周天達(dá)教授鑒定為罌粟科（Papaveraceae）白屈菜族（Chelidonium）血水草屬（Eomecon）植物血水草（Eomecon chionantha Hance）.取血水草成熟根，清水洗凈后，晾干，-20 ℃儲(chǔ)存.

2 主要儀器與試劑

2.1 儀器

Protein Ⅱ垂直電泳槽為Bio-Rad 公司產(chǎn)品；Multistemp Ⅲ圖像掃描儀、恒溫制冷循環(huán)水浴箱、圖像分析軟件Imagemaster 2-D Platinum Software 5.0和IPG等電聚焦儀均為 Amersham Biosciences 產(chǎn)品； BP211D電子天平為德國(guó)Sartorius 公司產(chǎn)品； 質(zhì)譜儀Ultraflex MALDI-TOF-TOF 為德國(guó)Bruker Daltonics 產(chǎn)品；GelDoc 2000 凝膠成像儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品；Savant冷凍干燥機(jī)為美國(guó)Thermo Electron公司產(chǎn)品.

2.2 試劑

線性固相pH梯度預(yù)制膠條 （IPG strip pH 3～10，17 cm），兩性電解質(zhì)，2D Quant Kit 定量試劑盒，IPG 緩沖液，蛋白質(zhì)裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，0.2%Tris， 使用前加入75 mmol/L DTT和2 mmol/L PMSF），DeStreak Rehydration Solution均為Amersham Biosciences 產(chǎn)品；四甲基乙烯基二胺（TEMD），過(guò)硫酸胺（APS），二硫蘇糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），硫酸銨，甲叉雙丙烯酰胺，三氯乙酸（TCA），丙烯酰胺，三羥甲基氨基甲烷（Tris），胰蛋白酶和考馬斯亮藍(lán)G250均為Sigma 產(chǎn)品； CCA為Bruker Daltonics產(chǎn)品.

3 方法

3.1 血水草根總蛋白的提取及定量

將血水草根用清水徹底洗干凈，剪碎，TCA-丙酮懸浮后，超聲，再加入裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，75 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，4%CHAPS，0.2%Tris），充分研磨后，在冰上超聲裂解，靜置10 min離心，收集上清.在上清液中加入提取液（含0.07%β-巰基乙醇和10%TCA的丙酮），-20 ℃過(guò)夜，離心，棄上清.沉淀中加入預(yù)冷丙酮，沉淀8 h，離心棄上清，裂解液重新溶解沉淀.用2-D Quant kit試劑盒測(cè)定總蛋白濃度.樣品置-80 ℃ 保存?zhèn)溆?

3.2 雙向凝膠電泳及凝膠圖像分析

樣品蛋白質(zhì)通過(guò)雙向凝膠電泳進(jìn)行分離.第一向上樣量為600 μg，等電聚焦電泳采用17 cm， pH 3～10的IPG膠條；第二向采用12% SDS-PAGE的分離膠分離.將電泳后的凝膠先置于固定液（40%甲醇，10%乙酸）中固定30 min，再置于考馬斯亮藍(lán)染液（25%甲醇，10%磷酸，10%硫酸銨，0.1%考馬斯亮藍(lán)G250）中染色過(guò)夜.用雙蒸水清洗凝膠，直至背景清晰，凝膠經(jīng)圖像掃描儀掃描，用圖像分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析.

3.3 質(zhì)譜鑒定

切取蛋白質(zhì)點(diǎn)放置在EP管中，加入50 μL脫色液（50%乙腈，25 mmoL碳酸氫銨），脫色后加入乙腈干膠，再置于真空干燥儀中干燥.干燥后的膠塊中加入胰酶溶液，冰水浴1 h，37 ℃消化18～24 h，離心，棄上清.加入萃取液（50%乙腈，5%三氟乙酸）覆蓋膠塊，37 ℃保溫1 h，離心，收集萃取液，凍干至樣品體積約為5 μL，再將樣品與CCA基質(zhì)液以體積比1∶1混勻，點(diǎn)樣于AnchorChip板上，進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析.質(zhì)譜參數(shù)如下：激光源為337 nm的氮?dú)饧す?，發(fā)射模式離子源1電壓25 kV，離子源2電壓21.8 kV，均在正離子模式下檢測(cè).用BioTools 2.2軟件整合PMF和LIFT質(zhì)譜結(jié)果，對(duì)IPI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索.查詢(xún)條件：切割酶為胰蛋白酶，允許最大末酶切位點(diǎn)數(shù)為1，PMF誤差為5×10-5，MS/MS 誤差0.6，考慮甲硫氨酸殘基的氧化.

4 結(jié)果

4.1 血水草根的2-DE圖譜

在相同條件下對(duì)血水草根蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳，得到了一致性較好的電泳圖譜（見(jiàn)圖1）.從圖1中可以看出，2-DE圖譜背景較淺，蛋白點(diǎn)的分布均勻，大小蛋白質(zhì)組分斑點(diǎn)均清晰可見(jiàn)，達(dá)到預(yù)期分離效果.圖譜通過(guò)Imagemaster 2-D軟件分析，結(jié)果顯示平均檢測(cè)到（464±10）個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)（n=3） 匹配率為84.5%，經(jīng)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)回顧性分析，選取237個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行質(zhì)譜分析.

4.2 蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜分析

選取蛋白質(zhì)點(diǎn)237個(gè)，通過(guò)MALDI-TOF-TOF成功鑒定28個(gè)蛋白質(zhì)（圖2，表1）.其中具有明確功能的蛋白質(zhì)有17種，按照蛋白質(zhì)動(dòng)能分類(lèi)分別屬于DNA復(fù)制酶、翻譯調(diào)控蛋白、代謝酶、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白；另外11種為未知功能蛋白.

5 討論

血水草，各地俗稱(chēng)較多，例如水黃蓮、捆仙繩、黃水草、廣扁線、馬蹄草等 [12]，生長(zhǎng)在山野、路旁、溪邊、林邊等較潮濕的泥土內(nèi)，取材容易.從血水草的根及根莖中提取的生物堿（Eomecon Chionantha Alkaloids，簡(jiǎn)稱(chēng)ECA），包括血根堿、白屈菜紅堿、白屈菜紅默堿、原阿片堿和α-別隱品堿等，分屬苯駢菲啶或阿片型生物堿[13].這些生物堿具有抗菌、增強(qiáng)免疫、抗癌、松弛平滑肌、鎮(zhèn)痛與鎮(zhèn)靜的作用等[14-16].近幾年發(fā)現(xiàn)生物堿具有殺滅日本血吸蟲(chóng)尾蚴及中間宿主釘螺的作用[17-19].血水草的應(yīng)用價(jià)值得到越來(lái)越多的關(guān)注.作者對(duì)血水草的根進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，經(jīng)雙向電泳分離和考馬斯亮藍(lán)染色后，選取了表達(dá)量豐富的237個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，成功鑒定了28個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，大致可分為DNA復(fù)制酶、翻譯調(diào)控蛋白、代謝酶和細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白.

（1）參與DNA 復(fù)制、翻譯、轉(zhuǎn)錄過(guò)程蛋白：在生物體內(nèi)，核酸酶在維持基因組完整性和DNA的損傷修復(fù)過(guò)程中至關(guān)重要，核酸酶結(jié)構(gòu)、表達(dá)量或功能的改變，會(huì)影響到基因組完整性以及DNA 的損傷修復(fù)[20].DNA 連接酶是生物體內(nèi)極為重要的酶，可以分為兩種：一是利用ATP的能量催化兩個(gè)核苷酸鏈之間形成磷酸二酯鍵的依賴(lài)ATP 的DNA 連接酶；二是利用NAD+的能量催化兩個(gè)核苷酸鏈之間形成磷酸二酯鍵的依賴(lài)NAD+的DNA 連接酶[21].DNA聚合酶是細(xì)胞復(fù)制DNA的重要作用酶，在具備模板、引物和dNTP等的情況下它能將4種脫氧核苷三磷酸聚合成一條DNA 鏈.轉(zhuǎn)座酶能特異地識(shí)別轉(zhuǎn)座子兩端的DNA 序列.在轉(zhuǎn)座酶作用下，轉(zhuǎn)座因子在同一細(xì)胞內(nèi)從一個(gè)DNA 位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置.成熟酶K與內(nèi)含子RNA結(jié)合，使之折疊成有催化活性的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)前體RNA剪接， 直接在翻譯水平影響基因的表達(dá)[22].有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草打頂后成熟酶K表達(dá)上調(diào)， 表明煙草打頂處理能通過(guò)增加成熟酶K的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)RNA內(nèi)含子的剪切，從而影響6-磷酸山梨醇脫氫酶、氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶、精胺/亞精胺合成酶等調(diào)控碳氮代謝的酶基因的表達(dá)水平， 進(jìn)而影響煙堿合成的相關(guān)生理過(guò)程[23].

（2）代謝酶：此次鑒定成功的代謝酶有ATP合酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶、亞硫酸鹽還原酶、多屬性脫氫酶、一氧化氮還原酶、琥珀酰輔酶A合成酶.生物有機(jī)體中，ATP的合成是最主要的化學(xué)反應(yīng)之一.ATP合酶廣泛分布于葉綠體類(lèi)囊體、線粒體內(nèi)膜、異養(yǎng)菌和光合菌的質(zhì)膜上，參與氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的推動(dòng)下合成ATP.ATP合酶的β亞基與核苷酸結(jié)合后，具有催化 ATP 合成或水解的活性 [24].腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）是葡萄糖合成的供體，葡萄糖-1-磷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶主要催化葡萄糖-1-磷酸與ATP合成 ADPG，這在植物淀粉合成中是主要的調(diào)節(jié)步驟，是植物光合和非光合組織中淀粉合成的起始步驟[25].亞硫酸鹽還原酶是催化亞硫酸鹽還原為硫化物的酶， 在植物生命活動(dòng)中具有關(guān)鍵作用 [26].脫氫酶是一種氧化還原酶， 在生物細(xì)胞內(nèi)催化有機(jī)物氧化脫氫， 并將其傳遞給最終受氫體.脫氫酶參與的生物反應(yīng)包括光合作用、氨基酸合成和降解、脂肪的氧化和合成、丙酮酸的氧化、戊糖磷酸途徑等， 為生物體提供必不可少的能量[27].一氧化氮在一氧化氮還原酶的作用下，被還原成N2O.琥珀酰輔酶A合成酶（SCS）由α和β兩種亞基構(gòu)成，是檸檬酸循環(huán)的重要組成成分，催化該循環(huán)中底物磷酸化的步驟[28].

（3）細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白：脂蛋白是蛋白質(zhì)與脂肪或類(lèi)脂結(jié)合而成的一類(lèi)復(fù)雜蛋白.脂質(zhì)通常以非共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，廣泛存在于生物膜以及動(dòng)物的血漿和乳汁中，在生物膜的功能中起十分重要的作用.除成熟紅細(xì)胞外，所有細(xì)胞中都有核糖體存在.核糖體是細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)之一，是合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器，其唯一的功能是將氨基酸裝配成肽鏈.肌動(dòng)蛋白是一種高度保守的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞骨架的主要組成成分，它不僅參與維持細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而且在細(xì)胞分裂與分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等諸多方面具有重要功能[29].

（4）未知功能蛋白：此次實(shí)驗(yàn)還鑒定了幾種未知功能蛋白，如蛋白酶3型、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白、未知蛋白等.這些蛋白是根據(jù)其核苷酸序列確定的，可能是血水草特有的蛋白質(zhì)或者是其他生物的蛋白質(zhì)，目前尚未進(jìn)行研究.

本研究初步建立了血水草根2-DE參考圖譜，為建立血水草蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)提供了必要的資料.血水草的蛋白質(zhì)構(gòu)成研究，為血水草開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，特別是為血水草作為植物殺螺、滅蚴劑得以在流行區(qū)廣泛種植及開(kāi)發(fā)成轉(zhuǎn)基因植物提供理論基礎(chǔ).

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（編輯 WJ）