崔青松，金明根，黃莉花，夏書香，安昌善

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000)

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·基礎(chǔ)研究·

納洛酮對ARDS大鼠血漿β-內(nèi)啡肽及肺組織NF-κB表達(dá)的影響

崔青松，金明根，黃莉花，夏書香，安昌善

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000)

目的觀察納洛酮對急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)大鼠血漿β-內(nèi)啡肽(β-EP)及肺組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響。方法將30只大鼠隨機(jī)分為對照組、ARDS組、納洛酮組，采取股靜脈注入油酸建立ARDS模型，納洛酮組注入油酸后再注入納洛酮注射液1.0 mg/kg，ARDS組注入油酸后再注入等量生理鹽水，對照組僅注入生理鹽水。測定各組血漿β-EP；處死大鼠，測算左肺濕/干重比值；取右肺中葉，采用免疫組化染色法檢測NF-κB表達(dá)；取右肺上葉，觀察組織病理變化。分析血漿β-EP與肺組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率及左肺濕/干重比值的相關(guān)性。結(jié)果ARDS組與對照組比較，血漿β-EP、左肺濕/干重比值、肺組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率均升高(P均<0.01)；納洛酮組與ARDS組比較，血漿β-EP、左肺濕/干重比值、肺組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率均下降(P均<0.01)。肺組織病理檢查顯示，ARDS組Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、壞死，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)板層小體變性、破壞、排空現(xiàn)象，肺泡腔內(nèi)可見炎癥細(xì)胞；納洛酮組肺泡、肺間質(zhì)病變明顯減輕；對照組無上述改變。相關(guān)性分析顯示，血漿β-EP、肺組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率與左肺濕/干重比值呈正相關(guān)(r分別為0.893、0.975，P均<0.01)，血漿β-EP與肺組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.958，P<0.01)。結(jié)論納洛酮可抑制血漿β-EP升高，阻斷肺組織NF-κB激活，減輕ARDS大鼠肺組織炎癥反應(yīng)，減輕肺間質(zhì)、肺泡水腫。

納洛酮；急性呼吸窘迫綜合征；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；β-內(nèi)啡肽；油酸；大鼠

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病死率居高不下，是ICU患者死亡的主要病因之一[1]。納洛酮為阿片受體專一拮抗劑，通過競爭性地與阿片受體結(jié)合產(chǎn)生藥理作用，抑制機(jī)體全身炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定細(xì)胞膜對鈣離子通透性，減少肺組織及細(xì)胞損傷，從而降低肺血管的通透性。2014年1月～2015年1月，我們采用油酸誘導(dǎo)ARDS大鼠模型，觀察納洛酮對ARDS大鼠血漿β-EP及肺組織NF-κB表達(dá)的影響，探討納洛酮對ARDS的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料健康SD大鼠30只，雌雄不拘，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。油酸(沈陽市東興試劑廠)，鹽酸納洛酮注射液(北京凱因科技股份有限公司)，NF-κB測試盒(武漢博士德生物工程有限公司)，β-EP酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(加拿大HCB公司)。

1.2動物分組與處理將大鼠隨機(jī)分為對照組、ARDS組、納洛酮組各10只。由大鼠左下腹注入20%烏拉坦1.0 g/kg腹腔麻醉，剝離股動脈和股靜脈，并將自制靜脈管插入股靜脈。對照組向股靜脈緩慢注入生理鹽水4.1 mL/kg，ARDS組先注入油酸0.1 mL/kg再緩慢注入生理鹽水4.0 mL/kg，納洛酮組先注入油酸0.1 mL/kg再緩慢注入納洛酮注射液1.0 mg/kg(溶于生理鹽水2.0 mL/kg)。以注入油酸后大鼠出現(xiàn)呼吸頻率增快、呼吸窘迫表現(xiàn)，鼻腔溢出粉紅色分泌物為模型制作成功。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1血漿β-EP給藥后3 h腹主動脈采血，離心分離血漿，-40 ℃凍存，使用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測β-EP。

1.3.2左肺濕/干重比值腹主動脈取血后立即處死大鼠，取左肺稱取濕重，置68 ℃恒溫箱48 h完全脫水，稱干重，計(jì)算左肺濕/干重比值。

1.3.3肺組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率采用免疫組化方法檢測。取右肺中葉，甲醛固定，石蠟包埋、切片。切片常規(guī)脫蠟至水；加入H2O2滅活內(nèi)源性過氧化酶，滴加復(fù)合消化液反應(yīng)10 min。加入牛血清封閉液，室溫10 min，PBS沖洗。一次加入一抗NF-κB p65小鼠單克隆抗體、羊抗小鼠IgG-HRP多聚體，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。于高倍鏡下觀察同一切片的5個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記錄陽性細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算陽性細(xì)胞表達(dá)率。

1.3.4肺組織病理取右肺上葉，甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。取右肺下葉，切成約1 mm3的小塊，戊二醛固定，丙酮逐級脫水，混合樹脂包埋，切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，電鏡下觀察肺組織病理改變。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料行方差分析和t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用偏相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組血漿β-EP比較對照組、ARDS組、納洛酮組血漿β-EP分別為(40.55±2.68)、(65.57±1.93)、(55.29±1.82)pg/mL，ARDS組、納洛酮組均高于對照組，ARDS組高于納洛酮組(P均<0.01)。

2.2三組左肺濕/干重比值比較對照組、ARDS組、納洛酮組左肺濕/干重比值分別為4.23±0.12、5.95±0.11、5.17±0.72，ARDS組和納洛酮組均高于對照組，ARDS組高于納洛酮組(P均<0.01)。

2.3三組肺組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率比較對照組、ARDS組、納洛酮組肺組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率分別為15.19%±1.99%、56.01%±1.77%、35.32%±2.60%，ARDS組和納洛酮組均高于對照組，ARDS組高于納洛酮組(P均<0.01)。

2.4病理檢查結(jié)果光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ARDS組肺泡萎縮，肺泡腔內(nèi)見滲出性液，可見中性粒細(xì)胞和泡沫樣細(xì)胞，部分位置見透明膜形成，肺間質(zhì)明顯水腫、增厚，血管周圍見套袖狀水腫。納洛酮組上述病變輕，肺泡萎縮有所改善，肺泡、肺間質(zhì)病變減輕，肺泡腔內(nèi)滲出性液、中性粒細(xì)胞減少，偶見泡沫樣細(xì)胞。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ARDS組可見Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和壞死，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞出現(xiàn)板層小體變性、破壞、排空現(xiàn)象，見大小不均的空泡，肺泡表面覆蓋一層條索狀物質(zhì)，肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)可見炎癥細(xì)胞；納洛酮組上述變化比較輕。

2.5相關(guān)性分析血漿β-EP、肺組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率與左肺濕/干重比值呈正相關(guān)(r分別為0.893、0.975，P均<0.01)，血漿β-EP與肺組織NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.958，P<0.01)。

3　討論

ARDS由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、誤吸和手術(shù)等多種原因引起，以肺泡毛細(xì)血管膜損傷導(dǎo)致的肺水腫、肺內(nèi)微血栓形成為病理特征[2]，臨床主要表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥。ARDS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病急驟，預(yù)后不良。文獻(xiàn)報(bào)道，ARDS的病死率高達(dá)50%[3,4]，是ICU病死率增加的重要因素[5]。油酸是一種對內(nèi)皮細(xì)胞具有毒性作用的脂肪酸，注入機(jī)體后可引起毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷，脂肪栓子阻塞肺毛細(xì)血管造成微循環(huán)障礙。本研究顯示，向大鼠股靜脈注入油酸后，大鼠出現(xiàn)呼吸增快、呼吸窘迫表現(xiàn)；左肺濕/干重比值顯示肺重量增加；外觀呈暗紅色，并有灶性壞死；光鏡下可見肺微血管淤血，微血栓形成及小灶性出血，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)水腫，透明膜形成，大片肺泡萎縮；電鏡下可見Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞變性明顯，Ⅱ型上皮細(xì)胞板層小體排空明顯，具有明顯的ARDS表現(xiàn)。

β-EP是一種內(nèi)源性阿片肽，在下丘腦和垂體釋放、作為神經(jīng)介質(zhì)。血漿中的β-EP作用于嗎啡受體，抑制呼吸中樞，在肺微血管通透性中起媒介作用[6]，使肺微血管通透性增高，促進(jìn)肺水腫。機(jī)體在急性應(yīng)激狀況下，會釋放大量內(nèi)阿片肽，使腦脊液、血漿和大腦區(qū)的內(nèi)源性阿片肽增多，尤其是β-EP明顯升高[7]。本研究顯示，ARDS組、納洛酮組血漿β-EP較對照組明顯升高。提示β-EP是參與ARDS病程的重要介質(zhì)之一。相關(guān)分析表明，β-EP與左肺濕/干重比值呈正相關(guān)，提示血漿β-EP可間接影響肺水腫。

NF-κB由兩個(gè)屬于Rel家族的亞單位組成，以同二聚體或異二聚體形式存在。當(dāng)各種刺激因素激活靶細(xì)胞，使NF-κB抑制蛋白被磷酸化、泛素化，解離而釋放出游離的NF-κB，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與靶基因啟動子特異性序列結(jié)合，激活其高表達(dá)[8]，可以啟動多種炎性反應(yīng)[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)，ARDS組、納洛酮組的肺組織NF-κB陽性表達(dá)率較對照組明顯升高，提示NF-κB參與了ARDS發(fā)病過程。相關(guān)分析表明，NF-κB陽性細(xì)胞表達(dá)率與左肺濕/干重比值、血漿β-EP呈正相關(guān)，提示NF-κB啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，激活中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，能間接影響肺部炎癥，影響β-EP釋放，進(jìn)一步加重肺水腫。

納洛酮為特異性嗎啡受體拮抗劑，為內(nèi)源、非特異性阿片受體阻斷劑，脂溶性高并迅速分布全身，尤以腦、肺、腎和心臟中濃度較高。本研究顯示，早期應(yīng)用納洛酮的大鼠，左肺W/D、血漿β-EP水平一定程度降低，肺泡上皮細(xì)胞NF-κB活性一定程度被抑制，鏡下見納洛酮組病理改變明顯減輕。其機(jī)制可能為：納洛酮可抑制機(jī)體全身炎癥反應(yīng)，并通過抑制巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集和內(nèi)流到肺組織，穩(wěn)定溶酶體膜，改善微循環(huán)，降低腫瘤壞死因子水平[11，12]，減少β-EP生成，遏制鈣離子內(nèi)流、活性氧釋放以及脂質(zhì)過氧化，抑制體內(nèi)細(xì)胞因子及花生四烯酸代謝物生成和血小板聚集，保護(hù)肺細(xì)胞膜，減輕組織細(xì)胞損傷，降低肺血管通透性，從而減輕肺水腫。

綜上所述，納洛酮可抑制血漿β-EP升高和肺組織NF-κB激活，減輕ARDS大鼠肺組織炎癥反應(yīng)，減輕肺間質(zhì)、肺泡水腫，對油酸所致的大鼠ARDS有一定的治療作用。

[1] Dushianthan A, Grocott MP, Postle AD, et al. Acute respiratory distress syndrome and adute lung injury[J]. Postgrad Med J, 2011,87(1031):612-622.

[2] 《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南(2006)》工作組.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷和治療指南(2006)[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2007,16(4):243-349.

[3] Villar J, Blanco J, Anon JM, et al. ALIEN Network：the ALIEN study：incidence and outcome of acute respiratory distress syndrome in the era of lung protective ventilation[J]. Intensive Care Med, 2011,37(12):1932-1941.

[4] Dushianthan A, Cusack R, Goss V, et al. Clinical review: exogenous surfactant therapy for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome--where do we go from here[J]. Crit Care, 2012,16(6):238.

[5] Ranieri VM, Rubenfeld GD, Thompson BT, et al. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin Definition[J]. JAMA, 2012,307(23):2526-2533.

[6] 李復(fù)雄,王曉川,王自財(cái),等.急性重度一氧化碳中毒時(shí)血漿β-內(nèi)啡肽變化及納洛酮治療效果評價(jià)[J].嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志,2004,9(1):16-17.

[7] Kwon DJ, Bae YS, Ju SM, et al. Casuarinin suppresses TNF-α-induced ICAM-1 expression via blockade of NF-κB activation in HaCaT cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,409(4):780-785.

[8] Xiao M, Zhu T, Zhang W, et al. Emodin ameliorates LPS-induced acutelung injury, involving the inactivation of NF-κB in mice[J]. Int J Mol Sci, 2014,15(11):19355-19368.

[9] 金明根,崔青松,孟繁平,等.納絡(luò)酮對油酸型ARDS大鼠的治療作用[J].山東醫(yī)藥，2008,48(1):55-56.

[10] 楊逢永.戊乙奎醚聯(lián)合低分子肝素鈣輔助治療急性呼吸窘迫綜合征效果觀察[J].山東醫(yī)藥,2012,52(1):55-56.

[11] Wollemann M, Benyhe S. Non-opioid action of opioid peptides[J].Life Sci, 2004,75(3):257-270.

[12] 房樹娟,加孜那·托哈依.納洛酮的作用機(jī)制及其在呼吸系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用[J].國際呼吸雜志,2009,29(13):812-815.

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字2012-D14)。

金明根(E-mail: jinmg@ybu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.010

R563.8

A

1002-266X(2016)22-0031-03

2016-02-19)