王耀煒，王惠芳

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，西安710038)

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慢性阻塞性肺疾病合并認知功能障礙患者外周血單核細胞TREM2表達及意義

王耀煒，王惠芳

(西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，西安710038)

目的觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并不同程度認知功能障礙患者外周血單核細胞(PBMC)中髓系細胞觸發(fā)受體2(TREM2)表達水平，并探討其臨床意義。方法選擇COPD穩(wěn)定期患者81例，其中無認知障礙19例(A組)，輕度認知障礙22例(B組)，中度認知障礙21例(C組)，重度認知障礙19例(D組)。分別采用RT-PCR法和流式細胞儀檢測PBMC中的TREM2 mRNA及蛋白，采用 3.0 T 超導(dǎo)磁共振成像系統(tǒng)測定雙側(cè)海馬總體積。結(jié)果TREM2 mRNA及蛋白表達量A組0.05。相關(guān)性分析顯示，TREM2 mRNA及蛋白表達均與雙側(cè)海馬總體積呈負相關(guān)(r分別為-0.582、-0.463，P均<0.05)。結(jié)論COPD合并不同程度認知功能障礙患者PBMC中TREM2表達增加，其可能在COPD患者發(fā)生認知障礙的過程中起重要作用。

慢性阻塞性肺疾?。徽J知障礙；髓系細胞觸發(fā)受體2；外周血單核細胞；海馬體積

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣道慢性炎癥為核心并伴有全身炎癥反應(yīng)的氣流受限不完全可逆的常見肺部疾病。研究顯示，COPD患者存在明顯的認知功能障礙，且隨著肺功能的惡化認知障礙程度進一步加重，嚴重者可發(fā)展至阿爾茨海默病(AD)[1]。髓系細胞觸發(fā)受體2(TREM2)是新近發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族受體，多表達于單核巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞等。最近研究表明，TREM2過度表達可增加AD發(fā)病風(fēng)險，與編碼TREM2的基因突變相關(guān)[2]。人的海馬是雙側(cè)結(jié)構(gòu)，位于大腦半球內(nèi)，與注意力、記憶力等認知功能密切相關(guān)。既往對COPD合并認知障礙患者外周血單核細胞(PBMC)是否表達TREM2，以及其表達變化是否與認知障礙相關(guān)的研究報道較少。本研究觀察了TREM2基因在COPD合并認知障礙患者PBMC中的表達及規(guī)律，初步探討其作用機制，為防治COPD合并認知功能障礙奠定基礎(chǔ)。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2013年1月～2015年3月西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的COPD穩(wěn)定期患者81例，男74例、女7例，年齡68～85(71.5±6.0)歲，病程(24.5±6.0)年。入選標準：①符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會2007 年制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》中的診斷標準。②病情穩(wěn)定，無急性感染。③高中以上文化程度。④排除腦重要部位(額葉、顳葉)梗死，甲狀腺功能低下，嚴重軀體疾病或精神類疾病、慢性酒精中毒、肺性腦病、嚴重肝病、肝性腦病、低血糖反應(yīng)、糖尿病酮癥等與認知障礙相關(guān)的疾病。就診當(dāng)日簡易精神智能評定量表(MMSE)評估，無認知障礙(MMSE≥27)19例(A組)，輕度認知障礙(21≤MMSE<27)22例(B組)；中度認知障礙(10≤MMSE<20)21例(C組)，重度認知障礙(MMSE<9)19例(D組)。4組臨床資料具有可比性，入選者均知情同意。

1.2PBMC的分離采集受試者清晨空腹肘靜脈血3 mL，加入單核細胞分離液，參照文獻[3]方法提取PBMC。

1.3PBMC中TREM2 mRNA檢測采用RT-PCR法。按試劑盒說明書提取總RNA，測定總RNA的濃度和純度，使A260/A280值>1.8后行一步法cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取cDNA 4 μL配制PCR反應(yīng)溶液，依次加入模板引物和Tap酶至總反應(yīng)體系20 μL，置于PCR擴增儀上進行PCR反應(yīng)。TREM2 mRNA的PCR條件：94 ℃ 2 min，然后94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；擴增片段長度為120 bp。β-actin的PCR條件：94 ℃ 3min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30個循環(huán)；擴增片段長度為123 bp。最后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Marker和各組PCR產(chǎn)物上樣量均為5 μL，得到目的基因和內(nèi)參的條帶；經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描后，以目的基因與內(nèi)參的光密度(OD)值表示TREM2 mRNA的相對表達量。TREM2 mRNA和內(nèi)參β-actin的引物序列由本實驗室設(shè)計，上?；瞪锕竞铣伞REM2 mRNA擴增引物及熒光探針：上游引物為5′-TGGTCAGAGGGCTGGACTGT-3′，下游引物為5′-TCCTGGCTGGACTTAAGCTGTAG-3′，熒光探針為5′-FAM-ATTCTCTCACGTACCTCCGGGTCCAGTG-MGB-3′；β-actin擴增引物及熒光探針：上游引物為5′-AGCGGTTCCGATGCCCT -3′，下游引物為5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′，熒光探針為5′-FAM-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTG-BHQ1-3′。

1.4PBMC中TREM2蛋白檢測采用流式細胞儀(BD公司)檢測，CellQuest軟件分析。首先通過大鼠抗小鼠TREM2多克隆抗體與單核細胞表面TREM2受體蛋白結(jié)合，再用異硫氰酸基熒光素(FITC)標記的山羊抗大鼠IgG二抗與多克隆抗體結(jié)合；上機通過流式細胞儀檢測FITC的量，最后得出平均熒光強度,用此間接表示細胞膜表面TREM2蛋白表達量。

1.5雙側(cè)海馬總體積測算應(yīng)用美國GE公司3.0 T超導(dǎo)磁共振成像系統(tǒng)對入選者進行頭部掃描，在ADM4.4圖像處理工作站分析測算雙側(cè)海馬總體積。為排除顱腔體積對海馬體積大小的影響，根據(jù)公式(Vs=Vp×Cn/Ct)對海馬體積進行標準化處理。其中Vs為標準化后海馬體積，Vp為原始海馬體積，Cn為個體顱腔體積，Ct為全體受試對象顱腔體積。

2　結(jié)果

2.1各組PBMC中TREM2 mRNA及蛋白表達比較TREM2 mRNA及蛋白表達量A組

2.2各組雙側(cè)海馬總體積比較A～D組雙側(cè)海馬總體積分別為(8.36±0.63)、(7.23±0.56)、(4.02±0.34)、(3.86±0.35)cm3，C、D組與A、B組比較P均<0.05，A、B組間與C、D組間比較，P均>0.05。

表1　各組PBMC中TREM2 mRNA及蛋白表達比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

2.3TREM2表達與雙側(cè)海馬總體積的關(guān)系相關(guān)性分析顯示，TREM2 mRNA及蛋白表達均與雙側(cè)海馬總體積呈負相關(guān)(r分別為-0.582、-0.463，P均<0.05)。

3　討論

COPD常呈進行性發(fā)展，主要累及肺臟，也可導(dǎo)致肺外器官的損害，如神經(jīng)系統(tǒng)受損。認知功能損害在COPD患者中普遍存在[4]，已經(jīng)成為臨床重點關(guān)注的問題。既往研究認為，缺氧是導(dǎo)致認知功能障礙的首要原因，另外慢性炎癥、二氧化碳潴留、肺功能進行性下降等均可導(dǎo)致認知障礙逐漸加重[5]。認知障礙是癡呆的高危因素。Li等[6]發(fā)現(xiàn)，與普通人相比，COPD患者患老年癡呆癥的概率明顯增加。Villeneuve等[7]發(fā)現(xiàn)，有輕度認知障礙的患者有一半在3年內(nèi)發(fā)展為癡呆。2006年的一項研究表明，認知障礙是COPD患者死亡的獨立危險因素[8]，以慢性缺氧及系統(tǒng)性炎癥為特征的COPD患者或許是AD的一種亞臨床表現(xiàn)。

TREM2是表達于髓系細胞膜表面的先天性免疫受體，屬于免疫球蛋白超家族成員之一。最新研究顯示,TREM2基因突變與多種神經(jīng)退行性疾病存在相關(guān)性。Borroni等[9]報道，TREM2 Q33X、R47H、T66M、S116C等位點在有額顳癡呆的患者中存在明顯突變，而健康人中未發(fā)現(xiàn)。Rosenthal等[10]報道，TREM2參與了老年癡呆癥的發(fā)病過程，與編碼TREM2的基因上的罕見變異相關(guān)。Guerreiro等[11]報道，TREM2在腦組織中廣泛表達，在腦白質(zhì)、海馬和新皮層中呈高表達，而在小腦中呈低表達。

認知是機體認識并獲得知識的加工過程，主要包括學(xué)習(xí)、語言、記憶、思維以及精神情感等一系列心理和社會行為。MMSE量表是目前最常用的認知障礙篩查量表，有較高的敏感性和準確性[12]。人類認知功能的形成非常復(fù)雜，海馬與人類的注意力、記憶力、抽象概括力等認知功能密切相關(guān)[13]。本研究采用3.0 T超導(dǎo)磁共振成像技術(shù)測量COPD合并認知障礙患者雙側(cè)海馬總體積，初步研究外周血單核細胞TREM2表達變化與海馬總體積變化的關(guān)系，為將來此類患者認知障礙的防治提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，TREM2 mRNA及蛋白表達量A組

[1] Dodd JW, Getov SV, Jones PW. Cognitive function in COPD[J]. Eur Respir J, 2010,35(4):913-922.

[2] Pettier C, Wallon D, Rousseau S, et al. TREM2 R47H variant as a risk factor for early-onset Alzheimer′s disease[J]. J Alzheimers, 2013,35(1):45-49.

[3] 韓亞萍,劉源,章莉莉,等.外周血單核細胞的分離方法探討[J].中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志,2003,1(9):780.

[4] Hung WW, Wisnivesky JP, Siu AL, et al. cognitive decline among patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Resp Crit Care Med, 2009,180(2):134-137.

[5] Georqia A, Filippos V, Konstantinos M. Effects of chronic obstructive pulmonary disease and obstructives leepapneaon cognitive functions:evidence for a common nature[J]. Slep Disord, 2014,12(2):276-297.

[6] Li CH, Chen WC, Liao WC, et al. The association between chronic obstructive pulmonary disease and Parkinson′s disease: a nationwide populationbased retrospective cohort study[J]. QJM, 2015,108(1):39-45.

[7] Villeneuve S, Massoud F, Bocti C, et al. The Nature of episodic memoy deficits in MCI with and without a scularburden[J]. Neuropsychologia, 2011,49(11):3027-3035.

[8] Kryscio JR, Schmitt FA, Salazar JC, et al. Risk factors for transitions from normal tomild cognitive impairment and dementia[J]. Neurology, 2006,66(6):828-832.

[9] Borroni B, Ferrari F, Galimberti D, et al. Heterozygous TREM2 mutations in frontotemporal dementia[J]. Neurobiol Aging, 2014,35(4):934.

[10] Rosenthal SL, Bamne MN, Wang X, et al. Mutations in TREM2 increase the risk for Alzheimer′s disease and other neurodegenerative disorders[J]. Mol Neurodegener, 2015,10(1):43.

[11] Guerreiro R, Wojtas A, Bras J, et al. TREM2 variants in Alzheimer′s disease[J]. N Engl J Med, 2013,368(2):117-127.

[12] 張明園.精神科評定量表手冊[M].2版.長沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1998:121-188.

[13] 孫彥,王水利.慢性阻塞性肺疾病認知功能研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2010,16(3):392-394.

[14] Cady J, Koval ED, Benitez BA, et al. TREM2 Variant p. R47H as a risk factor for sporadic amyotrophic lateral sclerosis[J]. JAMA Neurol, 2014,71(4):449-443.

[15] Hamerman JA, Jarjoura JR, Humphrey MB, et al. Cutting edge: inhibition of TLR and FcR responses in macrophages by triggering receptor20 expressed on myeloid cells (TREM)-2 and DAP12[J]. J Immunol, 2006,177(4):2051-2055.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.026

R563.9

B

1002-266X(2016)22-0069-03

2016-01-11)