蘇小軍　楊懷鏡　曾　懿　聞　焜

云南省大理州食品藥品檢驗(yàn)所，云南　大理　671000

注： A相為0.2%磷酸水溶液(三乙胺調(diào)pH為7.0)，流動(dòng)相B為甲醇。

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民族醫(yī)藥

白族藥紫金龍的HPLC指紋圖譜研究

蘇小軍楊懷鏡曾懿聞焜

云南省大理州食品藥品檢驗(yàn)所，云南大理671000

【摘要】目的:建立紫金龍藥材HPLC指紋圖譜分析方法，為紫金龍藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法:采用RP-HPLC色譜法，Inertsil ODS-SP(4.6mm×150mm,5μm)色譜柱，以甲醇-0.2%磷酸水溶液(三乙胺調(diào)pH為7.0)為流動(dòng)相梯度洗脫，柱溫35℃，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)采用波長(zhǎng)切換，0～40min為230nm，40～90min切換至285nm，進(jìn)樣量10μl；數(shù)據(jù)使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2012A) 進(jìn)行處理。結(jié)果:在選定的色譜條件下確定10個(gè)峰構(gòu)成紫金龍藥材的特征共有峰，各批次藥材均具有上述特征，但特征峰的相對(duì)含量分布差異導(dǎo)致色譜概貌存在一定差異。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便、精密度高、重現(xiàn)性好，可為紫金龍藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】白族藥；紫金龍；特征圖譜；HPLC

白族藥滋堅(jiān)倫(白語(yǔ)：Zixjieilht)為罌粟科植物紫金龍Dactylicapnosscandens(D.Don) Hutch.的根，別名串枝蓮、碗豆七，夏秋采集其根，曬干后入藥。其味苦、性涼，有毒，具有消炎、止痛鎮(zhèn)痛、止血、降壓的功效，白族民間用于胃痛、神經(jīng)性頭痛、牙痛、外傷腫痛、外傷出血、高血壓等。在我國(guó)西南地區(qū)民間廣泛用于牙痛、神經(jīng)性頭痛、胃痛和止血，臨床表明具有較好的鎮(zhèn)痛作用[1-5]。紫金龍含有多種生物堿，主含普羅托品、異紫堇定等[6-8]。中藥材指紋圖譜是近年來(lái)被國(guó)際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的有效方法，其優(yōu)點(diǎn)在于較全面反映中藥復(fù)雜的化學(xué)成分及其相對(duì)比例。研究采用反相高效液相色譜法建立紫金龍藥材的特征指紋圖譜，為該藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)[9]。

1儀器與材料

1.1儀器安捷倫1200高效液相色譜儀(包括自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD紫外檢測(cè)器、HP 色譜工作站等)；GWA-UN2-C30純水器；CQ-250超聲波清洗儀；島津AND GH-252電子天平。

1.2材料紫金龍藥材經(jīng)大理州食品藥品檢驗(yàn)所楊懷鏡主任藥師鑒定為罌粟科植物紫金龍Dactylicapnosscandens(D.Don)Hutch.的干燥根，所測(cè)樣品見(jiàn)表1;原阿片堿(批號(hào)：110853-200402，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；近視樂(lè)眼藥水(市場(chǎng)抽樣合格制劑)；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱為Inertsil ODS-SP(4.6mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相A相為0.2%磷酸水溶液(三乙胺調(diào)pH為7.0)，B相為甲醇，梯度洗脫，見(jiàn)表2；柱溫：35℃；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～40min波長(zhǎng)為230nm，40～90min切換至285nm；進(jìn)樣量：紫金龍(1～12)進(jìn)樣10μl，原阿片堿對(duì)照品進(jìn)樣5μl，近視樂(lè)眼藥水參照物溶液進(jìn)樣5μl。

2.2對(duì)照品溶液制備精密稱取原阿片堿對(duì)照品5.46mg置10ml量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾后作為對(duì)照品溶液，進(jìn)樣5μl，見(jiàn)圖1；取近視樂(lè)眼藥水2ml用水稀釋至50ml的容量瓶中，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾后作為參照物溶液進(jìn)樣5μl，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。

表1　樣品信息

編號(hào)樣品產(chǎn)地/來(lái)源1紫金龍2013年市場(chǎng)抽樣樣品2紫金龍楚雄州,三月街購(gòu)3紫金龍巍山縣,三月街購(gòu)4紫金龍巍山中廠,課題組采集5紫金龍巍山縣,金貝中藥行購(gòu)6紫金龍怒江州,金貝龍關(guān)藥店購(gòu)7紫金龍洱源縣,金貝中藥行購(gòu)8紫金龍大理市大波清(館藏標(biāo)本)9紫金龍?jiān)讫埧h(館藏標(biāo)本)10紫金龍大理市大波清,課題組采集11紫金龍巍山縣,課題組采集12紫金龍對(duì)照藥材批號(hào):1194-200101,中國(guó)藥品生物制品檢定所13原阿片對(duì)照品批號(hào):110853-200402,中國(guó)藥品生物制品檢定所

表2　梯度洗脫程序

注： A相為0.2%磷酸水溶液(三乙胺調(diào)pH為7.0)，流動(dòng)相B為甲醇。

2.3供試品溶液制備精密稱取60℃干燥至恒重的紫金龍粉末2g(過(guò)40目篩)，置具塞錐形瓶中，加入氨水將其潤(rùn)濕，放置30min，加甲醇和氯仿(1∶1)混合溶液20ml，超聲提取30min，放冷后，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)眉状挤执稳芙?，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣10μl，記錄色譜圖，見(jiàn)圖3。

2.4特征圖譜評(píng)價(jià)方法采用國(guó)家藥典委員會(huì)開(kāi)發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版(2012A)。對(duì)照?qǐng)D譜生成方法為中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.5min，相似度計(jì)算方法為夾角余弦法。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1精密度實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)指紋圖譜，比較各色譜峰的保留時(shí)間，結(jié)果表明6次進(jìn)樣各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.14%～0.38% 之間，相似度在0.990～1 之間，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。

2.5.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批紫金龍藥材6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別檢測(cè)指紋圖譜，結(jié)果表明各共有峰保留時(shí)間RSD在0.12%～0.45%之間，相似度在0.992～0.999之間，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。

2.5.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一批供試品溶液，分別于0、2、4、 8、12、24h 檢測(cè)指紋圖譜，結(jié)果表明各特征峰無(wú)明顯差異，各色譜峰共有峰保留時(shí)間RSD在0.15%～0.44%之間，相似度在0.999～1，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6結(jié)果

2.6.1圖譜測(cè)定時(shí)間的確定取樣品溶液5μl，注入高效液相色譜儀，記錄120min內(nèi)色譜圖，結(jié)果表明，90min 后無(wú)特征峰出現(xiàn)，故確定圖譜記錄時(shí)間為90min。

2.6.2空白實(shí)驗(yàn)取甲醇溶液5μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明，空白無(wú)干擾。

2.6.3樣品特征圖譜測(cè)定取表1中的樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法獲得供試溶液，進(jìn)樣10μl，記錄HPLC色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.6.4共有峰的確定及相似度計(jì)算根據(jù)12批紫金龍藥材特征圖譜的檢測(cè)結(jié)果，按“2.4”項(xiàng)下方法，以紫金龍對(duì)照藥材S12為參照?qǐng)D譜，全譜峰匹配，生成紫金龍藥材對(duì)照特征圖譜(見(jiàn)圖4 R) ，其中共匹配出10個(gè)峰(見(jiàn)圖3)，構(gòu)成紫金龍藥材的特征共有峰。通過(guò)與對(duì)照品圖譜比對(duì)，指認(rèn)4號(hào)峰為原阿片堿峰，6號(hào)峰為近視樂(lè)眼藥水參照物峰。因原阿片堿峰面積適中且峰形穩(wěn)定故以其為參照峰，利用該軟件對(duì)12 批特征圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.15%～0.44% 之間，各批次相似度值高，結(jié)果見(jiàn)表3 所示?？梢钥闯?，12批紫金龍藥材特征圖譜的相似度均>0.9，說(shuō)明不同來(lái)源的紫金龍藥材具有較高的均一性。

表3　12批紫金龍藥材相似度

編號(hào)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12相似度0.9970.9880.9990.9920.9870.9911.0001.0001.0000.9990.9931.000

2.6.5樣品特征圖譜分析由于標(biāo)準(zhǔn)品有限，實(shí)驗(yàn)未對(duì)其他特征峰進(jìn)行指認(rèn)與分析。本實(shí)驗(yàn)測(cè)試樣品包括了不同產(chǎn)地、不同類型(栽培、野生及商品藥材)的紫金龍，其HPLC特征圖譜均具有上述特征峰，相互間吻合較好，可作為紫金龍的特征指紋。

3討論

3.1提取方法的選擇實(shí)驗(yàn)以盡可能多體現(xiàn)紫金龍主要成分為原則，設(shè)計(jì)樣品溶液制備方法。分別選取體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇、甲醇、氯仿為提取溶媒,對(duì)提取物HPLC圖譜分析，但效果都不理想?？赡苁怯捎谧辖瘕堉猩飰A在極性和含量上差異較大，很難用單一的溶媒取得滿意的效果?？紤]堿性條件易于生物堿的溶出，所得峰較多，故比較氨水潤(rùn)濕時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，氨水潤(rùn)濕30min后制備的供試品中峰形最佳。實(shí)驗(yàn)還考察了超聲20、30、40、50min提取效果，結(jié)果提示，超聲提取30min及以上，所得各峰響應(yīng)值較高且無(wú)明顯差異。所以實(shí)驗(yàn)采用加氨水潤(rùn)濕30min后，加20ml甲醇和氯仿(1∶1)混合溶液，超聲提取30min，作為供試液制備方法[10-12]。

3.2流動(dòng)相的選擇實(shí)驗(yàn)考察了多種流動(dòng)相：甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液(三乙胺調(diào)pH至7.0)、甲醇-0.005mol/L磷酸氫二鈉溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至9.0)。結(jié)果表明，甲醇-0.2%磷酸水溶液(三乙胺調(diào)pH至7.0)系統(tǒng)中色譜峰多且峰形較好，所以選擇該流動(dòng)相系統(tǒng)。

實(shí)驗(yàn)中考察了Phenomenex Synergi Polar-RP 80A(250mm×4.6mm，4μm)、CAPCELL PAK C18(150mm×4.6mm，5μm)、Inertsil ODS-SP(4.6mm×150mm，5μm)三根不同廠家的色譜柱，結(jié)果表明采用Inertsil ODS-SP(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱所得圖譜基線平穩(wěn)，色譜峰數(shù)目較多，分離度，峰形好，因此選用該柱進(jìn)行特征圖譜研究。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)及柱溫的選擇實(shí)驗(yàn)從200～400nm內(nèi)挑選了210、230、245、275、285、320、340、370nm 波長(zhǎng)顯示色譜圖，并記錄全譜段三維圖譜。結(jié)果在低波長(zhǎng)色譜段基線不平，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm時(shí)，在40min后色譜峰較為稀疏且特征峰6過(guò)高，此時(shí)將檢測(cè)波長(zhǎng)切換為285nm，得到峰數(shù)較多，同時(shí)解決了特征峰6過(guò)高問(wèn)題，最后結(jié)合三維圖譜，選擇用波長(zhǎng)切換的方法對(duì)其進(jìn)行分析，即0～40min檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，40～90min檢測(cè)波長(zhǎng)為285nm，使色譜峰盡可能得到體現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)比較了四個(gè)不同柱溫下的色譜圖(25、30、35、40℃),發(fā)現(xiàn)隨柱溫上升，各色譜峰變化不明顯，故選擇35℃為指紋圖譜的檢測(cè)柱溫。

3.4特征圖譜相似度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)采用了HPLC 對(duì)紫金龍進(jìn)行分析，各樣品HPLC 特征圖譜雖存在一定差異，但均具有相同的色譜特征峰，所建立的特征圖譜具有穩(wěn)定性和可控性。不同來(lái)源的紫金龍藥材分析結(jié)果可以看出，各色譜峰的保留時(shí)間匹配好，特征峰含量分布差異較大，以全譜峰匹配方式計(jì)算相似度，各批次差異較大，但在選定的色譜條件下以兩個(gè)已知特征峰：特征峰4(原阿片堿)、特征峰6作為多點(diǎn)校正，Mark峰匹配方式計(jì)算相似度，則各批次相似度高，表明紫金龍藥材色譜圖中特征峰4、特征峰6含量穩(wěn)定，其余特征峰含量個(gè)體差異較大。

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HPLC Fingerprint ofDactylicapnosscandentisRadix by the Traditional Bai Medicine

SU XiaoJunYANG HuaijingZENG yiWEN kun

Institute For Food and Drug Control of Dali Prefecture，Dali 671000，China

Abstract:Objective To establish the HPLC fingerprint of Dactylicapnos scandentis radix and to research the quality of Dactylicapnos scandentis radix.Methods The gradient elution and multiple wavelength mode was applied in chromatographic separation,and chromatographic fingerprint similarity evaluation software(2012A) was used to analyse data.Results 10 peaks were identified as the characteristic fingerprints of Dactylicapnos scandentis radix. All samples tested contained the same 10 peaks, but the content of each peak showed great difference among the samples,which resulted in the differences on their chromatograms.Conclusion This method is simple，accurate with good reproducibility，and can be used for the quality control of Dactylicapnos scandentis radix.

Key words:Traditional Bai Medicine；Dactylicapnos Scandentis Radix；Fingerprint；HPLC

(收稿日期：2015.12.27)

【中圖分類號(hào)】R284.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)04-0001-03

作者簡(jiǎn)介：蘇小軍(1981-)，男，主管中藥師，主要從事藥品檢驗(yàn)及民族藥研究。E-mail:276595451@qq.com

基金項(xiàng)目：中國(guó)食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金(2013WA11)。