崔小偉，陳麗琴，周鈞，周莉，王淑珍，張晶

(天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院,天津300270)

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沉默結(jié)締組織生長因子表達(dá)對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖和凋亡的影響

崔小偉，陳麗琴，周鈞，周莉，王淑珍，張晶

(天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院,天津300270)

摘要：目的觀察靶向沉默結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達(dá)對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSC)-T6增殖、凋亡的影響。方法 將HSC-T6細(xì)胞隨機(jī)分為3組，A、B組分別轉(zhuǎn)染CTGF siRNA及無義序列4～6 h，C組不轉(zhuǎn)染；培養(yǎng)24 h，采用RT-PCR法檢測CTGF mRNA，MTT法檢測細(xì)胞增殖速度，Annexin V/PI 雙染色法測算細(xì)胞凋亡率，Western blot法檢測細(xì)胞中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白。結(jié)果A組CTGF mRNA表達(dá)量(0.12±0.03)明顯低于B組(0.87±0.07)和C組(0.85±0.09)，細(xì)胞增殖速度(0.21±0.05)明顯慢于B組(0.38±0.04)和C組(0.39±0.05)，細(xì)胞凋亡率(37.5%±0.6%)高于B組(0.9%±0.3%)和C組(1.1%±0.2%)，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量(29.2±0.8，26.4±2.7)均低于B組(66. 7±1.7，64.7±0.9)和C組(68.4±1.7，66.1±2.2)，P均<0.05。結(jié)論 靶向沉默CTGF基因可抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，并顯著減少Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成和分泌。

關(guān)鍵詞：酒精性肝硬化；肝星狀細(xì)胞；結(jié)締組織生長因子；小干擾核糖核酸；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

近年來，酒精性肝硬化病死率呈上升趨勢[1～5]。目前，除早期預(yù)防以外，對(duì)酒精性肝硬化患者尚無有效治療手段。以往研究發(fā)現(xiàn)過多的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積于肝臟就會(huì)形成肝纖維化，活化的肝星狀細(xì)胞(HSC)是合成ECM的主要來源，在肝纖維化形成過程中起重要作用[6～8]，各種促肝纖維化細(xì)胞因子也可通過調(diào)控HSC參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。結(jié)締組織生長因子(CTGF)是一種非結(jié)構(gòu)性基質(zhì)蛋白，能直接介導(dǎo)HSC的活化、合成和分泌ECM[9,10]。小干擾RNA(siRNA) 是基因靶向敲除的新型生物技術(shù)。2011年11月～2013年10月，我們通過構(gòu)建CTGF特異性的siRNA并轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，觀察下調(diào)CTGF水平對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料HSC-T6細(xì)胞株購自上海腫瘤研究所；CTGF siRNA質(zhì)粒由武漢晶賽生物技術(shù)有限公司合成，Lipofectamine 2000(美國Invitrogene公司)；抗CTGF、Ⅰ和Ⅲ型膠原抗體(美國Chemicon公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；胎牛血清(杭州四季青公司)，改良Eagle培養(yǎng)基DMEM、青鏈霉素和胰蛋白酶(Gibco公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將HSC-T6細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM中，于飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵箱。隔日換液，每3～4 d傳代1次。取生長良好的HSC-T6細(xì)胞，用無血清DMEM清洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組。A、B組分別采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染CTGF siRNA及無義序列，C組不轉(zhuǎn)染；于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，加胎牛血清終止轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2細(xì)胞CTGF mRNA檢測采用RT-PCR法。應(yīng)用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30 次。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以2-ΔΔCT法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3細(xì)胞增殖觀察 采用MTT 法。將各組細(xì)胞接種于 96 孔板，1×104/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，于培養(yǎng)第1、2、3、4、5、6 、7天行MTT檢測；在酶標(biāo)儀上測定各孔波長570 nm時(shí)的光密度(OD)值，繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞增殖速度。細(xì)胞增殖速度=(第7天OD值-第1天OD值)/第1天OD值。

1.2.4細(xì)胞凋亡率測算 采用Annexin V/PI 雙染色法。消化、收集各組細(xì)胞，PBS重懸，在流式細(xì)胞儀(FACS Caliber，USA)上檢測。按照Annexin V/PI 染色試劑盒說明，加入固定破膜劑和 PI染液；室溫避光反應(yīng) 30 min后，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白檢測 采用Western blot法。提取各組細(xì)胞總蛋白，以Bradford 法行蛋白定量；用8%分離膠電泳，冰浴下100 V轉(zhuǎn)膜60 min。分別加抗Ⅰ型膠原(1∶1 000)和抗Ⅲ型膠原(1∶1 000)抗體，4 ℃下水平搖床孵育過夜。次日用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育1 h，以凝膠成像分析系統(tǒng)檢測OD值，以Quantity One分析軟件進(jìn)行定量分析。以目的蛋白與β-actin的OD值比值作為目的蛋白表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1各組細(xì)胞CTGF mRNA表達(dá)比較A組細(xì)胞CTGF mRNA表達(dá)量(0.12±0.03)明顯低于B組(0.87±0.07)和C組(0.85±0.09)，P均<0.05。

2.2各組細(xì)胞增殖速度比較A組細(xì)胞增殖速度(0.21±0.05)明顯慢于B組(0.38±0.04)和C組(0.39±0.05)，P均<0.05。

2.3各組細(xì)胞凋亡率比較A組細(xì)胞凋亡率(37.5%±0.6%)高于B組(0.9%±0.3%)和C組(1.1%±0.2%)，P均<0.01。

2.4各組細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)比較A組細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)量(29.2±0.8，26.4±2.7)均低于B組(66.7±1.7，64.7±0.9)和C組(68.4±1.7，66.1±2.2)，P均<0.01。

3討論

CTGF是在人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的，因能刺激纖維母細(xì)胞DNA合成并促進(jìn)趨化作用而得名。研究表明，CTGF是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化過程中的刺激因子，同時(shí)還涉及多個(gè)環(huán)節(jié)[11,12]。CTGF表達(dá)上調(diào)被認(rèn)為是HSC活化的中心通路，阻斷CTGF基因表達(dá)具有減少ECM合成及抑制肝纖維化進(jìn)展的效果。文獻(xiàn)報(bào)道，在慢性肝病患者及實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠中，肝組織CTGF基因表達(dá)水平均明顯增高，并與肝纖維化病理學(xué)分級(jí)呈正相關(guān)，提示CTGF可能在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中起重要作[3]。目前肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是肝組織活檢，但因是有創(chuàng)檢查具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，肝纖維化患者血清CTGF水平增高，而肝硬化患者反而升高不明顯[13]。因此，CTGF作為一項(xiàng)無創(chuàng)的檢查，在肝纖維化的檢測和治療上應(yīng)用前景廣泛。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，siRNA能高效特異性地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，促進(jìn)RNA降解，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因敲除的作用[14]?；瘜W(xué)合成的siRNA 可在哺乳動(dòng)物體內(nèi)外介導(dǎo)同源基因的沉默，從而發(fā)揮治療作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTGF siRNA序列可降低HSC-T6細(xì)胞CTGF表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)下降，表明沉默CTGF基因?qū)τ诰凭愿卫w維化的發(fā)展可能有一定的抑制作用。我們將構(gòu)建大鼠酒精性肝硬化模型，對(duì)進(jìn)展期肝纖維化行siRNA干預(yù)治療，進(jìn)一步評(píng)價(jià)CTGF在酒精性肝硬化中的治療作用。

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(收稿日期：2015-09-02)

中圖分類號(hào)：R575

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)10-0027-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.010

基金項(xiàng)目：天津市濱海新區(qū)衛(wèi)生局醫(yī)藥衛(wèi)生科技資助項(xiàng)目(2011BHKY020)。