湯南,萬潔,陳博,張媛,陳鴻鵬

(1廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東東莞 523808； 2廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院；3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院；4廣東醫(yī)科大學(xué)信息工程學(xué)院)

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·基礎(chǔ)研究·

紫杉醇、多西紫杉醇對(duì)大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A細(xì)胞縫隙連接功能的影響

湯南1,萬潔2,陳博2,張媛3,陳鴻鵬4

(1廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東東莞 523808； 2廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院；3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院；4廣東醫(yī)科大學(xué)信息工程學(xué)院)

目的觀察紫杉醇、多西紫杉醇對(duì)大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A細(xì)胞縫隙連接(GJ)功能的影響。方法采用磺酰羅丹明B比色法篩選紫杉醇和多西紫杉醇不影響B(tài)RL-3A細(xì)胞生長的作用濃度。采用細(xì)胞接種熒光示蹤法與劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)檢測紫杉醇與多西紫杉醇作用BRL-3A后細(xì)胞GJ功能。結(jié)果篩選出的紫杉醇、多西紫杉醇藥物濃度均為0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L。與溶劑對(duì)照組相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L紫杉醇處理的BRL-3A細(xì)胞Calcein熒光傳遞率降低(P均<0.05)，多西紫杉醇處理的BRL-3A細(xì)胞Calcein熒光傳遞率無明顯變化。與溶劑對(duì)照組相比，紫杉醇作用細(xì)胞后LY向鄰近細(xì)胞傳遞距離縮短，多西紫杉醇作用細(xì)胞后LY向鄰近細(xì)胞傳遞距離無明顯變化。結(jié)論紫杉醇可顯著抑制大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A細(xì)胞GJ功能，而多西紫杉醇則不影響GJ功能。

紫杉醇；多西紫杉醇；細(xì)胞縫隙鏈接；肝細(xì)胞株；BRL-3A細(xì)胞

細(xì)胞縫隙連接(GJ)是相鄰細(xì)胞間進(jìn)行直接信號(hào)與物質(zhì)交流的膜通道，由連接蛋白(Cx)組成。6個(gè)Cx亞單位環(huán)行排列組成一個(gè)“連接子”，其中心形成一個(gè)孔道[1]。相鄰細(xì)胞膜上的兩個(gè)“連接子”對(duì)接后組裝為一個(gè)GJ通道，分子量﹤1～2 kDa的小分子或第二信使等物質(zhì)可通過GJ在毗鄰細(xì)胞間擴(kuò)散、傳遞和轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。GJ所介導(dǎo)的細(xì)胞間直接接觸的通信方式是細(xì)胞生物學(xué)行為的重要調(diào)控形式，在細(xì)胞的新陳代謝、增殖分化、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等生理過程中發(fā)揮重要作用。紫杉烷類抗腫瘤藥物——紫杉醇與多西紫杉醇是目前臨床上廣泛使用的一類廣譜化療藥，對(duì)乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌及非小細(xì)胞肺癌等有較好的療效。但作為細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，它們在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞及組織器官也有一定的損害，其中對(duì)肝臟的損傷引起研究人員越來越多的關(guān)注[3～6]。肝細(xì)胞中分布較多的GJ，觀察紫杉醇與多西紫杉醇對(duì)肝細(xì)胞GJ連接功能的影響，可為紫杉烷類抗腫瘤藥物肝損傷的研究提供參考。

1　材料與方法

1.1試劑、儀器及細(xì)胞株紫杉醇與多西紫杉醇(Sigma-Aldrich公司)；Calcein-AM及CM DiI(Invitrogen公司)；熒光黃(LY，Sigma-Aldrich公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基，新生牛血清，0.25%胰酶和青-鏈霉素(Gibco公司)；其他試劑均為常用分析純。酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，IX51熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。實(shí)驗(yàn)所用大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A購自ATCC。

1.2紫杉醇、多西紫杉醇給予方法及其對(duì)BRL-3A細(xì)胞GJ功能的影響采用磺酰羅丹明B比色法(SRB法)對(duì)紫杉醇、多西紫杉醇的劑量(不引起細(xì)胞毒性)進(jìn)行篩選，確定合適藥物濃度均為0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L。采用以下兩種方法觀察紫杉醇、多西紫杉醇對(duì)BRL-3A細(xì)胞GJ功能的影響。①細(xì)胞接種熒光示蹤法：將BRL-3A細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞生長融合后，分別加入0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L的紫杉醇和0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L多西紫杉醇作用1 h，同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照組(采用溶劑處理BRL-3A細(xì)胞)。取其中一孔空白細(xì)胞加入熒光指示劑Calcein-AM孵育30 min，作為“供體細(xì)胞”。胰酶消化收集熒光標(biāo)記好的“供體細(xì)胞”，接種到已生長融合的其他孔BRL-3A細(xì)胞(“接受細(xì)胞”)上,培養(yǎng)4 h。用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)1個(gè)“供體細(xì)胞”周圍含有Calcein的“接受細(xì)胞”數(shù)，與溶劑對(duì)照組比較，計(jì)算Calcein熒光傳遞率。②劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)：將BRL-3A細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長融合后，加入1.0 μmol/L的紫杉醇和1.0 μmol/L的多西紫杉醇作用1 h，同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照組(采用溶劑處理BRL-3A細(xì)胞)，吸去6孔板中的培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入300 μL 0.5% LY，用手術(shù)刀片迅速做一劃痕，將6孔板避光孵育3 min，PBS洗3次后熒光顯微鏡下觀察LY的傳輸距離。

2　結(jié)果

與溶劑對(duì)照組相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L紫杉醇處理的BRL-3A細(xì)胞Calcein熒光傳遞率降低(P均<0.05)，分別為82.48%±4.75%、80.20%±5.09%、78.90%±7.74%和73.75%±9.85%。與溶劑對(duì)照組相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L多西紫杉醇處理的BRL-3A細(xì)胞Calcein熒光傳遞率分別為100.67%±1.00%、102.35%±3.93%、96.40%±6.60%、94.12%±10.51%。與溶劑對(duì)照組相比，紫杉醇作用細(xì)胞后LY向鄰近細(xì)胞傳遞距離縮短(約4層)，多西紫杉醇作用細(xì)胞后LY向鄰近細(xì)胞傳遞距離無明顯變化(約7層)。

3　討論

抗腫瘤藥物所致肝損傷在所有藥物性肝損傷中占很大比重。紫杉醇和多西紫杉醇是目前公認(rèn)的對(duì)多種腫瘤具有確切療效的廣譜化療藥物，肝臟是二者代謝的主要臟器，該類藥物導(dǎo)致的肝損傷將不可避免地直接干擾其體內(nèi)代謝過程，從而影響療效發(fā)揮。目前，關(guān)于紫杉醇和多西紫杉醇引起肝損傷的機(jī)制研究僅有較少的報(bào)道，主要認(rèn)為是與ROS自由基等有害物質(zhì)引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[7,8]。

GJ是相鄰細(xì)胞間形成的一種可以開放和關(guān)閉的膜通道結(jié)構(gòu)，GJ通信是生物體內(nèi)細(xì)胞之間直接的信息交流，小分子物質(zhì)及某些信號(hào)分子可以通過GJ在細(xì)胞間傳遞。GJ廣泛存在于實(shí)質(zhì)性臟器組織(如肝臟、心臟、腎臟、肺等)中。組成GJ的Cx目前在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)有21種[1]，Cx依據(jù)其分子量進(jìn)行命名。不同Cx組成的GJ通道對(duì)物質(zhì)和信號(hào)的傳遞具有選擇通透性。ATP和谷氨酸易于通過Cx43通道，而三磷酸肌醇和腺苷則易通過Cx32通道[9～11]。這種選擇通透性與GJ調(diào)節(jié)的生理功能有關(guān)，GJ通道功能改變將影響細(xì)胞之間的正常通信，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。研究[12～14]證實(shí)GJ異常與腫瘤、血栓、癲癇等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。在大多數(shù)腫瘤的形成階段常伴隨著GJ功能的降低或消失，改善或恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的GJ功能可增強(qiáng)順鉑、奧沙利鉑等抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性[15]。這可能與GJ介導(dǎo)的“損傷信號(hào)”傳遞有關(guān)。

肝細(xì)胞中富含Cx32組成的GJ[16～18]，由于GJ在物質(zhì)和信號(hào)傳遞中的重要調(diào)節(jié)作用，近年來GJ與藥物性肝損傷的關(guān)系引起研究人員的關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，在不引起細(xì)胞毒性的條件下，紫杉醇抑制肝細(xì)胞的GJ功能，而多西紫杉醇對(duì)此GJ功能則無明顯影響。兩藥顯示出的不同作用，將可能體現(xiàn)出信號(hào)分子在肝細(xì)胞間傳遞的差異性，這為二者肝損傷的研究提供了新的方向。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81400619)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(A2014472，A2013428)。

陳鴻鵬(E-mail： chenhpgdmc@foxmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.009

R73

A

1002-266X(2016)23-0031-03

2015-11-26)