胥軍，叢支亮，郭亮，牛學(xué)才，閆召華

(1濟(jì)南市槐蔭人民醫(yī)院，濟(jì)南 250021；2濟(jì)南市第四人民醫(yī)院)

?

乳腺癌患者外周血GSTM1、GSTT1基因表達(dá)與多西紫杉醇化療效果的關(guān)系

胥軍1，叢支亮2，郭亮2，牛學(xué)才2，閆召華2

(1濟(jì)南市槐蔭人民醫(yī)院，濟(jì)南 250021；2濟(jì)南市第四人民醫(yī)院)

目的觀察乳腺癌患者外周血谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶M1(GSTM1)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶T1(GSTT1)基因表達(dá)與多西紫杉醇化療效果的關(guān)系。方法乳腺癌患者300例，均采用多西紫杉醇化療，Multiplex-PCR檢測患者化療前外周血GSTM1、GSTT1基因，觀察GSTM1、GSTT1基因陽性與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系、患者化療效果及不良反應(yīng)。結(jié)果300例乳腺癌患者GSTM1基因陽性126例，GSTT1基因陽性222例。雌激素受體陽性乳腺癌患者GSTM1基因陽性率較雌激素受體陰性低(P<0.01)，雌激素受體陽性乳腺癌患者GSTT1基因陽性率較雌激素受體陰性低(P<0.05)。GSTM1基因陽性、陰性患者CR+PR分別為50、99例，兩者比較，P<0.05。GSTT1基因陽性、陰性患者CR+PR分別為93、56例，兩者比較，P<0.05。GSTM1基因陽性、陰性患者發(fā)生化療不良反應(yīng)情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GSTT1基因陽性、陰性患者發(fā)生化療不良反應(yīng)情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論乳腺癌GSTM1和GSTT1基因表達(dá)陰性者接受多西紫杉醇化療效果好，且不增加不良反應(yīng)的發(fā)生。

乳腺癌；谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶M1；谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶T1；多西紫杉醇

研究表明，谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶M1(GSTM1)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶T1(GSTT1)基因具有多態(tài)性，與藥物代謝酶的活力改變有關(guān)。多西紫杉醇是廣譜抗腫瘤藥物，對乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、白血病均有效，其中治療乳腺癌、肺癌效果顯著[1]。多西紫杉醇抗腫瘤的療效已經(jīng)得到多項(xiàng)大規(guī)模臨床試驗(yàn)的證實(shí),但不同患者對多西紫杉醇的應(yīng)答差異很大，在接受多西紫杉醇治療的患者中約有10%會發(fā)生過敏反應(yīng)，主要包括中性粒細(xì)胞減少、血紅蛋白減少、惡心嘔吐、疲勞、體液潴留等[2,3]。多西紫杉醇藥物作用過程涉及藥物代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)及作用靶點(diǎn)基因，其中一些遺傳多態(tài)性位點(diǎn)的單獨(dú)作用可能是微弱的，而很多位點(diǎn)的聯(lián)合與累積作用會導(dǎo)致藥物效應(yīng)產(chǎn)生較大差異[4]。不同個體對藥物的敏感性和不良反應(yīng)存在明顯差異，為減少臨床治療的盲目性，實(shí)行個體化給藥，開展多西紫杉醇藥物基因組學(xué)研究及其應(yīng)用非常必要[5]。本研究觀察了乳腺癌患者外周血GSTM1、GSTT1基因表達(dá)與多西紫杉醇化療效果的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2013年1月～2015年8月在濟(jì)南市第四人民醫(yī)院住院的乳腺癌患者300例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后經(jīng)病理形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)確診；采用多西紫杉醇化療；化療前美國東岸癌癥臨床研究合作組織(ECOG)評分0～2分；預(yù)計(jì)生存期>3個月；符合化療的指征和基本要求；知情同意。排除不能耐受化療者，已進(jìn)行化療者，合并其他惡性腫瘤者。年齡40～67(56.9±13.8)歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移212例；TNM分期Ⅰ期62例、Ⅱ期70例、Ⅲ期36例、Ⅳ期132例；浸潤性導(dǎo)管癌238例，浸潤性小葉癌52例，其他10例。

1.2主要儀器及試劑紫外分光光度計(jì)(N2S，上海儀電分析儀器有限公司)；超凈工作臺(AIRTECH，蘇凈集團(tuán)安泰公司)；臺式低溫高速冷凍離心機(jī)(3K3,Sigma,美國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI step one plus，美國)；普通酶標(biāo)儀(DG-3022，美國)；雜交Chamberll(Coming，美國);凝膠成像儀(CapitalBio；中國)；GeneChip?Scanner (Affymetrix，美國)。DNA Blood Kit D3392-01(美國OMEGA公司)；DNA Marker DM500(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；5×TBE Buffer(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；其他試劑均為本地產(chǎn)分析純試劑。

1.3GSTM1、GSTT1基因檢測方法化療前采取外周血5 mL于EDTA抗凝管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?50 μL解凍標(biāo)本至經(jīng)高溫消毒滅菌的1.5 mL離心管，加入250 μL的OB蛋白酶和25 μL的BufferBL，充分混勻。65 ℃水浴，每隔5 min充分混勻1次。加入260 μL無水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)移至套在2 mL收集管的Hibind DNA柱子中，室溫離心(10 000 r/min×2 min)。將收集管轉(zhuǎn)移至干凈的收集管中，加入500 μL的HB Buffer，室溫離心(10 000 r/min×2 min)，棄去濾液。加入700 μL的DNA wash buffer，室溫離心(10 000 r/min×2 min)，棄去濾液，重復(fù)進(jìn)行兩次。于1.5 mL離心管上，加入50 μL 65 ℃預(yù)熱的Elution buffer到柱子中央基質(zhì)上。靜置5 min，室溫離心(10 000 r/min×2 min)，保留洗脫液。采用微量分光光度儀進(jìn)行DNA質(zhì)量鑒定。采用Multiplex-PCR檢測GSTM1和GSTT1基因。GSTM1和GSTT1基因PCR引物由上海西寶生物有限公司合成。GSTM1引物序列：上游5′-GAACTCCCTGAAA-AGCTAAAGC-3′，下游5′-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′。GSTT1引物序列：上游5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3′，下游5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′。以β-globin作為內(nèi)參，其引物序列：上游5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′，下游5′-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min起始模板預(yù)變性，循環(huán)1次；95 ℃ 45 s循環(huán)中模板變性；60 ℃ 20 s退火；72 ℃ 45 min延伸。反應(yīng)共循環(huán)45次。結(jié)果判斷：GSTM1和GSTT1非缺失基因型者的DNA樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后分別產(chǎn)生215、480 bp片段，缺失基因型者無相應(yīng)的擴(kuò)增條帶。

1.4多西紫杉醇化療療效及不良反應(yīng)判斷化療2個療程后，參照實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評定療效：所有目標(biāo)病灶消失，維持4周為CR；基線病灶長徑總和縮小≥30%，維持4周為PR；基線病灶長徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶為PD；基線病灶長徑總和有縮小但未達(dá)PR或有增加但未達(dá)PD為SD。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

300例乳腺癌患者GSTM1基因陽性126例，GSTT1基因陽性222例。雌激素受體陽性乳腺癌患者GSTM1基因陽性率較雌激素受體陰性低(P<0.01)，雌激素受體陽性乳腺癌患者GSTT1基因陽性率較雌激素受體陰性低(P<0.05)，見表1。GSTM1基因陽性、陰性患者CR+PR分別為50、99例，兩者比較，P<0.05。GSTT1基因陽性、陰性患者CR+PR分別為93、56例，兩者比較，P<0.05。GSTM1基因陽性、陰性患者發(fā)生化療不良反應(yīng)情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GSTT1基因陽性、陰性患者發(fā)生化療不良反應(yīng)情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

3　討論

乳腺癌為女性常見惡性腫瘤，其患病率在世界范圍內(nèi)逐年增高，且具有發(fā)病率年輕化的趨勢，是嚴(yán)重威脅婦女健康及生命的主要疾病之一[6]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，乳腺癌患者的預(yù)后不斷改善，生存率不斷提高。多西紫杉醇是一種對乳腺癌很有效的新型化療藥物，已廣泛用于局部晚期以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療，顯著改善了乳腺癌患者的預(yù)后。既往研究發(fā)現(xiàn)了一些多西紫杉醇藥效相關(guān)基因標(biāo)記，但多數(shù)局限于一個或者少數(shù)相關(guān)基因，而多西紫杉醇在體內(nèi)的作用過程涉及到多基因及多因素。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)是一種重要的Ⅱ相解毒酶，它可催化外來化合物與還原型谷胱甘肽結(jié)合，形成的結(jié)合物毒性下降且易于排出體外。因此，在保護(hù)細(xì)胞免受化學(xué)有害物的攻擊方面具有重要的作用[7]。GSTM1和GSTT1是GST家族成員，兩者均對外源性化學(xué)物質(zhì)有解毒的功能，而兩者的純合子缺失變異基因型被證實(shí)失去酶活性[8]。GSTM1基因長約12 950 kb，位于1p13.3，編碼中性的GST-u同工酶，在乳腺、肝臟、腦組織、胃腸組織中均有表達(dá)，是煙草誘導(dǎo)致癌作用的遺傳易感性標(biāo)志物。GSTT1基因長約12 090 kb，位于22q11.2，編碼堿性的GST-θ同工酶，在肝臟和紅細(xì)胞中均有表達(dá)[9]。GSTM1和GSTT1基因表達(dá)產(chǎn)物可防御內(nèi)外源性毒性物質(zhì)對細(xì)胞的損傷[10]。本研究結(jié)果表明，乳腺癌患者GSTM1和GSTT1基因表達(dá)與雌激素受體表達(dá)有關(guān)，GSTT1、GSTM1基因缺失可能降低了雌激素?zé)o活性代謝進(jìn)程。乳腺癌是激素依賴性腫瘤，雌激素的代謝產(chǎn)物可與DNA結(jié)合形成加合物直接引起基因改變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[11]?？梢?，GSTT1、GSTM1基因缺失可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，GSTM1基因陰性患者療效高于GSTM1陽性患者，GSTT1基因陰性患者療效高于GSTT1陽性患者，推測原因?yàn)镚STM1、GSTT1基因缺失導(dǎo)致GST-u同工酶和GST-θ同工酶不能表達(dá)，使多西紫杉醇的有效濃度提高。且本研究發(fā)現(xiàn)GSTM1和GSTT1基因與多西紫杉醇化療不良反應(yīng)均無關(guān)。

表1　　　　GSTM1、GSTT1基因陽性與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

表2　　　　GSTM1、GSTT1基因與多西紫杉醇化療不良反應(yīng)的關(guān)系(例)

綜上所述，乳腺癌GSTM1和GSTT1基因表達(dá)陰性者接受多西紫杉醇化療效果好，且不增加不良反應(yīng)的發(fā)生。

[1] 王健，唐金海，趙建華.紫杉醇相關(guān)代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體基因多態(tài)性與乳腺癌化療反應(yīng)[J].分子診斷與治療雜志，2010，2(1)：63-67.

[2] Yang J, Zeng Y, Zhang C, et al. The prevention of restenosis in vivo with a VEGF gene and paclitaxel co-eluting stent[J]. Biomaterials, 2013,34(6):1635-1643.

[3] 董寧寧，周艷華，吳詠冬.乳腺癌化療的藥理遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23(3)：427-430.

[4] Nam K, Nam HY, Kim PH, et al. Paclitaxel-conjugated PEG and arginine-grafted bioreducible poly (disulfide amine) micelles for co-delivery of drug and gene[J]. Biomaterials, 2012,33(32):8122-8130.

[5] Schneider BP, Gray RJ, Radovich M, et al. Prognostic and predictive value of tumor vascular endothelial growth factor gene amplification in metastatic breast cancer treated with paclitaxel with and without bevacizumab; results from ECOG 2100 trial[J]. Clin Cancer Res, 2013,19(5):1281-1289.

[6] 孫獻(xiàn)甫，劉慧，賀亞寧，等.扶正消癌方治療乳腺癌術(shù)后內(nèi)分泌綜合征50例[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(2)：192-195

[7] Peatson WR, Verachek WR, Xu SJ, et al. Identficiation of class mugultathoine S-transferase genes GSTM1-GSTM5 on human chromosome lp13[J]. Am J Hum Ganet, 1993,53(1):220-233.

[8] Strange RC, Jones PW, Fryer AA. Glutathione S-transferase: Genetics and role in toxicology[J]. Toxicol Lett, 2000,112-113:357-363.

[9] Li C, Long J, Hu X, et al. GSTM1 and GSTT1 genetic polymorphisms and risk of anti-tuberculosis drug-induced hepatotoxicity: an updated meta-analysis[J]. Euro J Clin Microbiol Infect Dis, 2013,32(7):859-868.

[10] Sharma A, Das BC, Sehgal A, et al. GSTM1 and GSTT1 polymorphism and susceptibility to esophageal cancer in high-and low-risk regions of India[J]. Tumour Biol, 2013,34(5):3249-3257.

[11] Ada AO, Kunak SC, Hancer F, et al. Association between GSTM1, GSTT1, and GSTP1 polymorphisms and lung cancer risk in a Turkish population[J]. Mol Biol Rep, 2012,39(5):5985-5993.

濟(jì)南市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201401072)。

閆召華(E-mail： Yanzhaohua70@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.031

R737.9

B

1002-266X(2016)23-0090-03

2015-12-03)