王磊，楊幼生，詹羽，任飛，謝翠，武文藝

(1湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000；2安陸市普愛醫(yī)院)

冠狀動脈慢血流患者血清microRNA-21表達及意義

王磊1，楊幼生2，詹羽1，任飛1，謝翠1，武文藝1

(1湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院，湖北十堰442000；2安陸市普愛醫(yī)院)

目的 檢測冠狀動脈慢血流患者血清microRNA-21(miRNA-21)表達情況，探討其意義。方法 選擇冠狀動脈造影檢查診斷為冠狀動脈慢血流患者42例(慢血流組)、冠狀動脈血流正常者46例(對照組)，二者校正的心肌梗死溶栓試驗(TIMI)血流幀數(shù)分別為(31.47±2.86)、(20.71±1.96)幀。采用熒光定量PCR法檢測兩組血清miRNA-21相對表達量，分析慢血流組血清miRNA-21相對表達量與TIMI血流幀數(shù)的關(guān)系，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析血清miRNA-21相對表達量對冠狀動脈慢血流的診斷價值。結(jié)果 慢血流組及對照組血清miRNA-21相對表達量分別為3.83±1.03、2.01±0.54，兩組比較P<0.01。慢血流組TIMI血流幀數(shù)與miR-21表達呈正相關(guān)(r=0.646，P<0.01)。miRNA-21診斷冠狀動脈慢血流的ROC曲線下面積(AUC)為0.886(95%CI:0.819～0.953)，特異性為82.61%、敏感性為78.57%。結(jié)論 冠狀動脈慢血流患者血清miRNA-21相對表達量增加，血清miRNA-21可作為早期診斷冠狀動脈慢血流的指標。

冠狀動脈慢血流；microRNA-21；冠狀動脈造影；校正的心肌梗死溶栓試驗

冠狀動脈(簡稱冠脈)慢血流指除外嚴重的冠脈狹窄、痙攣、氣體栓塞、溶栓治療后、冠脈成形術(shù)后、冠脈擴張、心肌病、瓣膜病、結(jié)締組織病等因素，冠脈造影顯示管腔無明顯狹窄，但對比劑到達血管遠端的時間明顯延遲的現(xiàn)象[1]。冠脈慢血流患者常表現(xiàn)為胸痛反復發(fā)作，也可伴有心肌梗死、室性心動過速、室顫等[2]。但至今其確切發(fā)病機制仍未完全明確，且常規(guī)的冠脈造影不易發(fā)現(xiàn)早期血管壁病變。研究表明，microRNA-21(miRNA-21)在心臟組織和細胞中高表達，并與急性心肌梗死、心肌細胞凋亡、動脈粥樣硬化、心房纖維化等密切相關(guān)[3～6]。本研究檢測冠脈慢血流患者血清miRNA-21表達情況，探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1～10月在十堰市人民醫(yī)院經(jīng)橈動脈路徑行冠脈造影檢查患者968例，采用校正的心肌梗死溶栓試驗(TIMI)血流記幀法(cTFC)定量檢測冠脈血流[7]。最終明確診斷冠脈慢血流42例(慢血流組)，男26例、女18例，年齡(59.7±7.5)歲，BMI 24.8±4.6，HR(70.7±5.9)次/min，高血壓17例、糖尿病16例、血脂紊亂22例，吸煙11例。同期選擇冠脈血流正常者46例(對照組)，男24例、女22例，年齡(61.2±9.2)歲，BMI 25.3±3.3，HR(69.7±6.8)次/min，高血壓16例、糖尿病20例、血脂紊亂24例。兩組性別、年齡、BMI、伴發(fā)病等基本資料具有可比性。觀察組TIMI血流幀數(shù)為(31.47±2.86)幀，其中矯正后的前降支為(27.45±2.08)幀、回旋支為(33.21±3.54)幀、右冠脈為(31.64±3.38)幀；對照組TIMI血流幀數(shù)為(20.71±1.96)幀，其中矯正后的前降支為(19.78±1.36)幀、回旋支為(20.58±2.76)幀、右冠脈為(21.37±2.97)幀；兩組比較P均<0.05。排除有心肌梗死病史、冠脈介入手術(shù)史者，心肌病、瓣膜病、高血壓心臟病、先天性心臟病患者，左心室射血分數(shù)>55%者，冠脈狹窄或擴張、冠脈痙攣及肝、腎功能異常者。

1.2 血清miRNA-21表達檢測 采用Real-time PCR法。兩組均于冠脈造影明確診斷后清晨空腹條件下采用EDTA管抽取外周全血5 mL，室溫下靜置30 min，4 ℃下1 200 g離心15 min，將上層血清吸出移至1.5 mL EP管。所有血清樣本冰上放置，每個樣本取250 μL轉(zhuǎn)移至含有750 μL血清的RNA提取試劑TRI Reagent BD的新EP管中。依照TRI Reagent BD提供的方案提取RNA，RNA質(zhì)量通過分光光度計檢測并定量。每個獲得的RNA沉淀重新懸浮于20 μL DEPC水，置于-80 ℃冰箱。每個待測樣本取500 ng總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，中國大連)合成互補DNA(cDNA)，稀釋4倍后取2 μL作為PCR模板。利用ABI 7500 Real-time PCR儀檢測miRNA-21表達水平，反應體系和程序設(shè)置均參考試劑盒說明書。內(nèi)參基因U6和目的基因miRNA-21的逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR引物均購自廣州市銳博生物科技有限公司。采用2-ΔΔCT法計算miRNA-21相對表達量。Ct數(shù)值為實時熒光反應強度達到設(shè)定閾值時的擴增循環(huán)數(shù)，ΔCt=CtmiRNA-21-CtU6；ΔΔCt=ΔCt慢血流組-ΔCt對照組。繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，分析血清miRNA-21相對表達量對冠狀動脈慢血流的診斷價值。

2 結(jié)果

慢血流組血清miRNA-21相對表達量為3.83±1.03，對照組為2.01±0.54，兩組比較P<0.01。慢血流組TIMI血流幀數(shù)與miRNA-21表達呈正相關(guān)(r=0.646，P<0.01)。以miRNA-21作為生物學指標診斷冠脈慢血流的ROC曲線下面積(AUC)為0.886(95%CI:0.819～0.953)，以miRNA-21相對表達量為2.515為截點，其診斷特異性為82.61%、敏感性為78.57%。

3 討論

自1972年Tambe等首次報道冠脈慢血流以來，國內(nèi)外對其發(fā)病機制的研究逐漸增多，但其確切發(fā)生機制尚未明確。目前認為，其發(fā)生與微血管病變、內(nèi)皮功能障礙、冠脈粥樣硬化、血小板形態(tài)和功能異常、炎癥反應、氧化應激、血管炎等有關(guān)，并普遍認為內(nèi)皮功能障礙、冠脈粥樣硬化及其導致的微循環(huán)病變在冠脈慢血流的發(fā)生中起重要作用[9]。內(nèi)皮受損是動脈粥樣硬化發(fā)生的啟動因素，可使動脈粥樣硬化脂質(zhì)沉積物集中在血管壁，導致血管外彈力膜擴張，形成離心性病變，但血管有效腔并未減小，故冠脈造影不能發(fā)現(xiàn)血管腔狹窄，盡管此時血管已有病變。因此，常規(guī)的冠脈造影不易發(fā)現(xiàn)冠脈慢血流患者早期血管壁病變。Cin等[10]研究發(fā)現(xiàn)，冠脈慢血流患者冠脈造影時未見明顯狹窄或不規(guī)則，但血管內(nèi)超聲顯示冠脈平均內(nèi)膜-中膜厚度、內(nèi)膜-中膜面積均顯著增高，心外膜冠脈存在彌漫性或局限性鈣化。但血管內(nèi)超聲設(shè)備昂貴、操作復雜，在臨床上推廣應用困難大。

miRNA是內(nèi)源性的非編碼小RNA，由22～23個核糖核苷酸組成，負向調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達，約60%的人類基因受miRNA調(diào)控[11]。miRNA存在于多種體液中，包括血漿與血清，細胞外循環(huán)miRNA可以多種不同形式存在，如微囊泡、外來體、凋亡小體等。miRNA可與一些蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物，如Ago2、核仁磷酸蛋白、LDL、HDL，使miRNA具有穩(wěn)定性好、不易降解的特性[12]。Chen等[13]報道，miRNA-17-5p診斷冠心病具有較好的敏感性和特異性，miRNA-17-5p可能在冠脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。Cengiz等[14]發(fā)現(xiàn)，頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度(CIMT)增加的高血壓患者血清miRNA-21水平較正常對照者升高近4倍。CIMT是早期動脈粥樣硬化病變的標志，與心腦血管事件的發(fā)生密切相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21參與內(nèi)皮細胞中NO通路激活。Sabatel等[15]研究發(fā)現(xiàn)，血流剪切力的增加會誘導miRNA-21表達，且在肺動脈高壓的血管中檢測到miRNA-21高表達。內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞的重要表型改變。miRNA-21表達增加亦可導致內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Kumarswamy等[16]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠左心室壓力超負荷亦會增加miRNA-21表達，而miRNA-21拮抗劑則可阻斷上述效應。本研究結(jié)果顯示，慢血流患者血清miRNA-21相對表達量較對照組明顯升高，提示miRNA-21在慢血流的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有一定作用。本研究進一步分析顯示，慢血流組TIMI血流幀數(shù)與miRNA-21表達呈正相關(guān)；以miRNA-21相對表達量為2.515為截點，其診斷慢血流的特異性為82.61%、敏感性為78.57%；因此，初步推測miRNA-21可以作為診斷慢血流患者的生物學指標。

總之，冠脈慢血流患者血清miRNA-21相對表達量增加，miRNA-21表達變化可能參與了冠脈慢血流的發(fā)生；血清miRNA-21可作為早期診斷冠狀動脈慢血流的指標。

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湖北省教育廳科學技術(shù)研究項目(Q20152104)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.024

R541.4

B

1002-266X(2016)28-0068-03

2015-11-20)