葉園英，黃煜，顏莉莉，趙淑萍，張磊，劉倩倩

(1青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266000；2青島大學)

?

·基礎(chǔ)研究·

人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

葉園英1,2，黃煜1,2，顏莉莉2，趙淑萍1,2，張磊1，劉倩倩1,2

(1青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266000；2青島大學)

目的 建立人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型。方法 培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa，制成腫瘤細胞懸液，于裸鼠(10只)右側(cè)肩胛背部皮下注射，每只裸鼠注射約1×107個細胞。接種后每日觀察裸鼠精神、活動、飲食、排便等狀況及是否有腫瘤生長、腫瘤生長速度等。以接種部位可見或觸及腫瘤小結(jié)節(jié)為成瘤標準，若第一次移植失敗則考慮行二次瘤細胞接種。發(fā)現(xiàn)腫瘤生長后每3 d計算腫瘤體積。當腫瘤最長徑達15 mm或出現(xiàn)皮膚破潰時，立即處死荷瘤裸鼠；否則于接種第49天將荷瘤裸鼠處死、剝出腫瘤，測量瘤體長徑，稱取瘤體質(zhì)量。取腫瘤組織切片后行HE染色，觀察腫瘤組織病理變化。結(jié)果 有1只裸鼠第一次接種失敗，在第二次接種后移植成功，一次成瘤率為9/10。在接種第40天和第46天各發(fā)現(xiàn)1只裸鼠瘤體表面皮膚破潰，發(fā)現(xiàn)后脫頸處死荷瘤裸鼠，測得腫瘤最長徑分別為12.2、12.6 mm，腫瘤體積分別為505.14、510.30 mm3，腫瘤質(zhì)量分別為0.88、0.86 g；至接種第49天，存活的7只裸鼠移植瘤瘤體表面皮膚完整，無破潰缺損，處死裸鼠后完整剝離腫瘤，測得腫瘤最長徑為11.7～14.0 mm，瘤重0.86～1.23 g。取移植瘤組織進行病理檢查，腫瘤組織大體表現(xiàn)與鏡下表現(xiàn)符合人子宮內(nèi)膜癌的特點。結(jié)論 采用將Ishikawa細胞株接種于裸鼠右側(cè)肩胛皮下的方式成功建立人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，且移植瘤組織和細胞保留了人子宮內(nèi)膜癌的病理特征。

子宮內(nèi)膜癌；Ishikawa細胞株；子宮內(nèi)膜癌移植瘤；動物模型

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，病死率僅次于卵巢癌，發(fā)病率逐年上升[1，2]。子宮內(nèi)膜樣腺癌是子宮內(nèi)膜癌最常見的病理類型，多見于絕經(jīng)后女性[3]。近年來對子宮內(nèi)膜癌的基礎(chǔ)與臨床研究發(fā)展迅速，建立合適的動物模型對研究子宮內(nèi)膜癌生物學行為及進行藥物實驗治療具有重要意義。雖然國內(nèi)外有學者已成功建立子宮內(nèi)膜癌移植瘤動物模型，但各項研究中腫瘤細胞種系的選擇、具體接種數(shù)量或濃度及實驗結(jié)果均有所差異[4～9]。本研究采用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞系瘤細胞懸液接種法構(gòu)建裸鼠子宮內(nèi)膜癌皮下移植瘤模型，方法簡單易于操作，易于對腫瘤進行動態(tài)觀察與記錄?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 SPF級裸小鼠(BALB/c)10只，雌性，4～5周齡，體質(zhì)量16～18 g，飼養(yǎng)條件:SPF級，溫度22～25 ℃，相對濕度為40%～60%，每日光照12 h。有關(guān)實驗程序由青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa購于青島大學附屬醫(yī)院中心實驗室，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基置于 5% CO2、37 ℃孵育箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2 子宮內(nèi)膜癌移植瘤模型的建立 待Ishikawa細胞長至對數(shù)生長期(鋪滿培養(yǎng)瓶底75%～85%)，棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗2次后0.25%胰蛋白酶消化，收集后1 000 r/min離心5 min，適量PBS重懸細胞，取少量做細胞計數(shù)，制成5×107/mL腫瘤細胞懸液，備接種用。無菌條件下抽取瘤細胞懸液于裸鼠右側(cè)肩胛背部皮下注射，每只裸鼠注射0.2 mL(約含1×107個細胞)。接種時注意針頭于皮下潛行1 cm左右再注射，注射完畢拔出針頭，囑助手用無菌棉棒輕摁注射點，避免瘤細胞從針孔漏出。

1.3 裸鼠生活情況及腫瘤生長情況觀察 裸鼠接種腫瘤細胞后繼續(xù)于SPF級層流室內(nèi)飼養(yǎng)，每天觀察其精神、活動、飲食、排便等狀況及是否有腫瘤生長、腫瘤生長速度等。以接種部位可見或觸及腫瘤小結(jié)節(jié)為成瘤標準，若第一次移植失敗后可酌情考慮行二次瘤細胞接種。發(fā)現(xiàn)腫瘤生長后每3 d用游標卡尺測量皮下移植瘤的長徑(a)和短徑(b)，根據(jù)公式腫瘤體積=(a×b2)/2計算腫瘤體積。以接種4周(接種第28天)腫塊最長徑達5 mm為成瘤標準，觀察成瘤情況。當腫瘤最長徑達15 mm或出現(xiàn)皮膚破潰時，立即處死荷瘤裸鼠；否則于接種后第49天將荷瘤裸鼠處死，小心完整剝出腫瘤，用游標卡尺測量瘤體長徑，同時用電子稱稱取瘤體質(zhì)量。

1.4 腫瘤組織病理觀察 腫瘤組織經(jīng)4%甲醛溶液固定48 h后常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，切片后行HE染色，常規(guī)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。光學顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 成瘤情況及腫瘤生長情況 有1只裸鼠第一次接種失敗，在第二次接種后第6天即出現(xiàn)腫瘤小結(jié)節(jié)，移植成功率為100%。Ishikawa細胞接種后各裸鼠注射部位均可見皮下小隆起，略有腫脹、紅斑，質(zhì)軟，至1周左右后可完全吸收消失。腫瘤細胞接種后2周，有9只裸鼠接種部位處可見或觸及腫瘤小結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬。本組成瘤率為9/10。自接種第28天開始，腫瘤體積逐漸增大。在接種第40天和第46天各發(fā)現(xiàn)1只裸鼠瘤體表面皮膚破潰，發(fā)現(xiàn)后脫頸處死荷瘤裸鼠，超凈工作臺上剝出腫瘤，測得腫瘤最長徑分別為12.2、12.6 mm，腫瘤體積分別為505.14、510.30 mm3，腫瘤質(zhì)量分別為0.88、0.86 g；至接種第49天，存活的7只裸鼠移植瘤瘤體表面皮膚完整，無破潰缺損，處死裸鼠后完整剝離腫瘤，測得腫瘤最長徑為11.7～14.0 mm，腫瘤質(zhì)量0.86～1.23 g。

2.2 移植瘤大體觀察及病理檢查 肉眼觀察見移植瘤呈圓形或橢圓形，多數(shù)移植瘤與周圍組織輕度粘連，未侵及皮膚，容易剝離，但其中出現(xiàn)皮膚破潰的兩個移植瘤與瘤體皮膚貼合緊密，已侵及皮膚，剝離時較為困難；腫塊質(zhì)地中等，將瘤體切開，剖面呈灰白色，個別體積較大的移植瘤中央?yún)^(qū)域可見小量膿液樣壞死物流出。光鏡下見腫瘤組織內(nèi)細胞分布致密、排列紊亂，腫瘤細胞大、胞質(zhì)豐富、核大深染、核仁肥大且數(shù)目增多，病理性核分裂象多見。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈上升趨勢，在婦科惡性腫瘤中其病死率僅次于卵巢癌和宮頸癌，單純依靠改進手術(shù)方式和技巧難以提高生存率，尤其是對于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者。而放療和藥物治療效果有一定局限性，且不良反應(yīng)較重。近年來子宮內(nèi)膜癌治愈率的提高主要依賴于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療。子宮內(nèi)膜癌動物模型是探索子宮內(nèi)膜癌的生物學特征、治療方法或評估療效的重要研究工具。

建立子宮內(nèi)膜癌移植瘤動物模型主要包括組織塊移植和子宮內(nèi)膜癌細胞株接種兩種方法。賈玖麗等[10]比較了兩種方法建立子宮內(nèi)膜癌裸鼠模型的效果，證實Ishikawa細胞株接種和移植瘤組織移植均保留了人子宮內(nèi)膜癌的遺傳學特性和生物學特性，成瘤率分別為80%和100%。雖然手術(shù)切除標本移植腫瘤更接近人子宮內(nèi)膜癌的病理和結(jié)構(gòu)特點，但建模周期長、難度大、成瘤率低。盛修貴等[11]進行了14例手術(shù)標本移植，移植成功率僅為42.9%。本實驗選擇4～5周齡裸鼠，此時NK細胞活性低，移植容易成功。我們采用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞系懸液接種法，操作簡單方便，接種部位在裸鼠右側(cè)肩胛背部，易于觀察和測量，同時能避免裸鼠撓抓。

本研究中，9只裸鼠一次移植成功，1只首次接種失敗，我們考慮原因可能與細胞活力降低、細胞接種分散及裸鼠自身因素有關(guān)。由于一次性接種10只裸鼠，處理好的腫瘤細胞不能及時接種于裸鼠體內(nèi)，處于饑餓狀態(tài)的腫瘤細胞活性可能會有所下降。行腫瘤細胞接種時，雖然每只裸鼠的接種細胞量一致，但有個別裸鼠注射后形成的皮丘較大，可能是由于注射的瘤細胞相對較為分散。我們在行二次接種時，接種方法、部位、瘤細胞數(shù)量和濃度均同前，于第二次接種后第6天在接種部位見瘤結(jié)節(jié)，該時間明顯短于第一次接種移植瘤潛伏時間(2周左右)，我們猜想可通過分次接種來縮短成瘤時間，這樣能避免盲目增加接種細胞量或細胞濃度導(dǎo)致裸鼠發(fā)生意外死亡。我們進行第二次接種時裸鼠已達8周齡左右，NK細胞已具有較高活性，但仍能在較短時間內(nèi)成瘤，可能與裸鼠體內(nèi)殘留的腫瘤細胞使免疫力降低有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，二次接種的移植瘤的生長速度與其他裸鼠移植瘤一致，且荷瘤裸鼠生活狀況良好，未出現(xiàn)意外死亡現(xiàn)象。

我們發(fā)現(xiàn)，建模小鼠在接種第28天前雖可見或觸及小瘤結(jié)節(jié)，但由于腫塊體積較小，且生長較為緩慢，測量誤差較大；而接種第28天后各移植瘤均明顯突起于皮膚表面，易于測量，人為因素造成的誤差相對較小，因此我們將腫瘤體積增長曲線中的起始數(shù)據(jù)取自接種第28天。本實驗中有2只裸鼠移植瘤體表面皮膚出現(xiàn)破潰現(xiàn)象，導(dǎo)致無法按照預(yù)先計劃進行處死。我們在剝出腫瘤時發(fā)現(xiàn)腫瘤組織與皮膚貼合緊密，已侵及皮膚，考慮到兩個移植瘤體積均較大，分析移植瘤體皮膚破潰可能與接種瘤細胞時的注射位置較為表淺或腫瘤生長過快有關(guān)。

本實驗結(jié)果顯示，Ishikawa細胞株在裸鼠右側(cè)肩胛背部生長良好，所有裸鼠均未出現(xiàn)惡病質(zhì)或意外死亡。我們認為，如需在裸鼠體內(nèi)研究子宮內(nèi)膜癌生物學行為特征、評估藥物療效，將Ishikawa細胞株接種于裸鼠右側(cè)肩胛皮下部位是可行的，且移植瘤組織中的腫瘤細胞保持了人類子宮內(nèi)膜癌細胞的病理學特征，為子宮內(nèi)膜癌的基礎(chǔ)研究、臨床治療和療效判斷提供了可靠工具。

[1] 謝幸,茍文麗,林仲秋,等.婦產(chǎn)科學[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:313.

[2] Deng L, Gao Y, Li X, et al. Expression and clinical significance of annexin A2and human epididymis protein 4 in endometrial carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2015,34:96.

[3] Legro RS, Kunselman AR, Miller SA, et al. Role of androgens in the growth of endometrial carcinoma: an in vivo animal model[J]. Am J Obstet Gynecol, 2001,184(3):303-308.

[4] Xu Y, Tong J, Ai Z, et al. Epidermal growth factor receptor signaling pathway involved in progestin-resistance of human endometrial carcinoma: In a mouse model[J]. J Obstet Gynaecol Res, 2012,38(12):1358-1366.

[5] Jiang F, Liu T, He Y, et al. MiR-125b promotes proliferation and migration of type Ⅱ endometrial carcinoma cells through targeting TP53INP1 tumor suppressor in vitro and in vivo[J]. BMC Cancer, 2011,11:425.

[6] Oh JH, Lee HS, Park SH, et al. Syndecan-1 overexpression promotes tumor growth and angiogenesis in an endometrial cancer xenograft model[J]. Int J Gynecol Cancer, 2010,20(5):751-756.

[7] Jiang T, Chen N, Zhao F, et al. High levels of Nrf2 determine chemoresistance in type Ⅱ endometrial cancer[J]. Cancer Res, 2010,70(13):5486-5496.

[8] Depreeuw J, Hermans E, Schrauwen S, et al. Characterization of patient-derived tumor xenograft models of endometrial cancer for preclinical evaluation of targeted therapies[J]. Gynecol Oncol, 2015,139(1):118-126.

[9] Matsuzaki S, Enomoto T, Serada S, et al. Annexin A4-conferred platinum resistance is mediated by the copper transporter ATP7A[J]. Int J Cancer, 2014,134(8):1796-1809.

[10] 賈玖麗,馬曉欣.兩種不同子宮內(nèi)膜癌動物模型穩(wěn)定性的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2013,21(8):1695-1698.

[11] 盛修貴,孫建衡,周春曉,等.人子宮內(nèi)膜癌裸鼠模型的建立及其生物學特性的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2002,37(1):33-35.

山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金資助項目(BS2009SW002)；山東省自然科學基金資助項目(ZR2013HM012)。

黃煜(E-mail: huangyuqd@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.008

R737.33

A

1002-266X(2016)35-0028-03

2016-04-08)