陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術系 (咸陽 712000)

耿朝萌 　劉林波　郭瑞林△　蘇　冰△ 　張曉雪△

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·臨床檢驗·

大腸埃希菌生物膜兩種檢測方法對比研究

陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術系 (咸陽 712000)

耿朝萌 劉林波郭瑞林△蘇冰△張曉雪△

摘要目的：剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色和半定量粘附實驗檢測大腸埃希菌生物膜的敏感性和特異性比較。方法：對臨床分離的83株大腸埃希菌進行生物膜形成實驗，分別經剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色和半定量粘附實驗，隨機抽取25株進行激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察。結果：臨床分離的83株大腸埃希菌經剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色陽性率37.3%，敏感性81.8%，特異性100%；半定量粘附實驗陽性率45.8%，敏感性100%，特異性78.6%；兩種檢測方法比較差異無統(tǒng)計學意義。結論：剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色、半定量粘附實驗均可用于大腸埃希菌生物膜的檢測。

主題詞@大腸埃希菌生物膜/細胞學剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色細菌粘附染色與標記顯微鏡檢查，共焦比較研究

細菌生物膜形成在細菌感染中的作用已引起廣泛關注，對生物膜的檢測也得到了越來越高的重視，出現了各類不同的檢測方法[1-5]。本文對我院臨床分離的83株大腸埃希菌在體外能否形成生物膜進行實驗，并分別采用剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色，半定量粘附實驗，比較其陽性檢出率、敏感性和特異性，對其臨床意義進行探討，現報告如下。

資料與方法

1實驗菌株、主要試劑與儀器收集2014年8～11月陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院臨床標本中分離的83株大腸埃希菌，刪除同一患者相同感染部位分離的重復分離菌株，所有菌株均經臨床鑒定。LB肉湯，剛果紅(中國遠航試劑廠)，阿利新藍8GX(上海如吉生物科技有限公司)，結晶紫為國產分析純，光學顯微鏡(OLYMPUS)，激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8),全自動酶標儀等。

2 方法

2.1剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色:

2.1.1阿利新藍染液：阿利新藍2 g，冰醋酸3 ml，蒸餾水97 ml，用前過濾；剛果紅染液：剛果紅 0.5g，50%酒精100 ml。

2.1.2剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色：將少量的無菌生理鹽水滴于經高壓滅菌的載玻片上，從血平板上挑取少許活化的菌落與之混勻，再滴加阿利新藍染液,室溫下靜置10～20min后，經火焰干燥后再滴加少許剛果紅染液，涂布均勻,室溫下染色5min,用蒸餾水沖洗至無染料流下為止，濾紙吸干后油鏡下觀察。重復實驗3次。

結果判斷：形成生物膜的細菌為淡紅色，胞外多糖等為深紅色，細胞之間邊界不清，深紅色的胞外多糖聚集成團并包裹于菌體周圍。

2.2半定量粘附實驗: 參照文獻[1]方法進行，重復實驗3次。

2.3激光共聚焦顯微鏡: 隨機抽取25株大腸埃希菌，參照文獻[5]進行CLSM掃描。

2.4統(tǒng)計學方法：運用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件，采用χ2檢驗，檢驗標準α=0.05。

結果

1兩種方法對大腸埃希菌生物膜的陽性檢出率83株臨床分離的大腸埃希菌中，經剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色實驗和半定量粘附實驗分別有31株和38株形成生物膜，其陽性率分別為37.3%、45.8%，兩種方法的檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.21，P>0.05)。

2兩種方法敏感性和特異性的比較隨機抽取的25株大腸埃希菌經CLSM觀察有11株形成生物膜，剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色實驗有9株陽性，半定量粘附實驗有11株陽性，隨機抽取的25株經CLSM觀察有14株未形成生物膜，剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色實驗有14株陰性，半定量粘附實驗有11株陰性。兩種方法的敏感性與特異性分別為81.8%、100%和100%、78.6%。

討論

生物膜(Biofilm,BF)是與浮游菌相對應的存在形式，是細菌在生長過程中為適應外界環(huán)境，粘附于生物或非生物表面，由自身細胞產生的胞外聚合物(胞外多糖、胞外DNA和蛋白等)及其基質包裹的具有三維結構的菌細胞群體。細菌形成生物膜是引起持續(xù)性、反復性感染的常見致病機制，大腸埃希菌形成的生物膜可以引起前列腺炎、膽道感染、導尿管相關性膀胱炎等對人類健康造成極其嚴重危害的疾病，并與外科手術植入物[6-7]等相關感染有緊密聯(lián)系。有報道表明細菌生物膜的形成常常也是導致疾病復發(fā)和藥物治療失敗的重要原因。

生物膜的檢測主要有定性、定量檢測和形態(tài)學觀察。主要的檢測方法有剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色、半定量粘附實驗[1]、菌落計數法[2]、剛果紅實驗[3]、銀染法[4]、掃描電鏡或CLSM[5]的形態(tài)學觀察。本文對我院臨床分離的83株大腸埃希菌在體外生物膜形成能力進行檢測，分別采用剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色、半定量粘附實驗，比較其陽性檢出率有無統(tǒng)計學差異。隨機抽取其中25株，以CLSM觀察結果為真陽性標準，檢測剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色，半定量粘附實驗的敏感性和特異性。

剛果紅作為指示劑的選擇培養(yǎng)基被廣泛應用于生物膜形成的定性檢查，而阿利新藍在組織細胞化學中常規(guī)應用于酸性粘多糖及粘蛋白染色，因此，剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色應用于細菌胞外糖染色效果較佳。其操作方法相對簡便，實驗結果易于觀察，但阿利新藍染液的pH值在實驗中非常重要，在pH2.5時染色效果最佳，但剛果紅在酸性條件下會形成棕黑色沉淀，故在染色過程中滴剛果紅染液之前需將阿利新藍染液中的冰醋酸完全揮發(fā)。半定量粘附實驗[1]為胞外粘附基質的結晶紫染色法，因其能通過吸光度間接反應生物膜的形成量，而多用于微孔板、試管等小容器中的生物膜的半定量分析。其實驗所需試劑及器材成本較低，實驗條件要求不高而被一般的臨床實驗室廣泛應用，但對于需動態(tài)觀察生物膜的形成并不適用。CLSM不僅可以觀察到生物膜的形態(tài)結構還可以對標本進行斷層掃描，再通過三維重建得到標本的立體結構以顯示生物膜內部結構，并可與圖像處理軟件如ISA軟件[5]將三維圖像數據化，且減少了掃描電鏡繁瑣的制片過程對生物膜結構的破壞。同時，CLSM也可與熒光原位雜交技術(FISH)相結合，更直觀的反應生物膜中活菌與死菌的比例，更真實地反映生物膜形態(tài)結構與細菌之間的關系，并可同時檢測多種屬細菌。但是，CLSM價格昂貴，且實驗條件要求較高，難以滿足一般臨床實驗室對生物膜形成能力的評估要求。

大腸埃希菌是多種易形成生物膜的院內感染細菌之一。本文采用的兩種檢測方法檢測本院臨床分離的83株大腸埃希菌生物膜的陽性檢出率分別為37.3%、45.8%，無統(tǒng)計學差異。但我院臨床分離的大腸埃希菌形成生物膜的檢出率明顯低于文獻[8]的報道。本實驗以CLSM觀察結果為真陽性標準，剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色的敏感性為81.8%、特異性為100%，半定量粘附實驗的敏感性為100%、特異性為78.6%。因此，在觀察生物膜形成的實驗中，特別是標本量較大的實驗中，可考慮利用半定量粘附實驗的敏感性高、特異性相對較低的特點，對菌株是否形成生物膜進行過篩檢查，可疑菌株則可用剛果紅-阿利新藍聯(lián)合染色特異性高的特點加以證實。

據美國疾病預防控制中心(CDC)和美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)估計，約60%～80%的人類細菌感染性疾病的發(fā)生與生物膜有關。近年來，隨著人工假體、各種導管等醫(yī)療材料的廣泛應用，人口老齡化及免疫低下人群的出現，使生物膜感染在醫(yī)院細菌感染中所占比例逐年上升，并且感染后果日趨嚴重。因此，生物膜檢測方法的優(yōu)化不容忽視，并且還需要大量實驗廣泛而深入的研究，才能得到客觀、準確的檢測結果，為臨床生物膜的檢出及對細菌生物膜耐藥性的研究提供可靠的幫助。

參考文獻

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(收稿：2015-04-24)

【中圖分類號】R446.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.046

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