蒙志平, 黎勇明, 楊　玲, 吳　險(xiǎn), 梁金艷,林麗文, 梁　婷, 黃川英

(廣西壯族自治區(qū)貴港市人民醫(yī)院, 1. 檢驗(yàn)科; 2. 婦科, 廣西 貴港, 537100)

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HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值探討

蒙志平1, 黎勇明2, 楊玲1, 吳險(xiǎn)1, 梁金艷2,林麗文1, 梁婷2, 黃川英1

(廣西壯族自治區(qū)貴港市人民醫(yī)院, 1. 檢驗(yàn)科; 2. 婦科, 廣西 貴港, 537100)

摘要:目的探討HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值。 方法選取宮頸病變篩查的受試者407例為研究對(duì)象，均行宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)(TCT)檢查，并檢測(cè)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)。215例行陰道鏡宮頸活檢，結(jié)合組織病理診斷結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果407例細(xì)胞病理學(xué)診斷結(jié)果：正常范圍(WNL)192例(47.17%)、意義不明的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASCUS)106例(26.04%)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)70例(17.20%)和高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)39例(9.58%)。診斷為L(zhǎng)SIL和HSIL患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 診斷為ASCUS患者中, HPV DNA檢出率顯著高于HPV E6/E7 mRNA (P<0.01)。215例組織病理學(xué)診斷結(jié)果：正常109例，陰性106例，包括CIN Ⅰ級(jí)44例、CIN Ⅱ級(jí)27例、CIN Ⅲ級(jí)32例、宮頸鱗癌3例。對(duì)于診斷為CIN Ⅱ級(jí)、CIN Ⅲ級(jí)/宮頸癌患者，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的靈敏度、特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 但HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度顯著高于HPV DNA檢測(cè)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論HPV E6/E7 mRNA檢查較HPV DNA檢查能更好地評(píng)估HPV感染患者宮頸病變惡化風(fēng)險(xiǎn)，聯(lián)合TCT檢測(cè)對(duì)提高宮頸癌早期篩查和診斷的準(zhǔn)確度具有積極意義。

關(guān)鍵詞:宮頸癌; 宮頸上皮內(nèi)瘤變; 人乳頭瘤狀病毒; HPV DNA; E6/E7基因

宮頸癌是臨床婦科常見(jiàn)惡性腫瘤之一，主要是由宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)逐步發(fā)展為浸潤(rùn)癌的長(zhǎng)期病變過(guò)程。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，中國(guó)宮頸癌發(fā)病率由1989—1990年的3.06/10萬(wàn)上升至2007—2008年的11.87/10萬(wàn)[1]，而預(yù)防和控制宮頸癌發(fā)病和死亡的關(guān)鍵是有效的早期篩選、診斷和治療[2]。宮頸疾病診斷中，薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)使用較為普遍，但因操作等主觀因素易造成漏檢或假陽(yáng)性出現(xiàn)。另一方面，鑒于高危型人乳頭瘤狀病毒(HR-HPV)和宮頸癌及癌前病變發(fā)生密切相關(guān)[3-4]，HPV DNA檢測(cè)能直接反映宮頸宿主細(xì)胞感染HPV，聯(lián)合TCT能提高診斷篩選的陽(yáng)性檢出率、敏感性。但也有學(xué)者提出HPV DNA檢測(cè)不能反映HPV病毒感染后的活性狀態(tài)[5]。研究[6]顯示，HR-HPV的持續(xù)感染可通過(guò)上調(diào)HPV E6/E7腫瘤蛋白表達(dá)啟動(dòng)致癌過(guò)程，HPV E6/E7 mRNA表達(dá)與病變嚴(yán)重程度密切相關(guān)，因此HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸癌初步篩查中是否更具有診斷價(jià)值是目前臨床研究的熱點(diǎn)。本研究比較了TCT聯(lián)合HPV DNA、TCT聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA在宮頸癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2014年10月—2015年10月在貴港市人民醫(yī)院婦科行宮頸病變篩查的受試者407例為研究對(duì)象，年齡18～66歲，平均(37.5±9.2)歲；152例患者有明顯臨床癥狀，為陰道分泌物增多、白帶異常、接觸性出血，214例伴有不同程度的宮頸糜爛。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 子宮切除、宮頸手術(shù)或盆腔放射治療史; ② 合并其他系統(tǒng)腫瘤或?qū)m頸上皮內(nèi)病變史(CIN≥2級(jí)); ③ 取材前陰道用藥或行陰道沖洗; ④ 妊娠期患者。所有受試者均行TCT、HPV DNA、HR-HPV E6/E7 mRNA檢查和宮頸活體組織病理學(xué)檢查。

1.2方法

1.2.1樣本采集：采用專(zhuān)用宮頸刷置入宮頸內(nèi)鱗柱狀上皮交界處順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈。取出專(zhuān)用刷后置于含有專(zhuān)用細(xì)胞保存液的試管中，刷洗8～10次后將細(xì)胞洗脫后封管，-20 ℃保存?zhèn)錂z。

1.2.2TCT檢測(cè)：采用膜式液基超薄細(xì)胞學(xué)和離心沉淀技術(shù)，宮頸脫落細(xì)胞經(jīng)固定、染色后，由檢驗(yàn)科醫(yī)師依據(jù)國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)推薦的Bethesda系統(tǒng)(TBS)進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)診斷，分為正常范圍(WNL)、意義不明的不典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASCUS)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)，高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和意義不明的不典型腺體上皮細(xì)胞(AGCUS)。

1.2.3HPV DNA檢測(cè)：采用凱普公司點(diǎn)雜交的采樣工具包從宮頸管采集標(biāo)本，檢測(cè)21種HPV亞型，包括世衛(wèi)組織(WHO)關(guān)于宮頸癌篩查必須具備的13種高危型HPV DNA(16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68)，5種低危型6, 11, 41, 42, 44以及3種常見(jiàn)亞型53, 66和CP8304。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)：用專(zhuān)用宮頸刷于宮頸外口及頸管內(nèi)旋轉(zhuǎn)5圈，折斷刷柄，置于專(zhuān)用保存液瓶中待用，根據(jù)科蒂亞(新鄉(xiāng))試劑盒檢測(cè)要求經(jīng)過(guò)信號(hào)放大、加入標(biāo)記熒光物質(zhì)的底物后，在配套冷光儀光度計(jì)上檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為拷貝數(shù)，經(jīng)公司計(jì)算軟件自動(dòng)判斷結(jié)果。

1.2.5組織病理學(xué)檢查：對(duì)于ASCUS或更高級(jí)別的異常細(xì)胞學(xué)結(jié)果，陰道鏡下取宮頸活體組織，送病理檢查，病理診斷結(jié)果依據(jù)TBS分類(lèi)系統(tǒng)分為未見(jiàn)上皮內(nèi)病變或惡性病變(NILM)、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變CIN(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和宮頸癌。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，以病理學(xué)檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算不同檢驗(yàn)方法對(duì)CIN Ⅱ、CIN Ⅲ的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞病理學(xué)、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA病理學(xué)檢查結(jié)果

407例患者均行TCT檢查，其中HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性197例(48.40%)，HPV E6/E7 mRNA檢查陽(yáng)性127例(31.20%)。細(xì)胞病理學(xué)診斷結(jié)果：WNL 192例(47.17%), ASCUS 106例(26.04%)，LSIL 70例(17.20%)，HSIL 39例(9.58%)。細(xì)胞學(xué)檢查標(biāo)本中215例行陰道鏡宮頸活檢，組織病理學(xué)診斷正常109例，陽(yáng)性106例，包括CIN Ⅰ級(jí)44例、CIN Ⅱ級(jí)27例、CIN Ⅲ級(jí)32例、宮頸鱗癌3例。

2.2不同細(xì)胞病理學(xué)分級(jí)HPV DNA、HPVE6/E7 mRNA檢出情況

不同細(xì)胞病理學(xué)分級(jí)下HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢出率比較見(jiàn)表1。診斷為ASCUS患者中, HPV DNA檢出率高于HPV E6/E7 mRNA, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 診斷為L(zhǎng)SIL和HSIL 患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3不同組織病理學(xué)分級(jí)HPV DNA、HPVE6/E7 mRNA檢出情況

不同組織病理學(xué)分級(jí)HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢出率比較見(jiàn)表2。將3例宮頸癌患者納入CIN Ⅲ級(jí)合并計(jì)算，CIN Ⅱ級(jí)和CIN Ⅲ級(jí)/宮頸癌患者中，HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CIN Ⅰ級(jí)患者中，HPV DNA檢出率顯著高于HPV E6/E7 mRNA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)不同組織病理學(xué)診斷價(jià)值

以215例行陰道鏡宮頸活檢的患者為研究對(duì)象。對(duì)于診斷為正常的患者，2種方法靈敏度、特異度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度顯著低于HPV DNA檢測(cè)(P<0.05或P<0.01), 但陰性預(yù)測(cè)值顯著高于HPV DNA檢測(cè)(P<0.05); CIN Ⅰ級(jí)患者中，2種方法靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性預(yù)測(cè)值顯著低于HPV DNA檢測(cè)(P<0.05)，陰性預(yù)測(cè)值顯著高于HPV DNA檢測(cè)(P<0.01); CIN Ⅱ級(jí)中，2種方法靈敏度、特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度顯著高于HPV DNA檢測(cè)(P<0.05或P<0.01); CIN Ⅲ級(jí)/宮頸癌患者中，2種方法靈敏度、特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度顯著高于HPV DNA檢測(cè)(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表3。

3討論

宮頸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌，是中國(guó)女性常見(jiàn)惡性腫瘤之一。研究[7]報(bào)道，HR-HPV持續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生發(fā)展的必要條件，因此檢測(cè)HPV DNA的持續(xù)感染能有助于宮頸癌及其癌前病變的早期診斷和治療。但多數(shù)患者HPV感染呈一過(guò)性，而呈HPV持續(xù)感染患者宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡化前通常經(jīng)歷5～10年的癌前病變階段，因此HPV DNA檢測(cè)對(duì)宮頸疾病惡化風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)效果可能不理想[8]。另一方面，HPV基因組包括兩類(lèi)編碼基因區(qū)，即7個(gè)早期區(qū)(E1、E2、E4、E5、E6、E7和E8)基因和2個(gè)晚期區(qū)(L1和L2)基因，其中由E6/E7基因編碼的致癌蛋白是導(dǎo)致宮頸上皮癌變的重要因子。HPV DNA整合于宿主染色體脆弱區(qū)，破壞編碼特異性DNA束縛蛋白的E2區(qū)，引起E6和E7兩種癌基因的過(guò)表達(dá)，通過(guò)抑制抑癌基因功能、激活端粒酶活性等機(jī)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期失控、永生化成為癌細(xì)胞[9]。研究[10]提示，宮頸組織中HPV E6/E7 mRNA 表現(xiàn)出癌基因活性，對(duì)于持續(xù)HPV感染患者，HPV E6/E7 mRNA異常表達(dá)往往預(yù)示著細(xì)胞惡化風(fēng)險(xiǎn)增高。本研究觀察到，TCT檢查診斷為ASCUS患者中，HPV DNA檢出率高于HPV E6/E7 mRNA(P<0.01), 但在診斷為 LSIL和HSIL 患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11-12]。

Rijkaart等[13]指出，HPV E6/E7 mRNA表達(dá)隨著宮頸病變級(jí)別升高呈增加趨勢(shì)。本研究中，不同組織病理學(xué)分級(jí)患者診斷效率的比較結(jié)果顯示，CIN Ⅱ級(jí)、CIN Ⅲ級(jí)/宮頸癌患者中，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的靈敏度、特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度顯著高于HPV DNA檢測(cè)(P<0.05或P<0.01)，提示HPV E6/E7 mRNA更適用于評(píng)估宮頸疾病惡化風(fēng)險(xiǎn)。

與HPV DNA比較, *P<0.05, **P<0.01

參考文獻(xiàn)

[1]胡尚英, 鄭榮壽, 趙方輝, 等. 1989 至 2008 年中國(guó)女性子宮頸癌發(fā)病和死亡趨勢(shì)分析[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào), 2014, 36(2): 119-125.

[2]Ronco G, Dillner J, Elfstrom K M, et al. Efficacy of HPV-based screening for prevention of invasive cervical cancer: follow-up of four European randomised controlled trials[J]. Lancet, 2014, 383(9916): 524-532.

[3]Guan P, Howell‐Jones R, Li N, et al. Human papillomavirus types in 115, 789 HPV‐positive women: A meta‐analysis from cervical infection to cancer[J]. Int J Cancer, 2012, 131(10): 2349-2359.

[4]王楠, 馬蓉, 吳建中, 等. 宮頸癌的發(fā)病機(jī)制, 診斷及治療進(jìn)展[J]. 中國(guó)腫瘤外科雜志, 2013, 5(2): 121-124.

[5]張博, 張穎, 牛力春, 等. 液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合 HPV mRNA 檢測(cè)對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2016, 24(1): 118-122.

[6]Wang X, Wang H K, Li Y, et al. microRNAs are biomarkers of oncogenic human papillomavirus infections[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(11): 4262-4267.

[7]Schiffman M, Wentzensen N. Human papillomavirus infection and the multistage carcinogenesis of cervical cancer[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2013, 22(4): 553-560.

[8]李玲, 張秋瑩, 劉楊. 人乳頭狀瘤病毒持續(xù)感染狀態(tài)下 E6, E7 蛋白 mRNA 在宮頸癌不同分期的表達(dá)結(jié)果[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2016, 13(4): 514-516.

[9]Liao S, Deng D, Hu X, et al. HPV16/18 E5, a promising candidate for cervical cancer vaccines, affects SCPs, cell proliferation and cell cycle, and forms a potential network with E6 and E7[J]. Int J Mol Med, 2013, 31(1): 120-128.

[10]Halec G, Schmitt M, Dondog B, et al. Biological activity of probable/possible high‐risk human papillomavirus types in cervical cancer[J]. Int J Cancer, 2013, 132(1): 63-71.

[11]Johansson H, Bjelkenkrantz K, Darlin L, et al. Presence of high-risk HPV mRNA in relation to future high-grade lesions among high-risk HPV DNA positive women with minor cytological abnormalities[J]. PloS one, 2015, 10(4): e0124460.

[12]黃寶英, 周倫順, 富顯果, 等. HPV E6/E7 mRNA 檢測(cè)對(duì)宮頸癌篩查意義的初步評(píng)價(jià)[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2013, 20(14): 1061-1064.

[13]Rijkaart D C, Heideman D A M, Coupe V M H, et al. High-risk human papillomavirus (hrHPV) E6/E7 mRNA testing by PreTect HPV-Proofer for detection of cervical high-grade intraepithelial neoplasia and cancer among hrHPV DNA-positive women with normal cytology[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(7): 2390-2396.

Application value of HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay in screening of cervical cancer

MENG Zhiping1, LI Yongming2, YANG Ling1, WU Xian1, LIANG jinyan2,LIN Liwen1, LIANG Ting2, HUANG Chuanying1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory; 2.DepartmentofGynecology,GuigangPeople′sHospital,Guigang,Guangxi, 537100)

KEYWORDS:cervical cancer; cervical intraepithelial neoplasias; human papillomavirus; HPV DNA; HPV E6/E7 mRNA

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the application value of HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay in screening of cervical cancer. MethodsA total of 407 cases received Thinprep Cytology Test (TCT), HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay. The cervical biopsy by colposcopy was performed in 215 cases and the data according to cytological and pathological results were statistically analyzed. ResultsThere were 192, 106, 70 and 39 cases diagnosed as normal limits (WNL), atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), lower-grade squamous intraepithelial lesions (LSIL)and higher-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL) according to cytological results respectively. There was no significant difference in positive rate of HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA in those patients with cytological results of LSIL and HSIL (P>0.05). The positive rate was higher in HPV DNA than that of HPV E6/E7 mRNA in ASCUS patients (P<0.05). Out of 215 cases, 106 cases were confirmed with positive pathological results, including 44 cases of CIN Ⅰ, 27 cases of CIN Ⅱ, 32 cases of CIN Ⅲ and 3 cases of cervical cancer. There was no significant difference in sensitivity, specificity, positive predict value between HPV DNA and HPV E6/E7 mRNA assay in diagnosis of CIN Ⅱ and CIN Ⅲ/cervical cancer(P>0.05), but HPV E6/E7 mRNA assay had a higher negative predictive value and accuracy compared with the HPV DNA assay (P<0.05 orP<0.01). ConclusionHPV E6/E7 mRNA assay shows advantage in predicting risk of deterioration of cervical lesions. The combination of TCT and HPV E6/E7 mRNA assay is more valuable in screening of cervical cancer.

收稿日期:2015-12-16

中圖分類(lèi)號(hào):R 737.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)11-076-04

DOI:10.7619/jcmp.201611022