李舒佳, 閔仲生, 朱曉芳, 趙　莎

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京, 210029; 2. 江蘇省中醫(yī)院, 江蘇 南京, 210029;3. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

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消銀合劑對(duì)銀屑病小鼠模型血清Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)的影響

李舒佳1, 閔仲生2, 朱曉芳3, 趙莎3

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京, 210029; 2. 江蘇省中醫(yī)院, 江蘇 南京, 210029;3. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

摘要:目的觀察消銀合劑對(duì)銀屑病小鼠模型外周血清中的Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)的影響。方法40只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、消銀合劑高、低劑量組和甲氨蝶呤組，每組8只。采用咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型，采用銀屑病皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(PASI)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)觀察銀屑病樣小鼠皮損的變化情況。采用ELISA方法檢測(cè)血清Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α的變化。結(jié)果消銀合劑組小鼠銀屑病樣皮損程度輕于模型組，PASI評(píng)分降低，血清Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)明顯低于模型組。甲氨蝶呤組小鼠銀屑病皮損程度輕于模型組，PASI分?jǐn)?shù)降低，血清Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)明顯低于模型組。結(jié)論消銀合劑可能通過下調(diào)Th17細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)來減輕銀屑病小鼠的皮膚病變。

關(guān)鍵詞:銀屑病; 銀屑病小鼠模型; 消銀合劑; Th17細(xì)胞相關(guān)因子

銀屑病是一種以鱗屑性紅斑為臨床特點(diǎn)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，目前多認(rèn)為是免疫因素、遺傳因素、環(huán)境因素精神因素等多因素相互作用的多基因遺傳病，免疫介導(dǎo)是其主要發(fā)生機(jī)制。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。咪喹莫特(IMQ)為免疫激活劑，可與Toll樣受體作用致免疫激活，誘發(fā)小鼠皮膚產(chǎn)生銀屑病樣皮損改變[1]。本實(shí)驗(yàn)以銀屑病樣小鼠模型為基礎(chǔ)，觀察消銀合劑對(duì)小鼠皮損變化及Th17細(xì)胞相關(guān)因子變化的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

雌性BALB/c小鼠40只，體質(zhì)量18～20 g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)SYXK(蘇)2012-0029，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室。

1.2試劑與藥品

消銀合劑(江蘇省揚(yáng)州市中醫(yī)院制劑室)；咪喹莫特(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司)；凡士林乳膏(南昌白云藥業(yè)有限公司)；甲氨蝶呤(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；IL-17、IL-6、TNF-α、IL-22等ELISA試劑盒(Boster Biological Technology Co. Ltd)。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備：BALB/c小鼠用戊巴比妥鈉(80 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，刮除背部毛發(fā)，形成2 cm×3 cm暴露區(qū)域，單籠飼養(yǎng)按組別分別給予藥物處理。1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥：將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、消銀合劑高、低劑量組、甲氨蝶呤組，每組8只。除空白組小鼠每日背部涂抹凡士林42 mg, 其余4組小鼠每日背部涂抹5%咪喹莫特乳膏42 mg。5組小鼠同時(shí)灌胃給藥?？瞻讓?duì)照組與模型組分別與予生理鹽水0.1 mL; 消銀合劑高劑量組予濃度為14.36 g/(kg·d)消銀合劑溶液；消銀合劑低劑量組予濃度為7.18 g/(kg·d)消銀合劑溶液；甲氨蝶呤組給予MTX 1 mg/( kg·d), 連續(xù)12 d。

1.3.3檢測(cè)變化及方法：用數(shù)碼相機(jī)每天拍照記錄，并依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(0分為無; 1分為輕度; 2分為中度；3分為重度；4分為極重度)，分別對(duì)小鼠皮損處紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)增厚程度進(jìn)行評(píng)分，并將三者積分相加得到總積分，繪制相應(yīng)趨勢(shì)線，觀察各組小鼠皮損的變化情況。連續(xù)處理小鼠12 d，摘除眼球取血收集血清，用ELISA方法檢測(cè)相關(guān)因子變化；采血后將小鼠脫頸處死，減取小鼠背部相應(yīng)皮損組織，用HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠背部皮損處紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)增厚及PASI積分的變化

與空白對(duì)照組相比，咪喹莫特乳膏涂抹1 d后模型組皮膚即開始出現(xiàn)紅斑、鱗屑，隨著藥物作用蓄積，模型組皮損紅斑顏色由淺變深，鱗屑增多增厚，皮膚浸潤(rùn)明顯。第8天前后最嚴(yán)重，形成類似銀屑病樣皮損。隨后繼續(xù)外用咪喹莫特乳膏，皮損嚴(yán)重程度不再增加，呈逐漸消退趨勢(shì)。直至12 d后，僅剩少量紅斑鱗屑，皮膚增厚也有緩解；甲氨蝶呤組、消銀合劑高/低劑量組皮損與模型組相比癥狀明顯減輕，皮膚較光滑，鱗屑較少，紅斑色淺，浸潤(rùn)增厚較輕。空白對(duì)照組PASI積分趨于0，其余4組PASI積分趨勢(shì)線均表現(xiàn)為先上升、后下降的變化，PASI積分于1～7 d逐漸上升，第8天達(dá)高峰，隨后較快降低；咪喹莫特組、低劑量消銀合劑組、高劑量消銀合劑組、甲氨蝶呤組的PASI積分依次下降。見圖1。

2.2 消銀合劑對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損動(dòng)物模型組織學(xué)變化的影響

HE染色顯示：空白對(duì)照組皮膚菲薄，見2～3層形態(tài)正常的細(xì)胞；模型組小鼠表皮明顯增厚，可見角化過度伴有角化不全，棘層細(xì)胞顯著增厚，可見Munro微膿腫，真皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表現(xiàn)為類似銀屑病樣改變；與模型組相比，高劑量消銀合劑組及甲氨蝶呤組小鼠變化較輕，僅有輕度的角化過度，棘層細(xì)胞輕度增厚，2組無明顯差異；低劑量消銀合劑組皮膚變化程度介于甲氨蝶呤組及IMQ組。見圖2。

2.3消銀合劑對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠血清Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)的影響

空白對(duì)照組IL-17、IL-22、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子水平較低；與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞因子水平明顯升高，約為空白對(duì)照組2～3倍，其中TNF-α明顯增高，約為空白對(duì)照組的8～9倍；高劑量消銀合劑組及甲氨蝶呤組細(xì)胞因子水平輕度升高，部分接近空白對(duì)照組，高劑量消銀合劑組細(xì)胞因子水平與甲氨蝶呤組接近；低劑量消銀合劑組細(xì)胞因子水平介于高劑量消銀合劑組及模型組。見表1。

與空白組比較, *P<0.05; 與模型組比較, △P<0.05; 與高劑量消銀合劑組比, #P<0.05。

3討論

銀屑病是一種以T淋巴細(xì)胞活化和浸潤(rùn)為主要特征的慢性炎癥性疾病，病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)、難治愈，目前已被定義為器官特異性的自身免疫性疾病[2]。近期研究[3-4]表明，Thl7細(xì)胞在銀屑病及其他免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病中發(fā)揮較大作用。

IL-17是一種促炎癥細(xì)胞因子，主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的募集及激活中性粒細(xì)胞能力，能誘導(dǎo)活化T細(xì)胞，刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎遞質(zhì)，如IL-1、IL-6、TNF-α等，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥發(fā)生[5]。TNF-α是一種在炎癥和自身免疫性疾病中具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，通過多種方式直接或間接地誘導(dǎo)銀屑病的病理發(fā)生[6]。此外，IL-17還與TNF-α等炎癥因子協(xié)同，放大加強(qiáng)其致炎效應(yīng)。IL-22可通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的分化、誘導(dǎo)銀屑病樣表皮改變參與銀屑病發(fā)病[7]。IL-6能誘導(dǎo)Th22細(xì)胞產(chǎn)生 IL-22, 進(jìn)而激活STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，然后以IL-22為主、聯(lián)合TNF-α共同介導(dǎo)銀屑病的進(jìn)程和棘皮癥發(fā)展[8]。

本研究對(duì)小鼠模型進(jìn)行了0～12 d的觀察，發(fā)現(xiàn)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)拋物線樣的動(dòng)態(tài)變化：在咪喹莫特乳膏涂抹1～2 d后小鼠皮膚即出現(xiàn)紅斑、鱗屑，第7～8天時(shí)紅斑、鱗屑及浸潤(rùn)現(xiàn)象最嚴(yán)重，此后隨著咪喹莫特給藥時(shí)間延長(zhǎng)，皮損不再加重，有減緩趨勢(shì)。從小鼠銀屑病樣皮損PASI評(píng)分趨勢(shì)圖可以看出這一動(dòng)態(tài)變化過程[9-10]。由以上結(jié)果可以推測(cè)，咪喹莫特外用誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損可能是一個(gè)暫時(shí)的炎癥爆發(fā)，該模型在咪喹莫特持續(xù)作用下可能發(fā)生藥物適應(yīng)、耐受現(xiàn)象，致使皮損出現(xiàn)自限性傾向[11-12]。因此，可認(rèn)為咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣動(dòng)物模型有時(shí)間窗的限制，前8 d為疾病的發(fā)生、發(fā)展階段，可應(yīng)用于銀屑病發(fā)病機(jī)制探索、藥物篩選及干預(yù)作用機(jī)制研究[13-14]。

消銀合劑由土槐飲(土茯苓、槐花、甘草)主方加減而成，土茯苓具有選擇性抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)、抗腫瘤等作用，槐花具有保持毛細(xì)血管的正常抵抗力、減少血管通透性、對(duì)抗炎癥等作用[15]。銀屑病主要病理特征為表皮增殖活躍、角化不全、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管增生等[16]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，消銀合劑治療咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損，顏色由鮮紅或深紅轉(zhuǎn)為淡紅，皮疹變薄，鱗屑脫落減少，面積縮小，或全部消退，皮膚癥狀得以明顯緩解，PASI積分顯著降低；IL-17、TNF-α、IL-6、IL-22等Th17細(xì)胞相關(guān)因子水平顯著下降；組織形態(tài)變化趨于正常，角化不全的細(xì)胞減少；炎癥浸潤(rùn)程度降低；新生血管數(shù)量減少[17]。提示消銀合劑有明顯的抗炎作用，可能與降低Th17細(xì)胞相關(guān)因子水平，進(jìn)而改善T淋巴細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的作用有關(guān)。

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Effect of psoriasis-eliminating preparation on expressions of Th17-related factors in psoriasis mouse model

LI Shujia1, Min Zhongsheng2, ZHU Xiaofang3, ZHAO Sha3

(1.NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu, 210029;2.JiangsuProvincialTCMHospital,Nanjing,Jiangsu, 210029;3.ClinicalMedicineCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

KEYWORDS:psoriasis; psoriasis-eliminating preparation; psoriasis mouse model; Th17-related factors

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the effect of psoriasis-eliminating preparation on the expressions of Th17-related factors in psoriasis mouse model. MethodsA total of 40 BALB/c female mice were randomly divided into blank control group, model group, high and low dose of psoriasis-eliminating preparation group, and methotrexate group, 8 mice in each group. Psoriasis mouse model was induced by imiquimod. The severity was assessed by psoriasis area and severity index (PASI). ELISA was used to detect changes of IL-17, IL-22, IL-6 and TNF-α. ResultsDegree of psoriasis like lesions in psoriasis-eliminating preparation group was less than that in model group, the PASI score decreased, and expressions of Th17-related factors were obviously lower than the model group. Degree of psoriasis like lesions in methotrexate group was less than model group, the PASI score decreased, and expressions of Th17-related factors were obviously lower than the model group. ConclusionPsoriasis-eliminating preparation may reduce the skin lesions of psoriasis mice by down regulate expressions of Th17-related factors.

收稿日期:2015-11-24

中圖分類號(hào):R 758.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)11-004-04

DOI:10.7619/jcmp.201611002