閻賀靜，齊兵兵，趙琳琳，劉 暢

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066600；2 國家糧食儲備局武漢科學(xué)研究設(shè)計院)

黑曲霉(CGMCC 3.316)β-葡萄糖苷酶釀造因子耐性分析

閻賀靜1*，齊兵兵1，趙琳琳2，劉 暢1

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島，066600；2 國家糧食儲備局武漢科學(xué)研究設(shè)計院)

為了確定黑曲霉(CGMCC 3.316)β-葡萄糖苷酶在葡萄酒增香中的應(yīng)用潛力，考察了該酶對葡萄酒釀造溫度、酒精的體積分數(shù)、pH值、糖的質(zhì)量濃度及SO2的質(zhì)量濃度等釀造因子的耐性。結(jié)果表明，該β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃，釀造溫度條件(20～30 ℃)下具有很高的耐性；少量的酒精對該酶有激活作用，酒精的體積分數(shù)大于0.08(酒精度大于8% vol)時耐性迅速降低；其最適反應(yīng)pH值為4.55，釀造環(huán)境pH 3.4條件下活性較低，酸耐受性差；SO2的質(zhì)量濃度低于40 mg/L時較穩(wěn)定；該酶具有一定的葡萄糖耐受性。綜合該酶對以上葡萄酒釀造因子的耐性，若用于葡萄酒的增香處理，建議處理時間控制在大約6～8 d。若要進一步提高葡萄酒增香效果，需提高該酶低溫時的酶活性及其酸耐受性。

β-葡萄糖苷酶；釀造因子；耐性

β-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.21)是一種具有生物催化功能的蛋白質(zhì)，全稱β-D-葡萄糖苷水解酶，廣泛存在于植物的種子和微生物當中[1]。β-葡萄糖苷酶可以水解葡萄中的鍵合態(tài)呈香物質(zhì)，使原來不呈香的芳香物質(zhì)以游離態(tài)存在并呈現(xiàn)出香氣[2]。因此，β-葡萄糖苷酶用于葡萄酒增香處理，可以增加葡萄汁(酒)中芳香物質(zhì)的種類和含量，從而可增加葡萄酒的香氣，對于突出葡萄酒的品種香氣至關(guān)重要，因此β-葡萄糖苷酶在葡萄酒增香領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注[3,4]。

通常，葡萄漿果和酵母均可以產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，但由于葡萄酒的釀造環(huán)境pH值低和溫度低，而酒精的體積分數(shù)和糖的質(zhì)量濃度較高，同時具有一定量的SO2，以上來源的β-葡萄糖苷酶的活性受到很大抑制，因此對葡萄酒的增香作用有限[5,6]。微生物來源的β-葡萄糖苷酶，一般具有較高的活性和良好的穩(wěn)定性，目前已應(yīng)用于葡萄酒增香[7]。據(jù)報道[8,9]，真菌具有廣泛的水解酶系，具有較高的β-葡萄糖苷酶分泌能力，尤其黑曲霉，不僅β-葡萄糖苷酶產(chǎn)酶能力高，且耐熱性較高，在葡萄酒增香領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力[11，12]。

本次研究通過分析黑曲霉(CGMCC 3.316)β-葡萄糖苷酶在不同釀造環(huán)境下的穩(wěn)定性，以確定該β-葡萄糖苷酶的葡萄酒釀造因子耐性，探討該酶用于葡萄酒增香的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和培養(yǎng)基

黑曲霉：河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院保藏。

PDA培養(yǎng)基：瓊脂糖15 g，蔗糖30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.01 g，K2HPO41 g，蒸餾水1 L，pH6.0～6.5。

種子培養(yǎng)基：蔗糖30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.01 g，K2HPO41 g，pH6.5，蒸餾水1 L。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮 30 g，CaCl20.3 g，MgSO40.3 g，K2HPO42.0 g，NaNO34.0 g，pH5.5；蒸餾水1 L。

1.2 實驗方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶粗酶液制備 取一環(huán)PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的黑曲霉溶于生理鹽水，按10%的接種量接入種子培養(yǎng)基，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)(150 r/min)60 h后，再按10%的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)(150 r/min)7 d，取發(fā)酵液5 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆肹13]。

1.2.2 β-葡萄糖苷酶活性測定 取1 mL適當稀釋的酶液，加入0.5 mL 質(zhì)量濃度為5.0 g/L的水楊苷溶液(溶于0.1 mol/L，pH 4.8的醋酸緩沖液中)，55 ℃反應(yīng)20 min，加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑，煮沸5 min，冷卻，蒸餾水定容至10 mL，以加熱滅活酶液為空白，于540 nm處測OD值。酶活定義：在上述條件下1 mL酶液1 min水解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖的酶活力定義為1個單位(U)酶活[1]。

1.2.3 β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度和溫度耐性分析 在不同溫度下(45，50，55，60，65，70 ℃)按照1.2.2所示方法測定β-葡萄糖苷酶活性，確定其最適反應(yīng)溫度；將酶液分別置于常用葡萄酒釀造溫度條件下(15，20，25，30 ℃)保溫不同的時間(0，1，2，4，8，12，24 h)后，按照1.2.2所示方法測定殘留酶活性，確定該酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.4 β-葡萄糖苷酶對酒精度的耐性分析 在1.2.2所示酶活性測定體系內(nèi)，加入不同量的乙醇，測定不同體積分數(shù)的乙醇(0，0.05，0.10，0.12，0.15，0.20，0.25，0.30)條件下該β-葡萄糖苷酶活性；25 ℃條件下，將酶液保存于不同體積分數(shù)的酒精(0，0.04，0.08，0.12，0.16)溶液中，保存一定時間(0，2，4，6，8，12，24，48 h)后取樣按照1.2.2所示方法測定殘留酶活性，確定該酶對酒精度的耐性。

1.2.5 β-葡萄糖苷酶的最適pH值和pH耐性分析[14]在不同pH值條件下(3.45，4.08，4.55，4.80，5.13，5.57，5.90)，按照1.2.2所示方法測定β-葡萄糖苷酶活性，確定其最適反應(yīng)pH值；將酶液分別置于不同的pH值條件下(3.45，4.08，4.80)，25 ℃保溫不同時間(0，1，2，4，8，12，24 h)后，按照1.2.2所示方法測定殘留酶活性，確定該酶的pH值穩(wěn)定性。

1.2.6 SO2對β-葡萄糖苷酶活性的影響及其對SO2的耐性分析 將酶液分別置于不同質(zhì)量濃度的SO2條件下(20，40，60，80，100 mg/L)，25 ℃保溫不同的時間(0，1，2，4，8，12，24，48 h)后，按照1.2.2所示方法測定殘留酶活性，確定該酶對SO2的耐受性。

1.2.7 糖對β-葡萄糖苷酶活性的影響 在1.2.2所示酶活性測定體系內(nèi)，加入不同質(zhì)量的葡萄糖，然后測定不同質(zhì)量濃度糖(0～200 g/L)條件下該酶活性，確定糖的質(zhì)量濃度對該酶活性的影響。1.2.8 β-葡萄糖苷酶在模擬葡萄酒釀造環(huán)境中的穩(wěn)定性 將β-葡萄糖苷酶置于SO2質(zhì)量濃度40 mg/L，葡萄糖質(zhì)量濃度200 g/L和乙醇的體積分數(shù)0.10，pH 3.6的溶液中，25 ℃溫度條件下保存16 d，定時取樣，按照1.2.2所示方法測定殘留酶活性，以確定該酶在葡萄酒釀造環(huán)境中的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉β-葡萄糖苷酶對溫度的耐性

該酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在20～30 ℃表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性(圖1)。20，25，30 ℃條件下保存24 h后，該酶殘留酶活性分別為90.26%，88.05%，83.09%。由此可見，隨著溫度的升高該酶的穩(wěn)定性降低。葡萄酒在釀造過程對發(fā)酵溫度有要求，紅葡萄酒的發(fā)酵溫度為25～30 ℃，白葡萄酒的發(fā)酵溫度為15～20 ℃。圖1(a)數(shù)據(jù)顯示，45 ℃時酶活為最適反應(yīng)溫度(60 ℃)酶活性的32.47%。由此表明，雖然低溫條件下該酶非常穩(wěn)定，但酶反應(yīng)活性較低，葡萄酒的增香作用受到一定限制。但若葡萄酒釀造采用皮渣熱浸提工藝(處理溫度在大約60～80 ℃)，此條件下該酶活性高，穩(wěn)定性也較好，對于葡萄酒增香具有一定的應(yīng)用潛力。

2.2 黑曲霉β-葡萄糖苷酶對酒精的耐性

少量酒精的存在會對β-葡萄糖苷酶有激活作用(圖2(a))，這一結(jié)果與Riccardo等[15]的報道一致，可能是由于酒精作為底物催化水解過程中糖基陽離子的受體。該酶在酒精的體積分數(shù)較低范圍內(nèi)(酒精度0～4% vol)具有一定的穩(wěn)定性，酒精的體積分數(shù)為0.04時(酒精度4% vol)，25 ℃保存48 h后殘留酶活性為65.37%(圖2(b))。酒精的體積分數(shù)大于0.05時(酒精度大于5% vol)，隨酒精體積分數(shù)的升高及保存時間的延長，該酶的穩(wěn)定性隨之下降顯著(圖2(b))。在紅白葡萄酒的釀造過程中，隨著發(fā)酵的進行酒精的體積分數(shù)不斷增加，一般酒精的體積分數(shù)最終會達到0.10～0.14(酒精度10%～14% vol)。以上結(jié)果表明，該黑曲霉β-葡萄糖苷酶在葡萄酒發(fā)酵的前期和中期對酒進行增香具有一定的潛力，在發(fā)酵的后期和貯酒階段，由于酒精的體積分數(shù)較高會影響該酶的穩(wěn)定性，從而影響其對酒的增香作用。因此，在葡萄酒發(fā)酵起始階段添加β-葡萄糖苷酶可能會對葡萄酒起到一定的增香作用。

圖1 溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖2 不同體積分數(shù)的酒精對β-葡萄糖苷酶活性的影響

2.3 黑曲霉β-葡萄糖苷酶對pH值的耐性

不同pH值條件下該黑曲霉β-葡萄糖苷酶活性的測定結(jié)果表明(圖3(a))，該酶的最適反應(yīng)pH值為4.55。pH3.4條件下該酶活性為最高酶活性時的35.14%。25 ℃條件下，隨pH值降低該酶的穩(wěn)定性顯著降低(圖3(b))：pH 3.45，4.08，4.80分別保存12，24 h后，該酶的殘留酶活性分別為20.50%，40.67%，64.60%，6.90%，15.43%，46.70%，表明該酶在較低的pH值條件下穩(wěn)定性較差。通常在葡萄酒釀造過程中，葡萄汁的pH值一般低于3.6，因此該酶在葡萄酒釀造環(huán)境活性和穩(wěn)定性受到不利影響，對葡萄酒的增香作用有限。若要增加該β-葡萄糖苷酶在葡萄酒發(fā)酵階段的增香作用，應(yīng)該篩選耐酸性高的β-葡萄糖苷酶，或進一步對該酶實施固定化增加其耐受性，以期達到更好的葡萄酒增香作用。

圖3 不同pH值對β-葡萄糖苷酶活性的影響

2.4 黑曲霉β-葡萄糖苷酶對SO2的耐性

SO2的質(zhì)量濃度低于40 mg/L時較為穩(wěn)定。隨SO2質(zhì)量濃度的升高，酶穩(wěn)定性降低(圖4)。SO2的質(zhì)量濃度為40 mg/L和60 mg/L時，保存48 h后殘留酶活性分別為72.31%，42.70%，表明該酶對較低的SO2質(zhì)量濃度具有一定的耐受力。葡萄酒原料含有雜菌，釀酒過程中常加入SO2來防腐殺菌和抗氧化。SO2的添加量受原料好壞程度的影響，原料無損害、無霉變、成熟度高、含酸量低時，紅白葡萄酒需分別加入30～50，40～60 mg/L的SO2；葡萄原料無損害、無霉變、成熟度中、含酸量高時，紅白葡萄酒需分別加入50～80，60～80 mg/L的SO2；葡萄原料破損、霉變時紅白葡萄酒需加入80～100 mg/L的SO2。根據(jù)該酶的耐受程度，該酶適于葡萄原料比較好時的釀造條件。

圖4 不同質(zhì)量濃度的SO2對β-葡萄糖苷酶活性的影響

2.5 黑曲霉β-葡萄糖苷酶對糖的耐性

黑曲霉β-葡萄糖苷酶在不同質(zhì)量濃度的葡萄糖條件下，其酶活性隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增加而降低(圖5)。當葡萄糖的質(zhì)量濃度為160，180，200 g/L時，該酶活性分別為原酶活性的59.89%，53.13%和48.01%，表現(xiàn)出較好的糖耐受性。有文獻報道[13,16]，葡萄漿果和釀酒酵母均還有β-葡萄糖苷酶，但這些內(nèi)源酶對葡萄酒釀造環(huán)境耐性低，對葡萄酒的增香作用不明顯。微生物來源的β-葡萄糖苷酶對糖的耐受性較低，尤其是酵母來源的β-葡萄糖苷酶對糖的耐受性較低，不適合于葡萄酒的釀造環(huán)境[17,18]，由此可見，該黑曲霉來源的β-葡萄糖苷酶糖耐受性相對較高，應(yīng)用于葡萄酒增香領(lǐng)域具有一定的優(yōu)勢。

圖5 不同質(zhì)量濃度的糖對β-葡萄糖苷酶活性的影響

2.6 黑曲霉β-葡萄糖苷酶對模擬釀造環(huán)境的耐受性

在模擬葡萄酒釀造環(huán)境下，該黑曲霉β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的測定結(jié)果表明，該酶在葡萄酒釀造環(huán)境中具有一定的耐受性，保存2，4，6 d后殘留酶活性分別為24.03%，18.93%，13.25%；保存10 d后殘留酶活性為0。由此，若用于葡萄酒的增香處理，建議處理時間控制在大約6～8 d(圖6)。

圖6 黑曲霉β-葡萄糖苷酶在模擬釀造環(huán)境中的穩(wěn)定性

3 討論和結(jié)論

黑曲霉(CGMCC 3. 316)β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適反應(yīng)pH值為4.55，低溫時(20～30 ℃)該酶表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性，但反應(yīng)活性較低，對葡萄酒增香不利；在葡萄酒釀造pH 3.4條件下酶活性較低，對酸的耐性較差，對葡萄酒增香不利；少量酒精對該β-葡萄糖苷酶有激活作用，在酒精的體積分數(shù)為0～0.04范圍內(nèi)(酒精度0～4%vol)具有較高的穩(wěn)定性，穩(wěn)定性隨酒精的體積分數(shù)增加而下降，在酒精發(fā)酵前期用于葡萄酒增香較好；該β-葡萄糖苷酶在SO2的質(zhì)量濃度低于40 mg/L時較為穩(wěn)定，隨SO2質(zhì)量濃度的升高酶穩(wěn)定性降低，適用于質(zhì)量較好的葡萄原料；該酶表現(xiàn)出較好的糖耐受性。綜合該酶在釀造環(huán)境中的耐受性，若用于葡萄酒的增香處理，建議處理時間控制在6～8 d。

[1] 侯曉瑞.甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[2] 郭慧女,康文懷,徐巖,等.微生物β-D-葡萄糖苷酶對玫瑰香(Muscat)葡萄結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的影響[J].食品工業(yè)科技,2011,32(1):81-84,88.

[3] 劉玥珊.葡萄果實糖苷酶活性、香氣糖苷總量及其與成熟指標的關(guān)聯(lián)分析[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2015.

[4] 問亞琴,崔婧,潘秋紅.葡萄果實糖苷鍵合態(tài)萜烯物質(zhì)的研究進展[J].園藝學(xué)報, 2012,39(9):1 679-1 686.

[5] 喬慧.葡萄酒中酒酒球菌分離鑒定及不同產(chǎn)區(qū)菌株糖苷酶活性研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2014.

[6] 桑葦,唐柯,徐巖,等.黑曲霉β-葡萄糖苷酶對葡萄酒酶解增香調(diào)控及香氣物質(zhì)的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41(5):8-13.

[7] 馬騰.高產(chǎn)耐熱β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株選育及其基因克隆[D].秦皇島: 河北科技師范學(xué)院,2012.

[8] Souza,F H M,Nascimento C V,Rosa J C,et al.Purification and biochemical characterization of a mycelial glucose- and xylose-stimulated β-glucosidase from the thermophilic fungusHumicolainsolens[J].Processbiochemistry,2010，45(2): 272-278.

[9] Hu H L,Brink J,Gruben B S,et al.Improved enzyme production by co-cultivation ofAspergillusnigerandAspergillusoryzaeand with other fungi[J].International Biodeterioration & Biodegradation,2011，65:248-252.

[10] 李麗陽，吳志軍，葛文中，等.總狀毛霉酶水解大豆異黃酮苷條件的優(yōu)化[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2014，26(4):40-45.

[11] 高玉榮，徐國棟，李大鵬，等.富含游離態(tài)異黃酮豆豉的制曲工藝優(yōu)化[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2015，27(2):57-61.

[12] 張楊，李瑩，艾士奇，等.基于WSC-9 的人工組建的簡化復(fù)合菌系的纖維素分解能力與酶活特性[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2016，28(2):80-84.

[13] Swangkeaw J,Vichitphan S,Butzke C E,et al.Characterization of β-glucosidases fromHanseniasporasp.andPichiaanomalawith potentially aroma-enhancing capabilities in juice and wine[J].World Microbiol Biotechnol, 2011,27(10):423-430.

[14] 楊芮.葡萄酒乳酸菌中β-葡萄糖苷酶性質(zhì)研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2013.

[15] Barbagallo R N,Spagna G,Palmeri R,et al.Selection,characterization and comparison of β-glucosidase from mould and yeasts employable for enological applications[J].Enzyme and Microbial Technology,2004,35(1):58-66.

[16] Wang Y,Kang W,Xu Y,et al.Effect of different indigenous yeast β-glucosidases on the liberation of bound aroma compounds[J].Journal of the Institute of Brewing,2012,117(2):230-237.

[17] Leite R S R,Alves-Prado H F,Cabral H,et al.Production and characteristics comparison of crude β-glucosidases produced by microorganisms Thermoascus aurantiacus e Aureobasidium pullulans in agricultural wastes[J].Enzyme Microb Technol,2008，43(6):391-395.

[18] Swangkeaw J,Vichitphan S,Butzke C E,et al.The characterisation of a novelPichiaanomalaβ-glucosidase with potentially aroma-enhancing capabilities in wine[J].Ann Microbiol,2009,59(2):335-343.

(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Stabilities of β-glucosidases from Aspergillus niger (CGMCC 3.316) in Wine Brewing Conditions

YAN Hejing1, QI Bingbing1, ZHAO Linlin2, LIU Chang1

(1 Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao Hebei, 066600; 2 Wuhan Scientific Research & Design Institute, State Administration for Grain Reservation, Wuhan, Hubei, 430079; China)

In order to evaluate the application potentiality ofAspergillusniger(CGMCC 3.316) β-glucosidases in wine aroma enhancing, the stabilities of the enzyme on the brewing temperature, alcohol content, sugar content and SO2content were studied in this test. The results indicated that 60 ℃ was the optimal temperature for the enzyme, meanwhile it expressed very stable in brewing temperature (20～30 ℃). A small content of alcohol could activate the enzyme activity, but the activity was greatly inhibited when the alcohol content overpassed 8% or more. pH4.55 would be the optimal for the enzyme, while its activity might be lower at brewing pH3.4 and it displayed unstable in such acidic condition. The enzyme was stable when the SO2content lowed 40 mg/L. The enzyme also showed some stability in the presents of different contents of sugar. Based on the above studies, 6～8 days treatment of the enzyme would be recommended when used in wine-making process. In addition, some engineering techniques could be employed to increase the enzyme activity in low temperature and its stability in acidic condition so as to enhance wine aroma.

Aspergillusniger; β-glucosidase; brewing factor; stability

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.04.002

河北科技師范學(xué)院2013年博士科研啟動基金項目；河北省教育廳項目(項目編號：QN2014143)；秦皇島市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(項目編號：201101A176)。

2016-10-17; 修改稿收到日期: 2016-11-23

TS262.6

A

1672-7983(2016)04-0008-06

閻賀靜(1978-)，女，博士，副教授。主要研究方向：釀造微生物。

*通訊作者，女，博士，副教授。主要研究方向：釀造微生物。E-mail: yhj2203yhj@163.com。