鄒 靜，孟 軍，張建才，郭 碩

(河北科技師范學院食品科技學院，河北 秦皇島，066000)

利用基因工程提高釀酒酵母半乳糖代謝

鄒 靜*，孟 軍，張建才，郭 碩

(河北科技師范學院食品科技學院，河北 秦皇島，066000)

為了提高釀酒酵母半乳糖利用速率，減弱葡萄糖阻遏半乳糖代謝，研究了負代謝調(diào)控基因GAL80,GAL6以及MIG1基因?qū)Π肴樘谴x的影響。通過重復利用loxp-KanMX-loxp抗性基因?qū)AL80，GAL6以及MIG1基因進行單敲除、雙敲除及三敲除，共構(gòu)建了7株工程菌株。結(jié)果表明，7株工程菌株的半乳糖利用速率、乙醇產(chǎn)率均加快。其中，GAL80和MIG1雙敲除菌株FY-501α的半乳糖代謝速率為0.916 g·(L·h)-1，較親本提高44.71%，乙醇產(chǎn)率為0.329 g·(L·h)-1，較親本提高46.22%，而在FY-501α基礎(chǔ)上繼續(xù)敲除GAL6得到GY-501α，其半乳糖代謝速率以及乙醇產(chǎn)率均未見提高。7株菌的葡萄糖阻遏效應也得到減弱，其中FY-501α的葡萄糖阻遏效應較親本減弱42.11%，其次為EY-502α，F(xiàn)Y-502α和FY-503α，減弱31.57%。阻斷半乳糖代謝途徑的負調(diào)控基因可以加速半乳糖代謝、減弱葡萄糖阻遏效應。

GAL基因；半乳糖代謝；葡萄糖阻遏；MIG1；GAL80

工業(yè)上用糖蜜、木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇時，酵母首先會將其分解成半乳糖和葡萄糖的混合物。對于酵母而言，葡萄糖是優(yōu)勢碳源，可以快速利用，而半乳糖作為酵母非常規(guī)碳源，葡萄糖的存在會抑制半乳糖的代謝，這就是所謂的葡萄糖阻遏效應。因此，半乳糖的代謝速度成為限制上述有機碳源利用的限速因素。

研究表明，酵母胞內(nèi)半乳糖是通過Leloir途徑進行代謝的，而該途徑所需酶是由GAL系列基因編碼[1～3]。GAL屬于誘導調(diào)控型基因，由1個激活蛋白Gal4和3個抑制蛋白Gal8,Gal6和Mig1來調(diào)控[4～7]。本次主要研究MIG1,GAL80及GAL6 3個基因?qū)︶劸平湍赴肴樘谴x的影響，通過單敲除、雙敲除及3個基因全部敲除共構(gòu)建了7株轉(zhuǎn)化子，通過對比這7株突變子的半乳糖代謝速率及葡萄糖阻遏情況，來分析阻斷負調(diào)控基因在加速半乳糖代謝上的作用。

1 實驗材料

1.1 菌株和質(zhì)粒

本實驗所用的酵母菌株、大腸桿菌菌株及質(zhì)粒列于表1,表2，其中pUC-MABK質(zhì)粒用于敲除MIG1基因，pUC-G6ABK質(zhì)粒用于敲除GAL6基因，pUC-G8ABK質(zhì)粒用于敲除GAL8基因。

1.2 主要溶液

微量元素溶液：3 g/L EDTA,0.09 g/L CaCl2·2H2O,0.90 g/L ZnSO4·7H2O,0.60 g/L FeSO4·7H2O,200 mg/L H3BO3,156 mg/L MgCl2·2H2O,80 mg/L Na2MoO4·2H2O;60 mg/L CoCl2·2H2O,60 mg/L CuSO4·5H2O以及20 mg/L KI。用NaOH調(diào)pH值至4.0，高溫蒸汽滅菌后備用。

維生素溶液：50 mg/L生物素，200 mg/L氨基苯甲酸，1 g/L煙酸，1 g/L泛酸鈣，1 g/L鹽酸吡哆醇，1 g/L維生素B1，以及25 g/L肌醇，pH 6.5，膜過濾后4 ℃儲存。

表1 本實驗所用菌株性質(zhì)及來源

表2 本實驗所用質(zhì)粒性質(zhì)及來源

1.3 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基用于DH5α的培養(yǎng)；YEPD用于酵母菌的培養(yǎng)；重組子篩選培養(yǎng)基為YEPD中添加200 μg/mL的G418。半乳糖培養(yǎng)基(成分為半乳糖60 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，10 mL/L 微量元素溶液以及1 mL/L 維生素溶液)用于測定重組菌株半乳糖利用能力；葡萄糖培養(yǎng)基(成分為葡萄糖60 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，10 mL/L微量元素溶液以及1 mL/L 維生素溶液)主要用于測定重組菌株葡萄糖利用能力；葡萄糖阻遏培養(yǎng)基(成分為半乳糖30 g/L，葡萄糖30 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，10 mL/L微量元素溶液以及1 mL/L維生素溶液)用于測定重組菌株葡萄糖阻遏情況。

2 實驗方法

2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

以釀酒酵母AY5α基因組為模板，利用PCR技術(shù)分別擴增3個抑制子基因(GAL80，GAL6，MIG1基因)的上下游片段，通過限制性內(nèi)切酶鏈接到受體質(zhì)粒pUC19上。然后以pUG6為模板，擴增出loxp-KanMX-loxp卡那霉素抗性片段插入到已連接抑制子基因片段的質(zhì)粒中，分別得到3個敲除質(zhì)粒pUC-G8ABK，pUC-G6ABK和pUC-MABK。3個敲除質(zhì)粒圖譜見圖1，所需PCR引物見表3。

2.2KanMX抗性基因的重復利用

來源于P1噬菌體的Cre重組酶(Cause Recombination Enzyme)，是可以特異性識別靶位點(loxp位點)，并催化靶位點斷裂然后重新連接DNA的一種重組酶，屬于Int家族。pGSH47質(zhì)粒在半乳糖誘導下可以編碼Cre重組酶，從pUG6質(zhì)粒上擴增出的KanMX抗性基因的兩側(cè)各含有1個loxp位點，且2個loxp位點同向，因此當Cre重組酶表達時，2個loxp位點中的KanMX基因可以被切除，再把2個loxp位點的剩余部分重新連接在一起，從而實現(xiàn)KanMX篩選標記的敲除[9]。

2.3 突變株的構(gòu)建

利用PCR法，以已構(gòu)建的3個敲除質(zhì)粒為模板，分別擴增出MIG1基因同源重組片段MIG1A-KanMX-MIG1B，GAL6基因同源重組片GAL6A-KanMX-GAL6B片段，以及GAL80基因同源重組片段GAL80A-KanMX-GAL80B基因片段，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法化轉(zhuǎn)AY5α。挑在抗性平板上菌落較大的為目的菌，然后進行PCR法驗證，重組子驗證引物見表4。

表3 質(zhì)粒構(gòu)建過程中所需引物

表4 重組子重組驗證引物

2.4 重組子半乳糖、葡萄糖利用能力測定

將7株突變株及其親本AY5α用YEPD培養(yǎng)基150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，經(jīng)無菌水離心洗滌后，分別接種到150 mL葡萄糖培養(yǎng)基和半乳糖培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)，每隔一定時間利用HPLC法測發(fā)酵液中的葡萄糖或半乳糖的質(zhì)量濃度，以此計算半乳糖和葡萄糖的利用情況。

2.5 重組子葡萄糖阻遏情況測定

將7株突變株及親本AY5α經(jīng)過一級培養(yǎng)后，用無菌水離心洗滌3次后，分別接種到葡萄糖阻遏培養(yǎng)基中。每隔一定時間測定培養(yǎng)基中殘存的葡萄糖和半乳糖，以此計算7株重組子和親本的葡萄糖阻遏情況。

2.6 發(fā)酵液中糖含量的測定

對不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液進行取樣，然后迅速過0.45 μm的醋酸纖維膜，然后放入到-20 ℃冰箱冷凍。所有發(fā)酵液中的糖、乙醇均用高效液相色譜(HPLC)法來測定。測定條件為：流動相為5 mmol/L的稀硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，采用示差檢測器，柱溫為65 ℃，柱子為Aminex HPX-87H C18柱子。

3 結(jié)果與分析

3.1 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

通過PCR擴增技術(shù)分別擴增出半乳糖代謝阻遏基因片段，并將其鏈接在pUC19基礎(chǔ)質(zhì)粒上，然后將PCR擴增出的loxp-KanMX-loxp片段插入到2個阻遏基因片段中間，構(gòu)建成半乳糖代謝阻遏基因的敲除質(zhì)粒，3個敲除質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜見圖1。pUC-MABK質(zhì)粒構(gòu)建過程驗證的凝膠電泳圖見圖2，pUC-G8ABK質(zhì)粒構(gòu)建過程驗證的凝膠電泳圖見圖3，pUC-G6ABK質(zhì)粒構(gòu)建過程驗證的凝膠電泳圖見圖4。

圖1 半乳糖代謝阻遏基因敲除質(zhì)粒A，MIG1基因敲除質(zhì)粒pUC-MABK；B，GAL80基因敲除質(zhì)粒pUC-G8ABK；C，GAL6基因敲除質(zhì)粒pUC-G6ABK

圖2 pUC-MABK構(gòu)建驗證A，pUC-MA酶切及PCR結(jié)果(M，DL5000 marker；1，pUC-MA用KpnI和BamHI雙酶切，可以切出535 bp和2 686 bp兩條帶；2，以pUC-MA為模板，以Mup1,Mdown1為引物擴增上游同源臂MIG1A結(jié)果)。B，pUC-MAB酶切及PCR結(jié)果(M，DL5000 marker；1，pUC-MAB用HindIII和EcoRI雙酶切，切出457 bp和3 221 bp兩條帶；2，以pUC-MAB為模板，以Mup2,Mdown2為引物，PCR擴增下游同源臂MIG1B結(jié)果)。C，pUC-MABK酶切及PCR結(jié)果(M，DL5000 marker；1，pUC-MABK用EcoRI和BamHI雙酶切，切出1 613 bp和3 678 bp兩條帶；2，以pUC-MABK為模板，以Kanup2和Kandown2為引物，PCR擴增出抗性基因KanMX結(jié)果)。

圖3 重組質(zhì)粒pUC-G8ABK構(gòu)建驗證M，DL5000 Marker;1，質(zhì)粒pUC-G8A用EcoRI進行單酶切，切出677 bp和2 686 bp兩條帶;2，以pUC-G8A質(zhì)粒為模板，以G80up1和G80down1為引物，PCR擴增上游同源臂GAL8A結(jié)果；3，pUC-G8AB質(zhì)粒用KpnI進行單酶切，切出720 bp和3 363 bp兩條帶;4，以pUC-G8A質(zhì)粒，以G80up2和G80down2為引物，PCR擴增下游同源臂GAL8B結(jié)果；5，pUC-G8AKB質(zhì)粒用HindIII進行單酶切，切出1 613 bp和4 083 bp兩條帶; 6，以pUC-G80AKB質(zhì)粒為模板，以Kanup1和Kandown1為引物，PCR擴增抗性基因KanMX結(jié)果。

圖4 重組質(zhì)粒pUC-G6AKB構(gòu)建驗證M，DL5000 Marker; 1，質(zhì)粒pUC-G6A使用EcoRI和進行單酶切，切出646 bp和2 686 bp兩條帶; 2，以質(zhì)粒pUC-G6A為模板，以G6up1和G6down1為引物，PCR擴增上游同源臂GAL6A結(jié)果；3，質(zhì)粒pUC-G6AB用HindIII進行雙酶切，切出664 bp和3 332 bp兩條帶; 4，以質(zhì)粒pUC-G6AB為模板，以G6up2和G6down2為引物，PCR擴增下游同源臂GAL6B結(jié)果；5，質(zhì)粒pUC-G6AKB用KpnI進行雙酶切，切出1 613 bp和3 996 bp兩條帶; 6，以質(zhì)粒pUC-G6AKB為模板，以Kanup1和Kandown1為引物，PCR擴增抗性基因KanMX結(jié)果。

3.2 阻遏基因缺失對菌株葡萄糖利用的影響

基因改造過程中，基因的表達或者敲除可能會對細胞的一些生理特性產(chǎn)生影響[8]，為了確認敲除這3個阻遏基因是否會對菌體產(chǎn)生影響，分別測試了親本和7株突變株厭氧情況下葡萄糖利用情況。結(jié)果表明，7株菌葡萄糖利用情況與親本一致，葡萄糖利用速率、乙醇產(chǎn)率相同，耗糖曲線一致(表5)。因此在厭氧條件下，分別敲除3個阻遏基因?qū)ξ⑸锢闷咸烟菬o影響。

表5 親本及7株突變株葡萄糖發(fā)酵數(shù)據(jù)比較

3.3 阻遏基因缺失對菌株半乳糖利用的影響

將親本與7株突變株分別接種到半乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧發(fā)酵72 h，每隔12 h取樣，用高效液相色譜測培養(yǎng)液中糖的質(zhì)量濃度，半乳糖耗糖曲線見圖5(A，B)，具體計算數(shù)值見表6。結(jié)果表明，親本AY5α半乳糖消耗速率最慢，發(fā)酵72 h后殘?zhí)菫?1.52 g/L，半乳糖利用速率為0.633 g·(L·h)-1，而其它7株突變株發(fā)酵72 h后的殘?zhí)蔷陀谟H本，說明敲除半乳糖阻遏基因可以加速半乳糖的利用。在3株單敲除菌株中，敲除GAL80基因的EY-502α的半乳糖利用速率最快為0.775 g·(L·h)-1。其次為敲除MIG1基因的菌株EY-501α，其半乳糖利用速率為0.75 g·(L·h)-1。耗時最長的為Δgal6突變株EY-503α，發(fā)酵72 h后殘?zhí)堑馁|(zhì)量濃度為6.2 g/L，半乳糖利用速率為0.707 g·(L·h)-1。3株單敲除菌株的乙醇生成速率與其耗糖速率一致，即半乳糖消耗的越快、乙醇產(chǎn)生的越快。這表明對于工程菌AY5而言，厭氧條件下GAL80基因?qū)Π肴樘抢糜绊懽畲?，其次為MIG1基因，影響最小的為GAL6基因。

3株雙敲除菌株中，Δmig1Δgal80突變株FY-501α的半乳糖消耗速率最快，為0.916 g·(L·h)-1。其次為Δgal80Δgal6突變株FY-502α，其半乳糖利用速率為0.879 g·(L·h)-1。而Δmig1Δgal6菌株FY-503α半乳糖利用速率最慢，且低于Δgal80單敲菌株EY-502α。三敲除菌株GY-501α半乳糖利用速率也較快，72 h內(nèi)完成發(fā)酵，半乳糖利用速率為0.900 g·(L·h)-1，但較Δmig1Δgal80突變株FY-501α慢，且乙醇終濃度及乙醇生成速率也較FY-501α低。Ostergaard等[8]以野生型菌株為受體菌，分別研究了在耗氧條件下Δgal6，Δgal80Δmig1，Δgal6Δgal80Δmig1突變株半乳糖利用情況。雖然3個基因的缺失也均可以加速半乳糖的利用，但是3個基因?qū)Π肴樘窍乃俾实挠绊憛s與本次研究的結(jié)果有較大差異：其在耗氧情況下，Δgal6Δgal80Δmig1突變株利用半乳糖最快，其最大比半乳糖消耗率為4.25 mmol·(L·h)-1，其次為Δgal6突變株，而影響最小的為Δgal80Δmig1突變株。這就表明，在耗氧情況下，GAL6基因?qū)Π肴樘抢玫挠绊懽畲?；在厭氧情況下，GAL6基因的影響明顯減小。而GAL80，MIG1成為抑制半乳糖利用的主要阻遏基因。因此，在本次實驗條件下，MIG1，GAL80基因缺失是加速半乳糖利用的最佳組合，而繼續(xù)敲除GAL6對加速半乳糖利用影響不大，反倒會影響菌體的其它性能。

圖5 親本與7株突變株半乳糖消耗曲線

菌株 半乳糖利用速率/[g·(L·h)-1]乙醇終濃度/(g·L-1)乙醇生成速率/[g·(L·h)-1]AY-5α0.633±0.061b16.23±1.750.225±0.012EY-501α0.751±0.053b20.94±1.710.291±0.021EY-502α0.775±0.051b21.87±1.610.303±0.020EY-503α0.707±0.049b18.82±1.750.261±0.029FY-501α0.916±0.048a23.67±1.400.329±0.023FY-502α0.879±0.047a23.23±1.630.323±0.037FY-503α0.753±0.056b20.91±1.490.290±0.025GY-501α0.900±0.071a23.45±1.500.326±0.031

注：a為發(fā)酵60 h內(nèi)的半乳糖利用速率；b為發(fā)酵72 h內(nèi)的半乳糖利用速率。

3.4 阻遏基因缺失對菌株葡萄糖阻遏效應的影響

利用高效液相色譜測試親本與7株菌接種到葡萄糖-半乳糖混合培養(yǎng)基中2種糖的消耗情況。結(jié)果表明，親本AY5α存在較為嚴重的葡萄糖阻遏現(xiàn)象(圖6 A)，當葡萄糖存在時半乳糖基本不消耗，只有葡萄糖基本耗盡時半乳糖才開始被利用，整個發(fā)酵周期為114 h。對于7株突變株而言，葡萄糖阻遏得到不同程度的消弱。在3株單敲除菌株中，3株菌均可在葡萄糖存在的情況下利用半乳糖，發(fā)酵周期均較親本縮短，其中葡萄阻遏程度減緩最明顯的為Δgal80菌株EY502α(圖6 C)，為78 h，較親本的114 h縮短了31.6%。阻遏程度減緩最少的為Δgal6菌株EY503α，耗時102 h，較親本縮短了12 h。

在3株雙敲除菌株中，葡萄糖阻遏程度較3株單敲除菌株得到進一步的消弱，發(fā)酵時間也進一步縮短。其中，縮短最明顯的為Δgal80Δmig1突變株FY-501α，僅為66 h(圖6 E)，較親本縮短了42.1%。而Δgal80gal6菌株FY-502α與Δgal6mig1突變株FY-503α2株菌的耗糖曲線基本相同，整個發(fā)酵周期均為78 h(圖6 F，圖6 G)。對于三敲除菌株GY-501α而言，其葡萄糖阻遏現(xiàn)象也得到消弱，但是減緩程度要低于Δgal80mig1突變株FY-501α，發(fā)酵周期為78 h。Ostergaard等[10，11]研究表明，耗氧條件下，單敲除、雙敲除以及3個阻遏基因全部敲除都可以減緩葡萄糖阻遏現(xiàn)象，但是減緩效果最好的是Δgal6Δgal80Δmig1突變株。而厭氧條件下，從上述數(shù)據(jù)可以看出，在緩解葡萄糖阻遏方面，雙敲除要優(yōu)于單敲除的效果，其中敲除GAL80和MIG1的效果最為明顯。綜合考慮，確定敲除GAL80和MIG1為加速半乳糖利用的最佳組合。

3.5 突變株遺傳穩(wěn)定性

7株突變株中選FY-501α來驗證其遺傳穩(wěn)定性。將FY-501α在無抗性的YEPD斜面上進行反復傳代20代，并取第1，5，10，15，20代進行PCR驗證、半乳糖發(fā)酵實驗和混合糖發(fā)酵實驗。

PCR驗證結(jié)果顯示，各代在無抗性的條件下，均保持了MIG1和GAL80基因完全缺失的特性。半乳糖發(fā)酵和混合糖發(fā)酵實驗的結(jié)果表明，各代菌株發(fā)酵周期相同，糖的質(zhì)量濃度變化曲線區(qū)別較小，說明各代重組菌株發(fā)酵性能穩(wěn)定(數(shù)據(jù)未列出)。

4 結(jié) 論

釀酒酵母中半乳糖代謝作為替補代謝途徑是受到嚴格調(diào)控的，3個負調(diào)控蛋白對半乳糖代謝速率均有影響。3個調(diào)控蛋白中，gal80對半乳糖代謝影響最大，其次是mig1，最后是gal6。而mig1在減弱葡萄糖阻遏效應方面影響最明顯，其次是gal80，gal6的影響最小。

3個阻遏蛋白兩兩敲除中，效果最好的是gal80和mig1雙敲除菌株，其半乳糖代謝速率增加44.71%，葡萄糖阻遏減弱42.11%，乙醇產(chǎn)率增加46.22%；其次是gal80和gal6雙阻遏菌株，其半乳糖代謝速率增加38.86%，葡萄糖阻遏減緩31.57%，乙醇產(chǎn)率增加43.56%。而在雙敲除基礎(chǔ)上，重復利用KanMX抗性基因得到Δgal80gal6mig1三敲除菌株，其半乳糖利用速率沒有繼續(xù)提升，反倒略降，葡萄糖阻遏現(xiàn)象也沒有繼續(xù)得到緩解，而且菌體細胞出現(xiàn)形狀上的改變，因此釀酒酵母在以半乳糖為碳源生產(chǎn)乙醇的過程中，去除MIG1和GAL80對加速半乳糖代謝、緩解葡萄糖阻遏現(xiàn)象更有效。

圖6 親本及7株突變株的葡萄糖阻遏效應其中A為親本AY5α；B為EY-501α；C為EY-502α；D為EY-503α；E為FY-501α；F為FY-502α；G為FY-503α；H為GY-501α

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(責任編輯：朱寶昌，楊靜)

Improvement of Galactose Metabolism ofSaccharomycescerevisiaevia Gene Engineering

ZOU Jing, MENG Jun, ZHANG Jiancai, GUO Shuo

(College of Food Science and Technology, Hebei Normal University of Science & Technology，Qinhuangdao Hebei，066600，China)

The galactose metabolism productivity is much lower than that of glucose inSaccharomycescerevisiae. An effective approach was undertaken to improve galactose utilization ability and ethanol productivity via deleting the negative regulated genes (GAL80,GAL6 andMIG1) that controlled the expression of theGALgenes. A resistance gene fragmentloxp-KanMX-loxpwas used repeatedly to knockout the negative regulated genesGAL80,GAL6 andMIG1, and seven engineered transformants were constructed. Compared with parent AY-5α, galactose metabolism rates increased in all seven engineered transformants. The galactose uptake rates and ethanol productivity ofΔgal80mig1 strain FY-501α reached as high as 0.916 g·(L·h)-1and 0.329 g·(L·h)-1, respectively, which increased 44.71% and 46.22% with the wild-type strain AY-5α. The glucose repression was also relieved in seven engineered strains. The consumption time in galactose-glucose mixture media of FY-501α was 66 h, with 42.11% down-off.GAL80 andMIG1 played more important roles in galactose fermentation ofSaccharomycescerevisiaethanGAL6 did.

GALgenes; galactose metabolism; glucose repression;MIG1;GAL80

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.04.003

河北科技師范學院博士啟動基金項目資助項目(項目編號：2013YB015)。

2016-12-05; 修改稿收到日期: 2016-12-19

S332.5

A

1672-7983(2016)04-0014-09

鄒靜(1979-)，女，博士，講師。主要研究方向：果酒微生物選育、果酒釀造以及工業(yè)微生物的基因工程改造。

*通訊作者，女，博士，講師，主要研究方向：果酒微生物選育、果酒釀造以及工業(yè)微生物的基因工程改造。E-mail：zoujing520315@126.com。