430060 武漢大學人民醫(yī)院

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microRNA在睪丸腫瘤中的最新進展

譚于龍綜述錢輝軍審校

430060 武漢大學人民醫(yī)院

關(guān)鍵詞：微小RNA；睪丸腫瘤；生物標志物

在世界范圍，睪丸腫瘤是泌尿生殖系統(tǒng)少見的腫瘤之一，只占泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的5%左右。然而，20~35歲的年輕男性睪丸腫瘤的發(fā)病率高于其他腫瘤。在我國，睪丸腫瘤占泌尿生殖系統(tǒng)的3%~9%[1]。2004年國際衛(wèi)生組織(WHO)將睪丸腫瘤的病理亞型分為：生殖細胞腫瘤(包括精原細胞瘤、卵黃囊瘤、畸胎瘤等)；性索/性腺間質(zhì)腫瘤(包括間質(zhì)細胞瘤、支持細胞瘤等)；其他非特異性間質(zhì)腫瘤。超過95%的睪丸癌為睪丸生殖細胞腫瘤(testicular germ cell tumor/TGCT)。睪丸癌多為單側(cè)發(fā)病，雙側(cè)發(fā)病者僅占1%左右。目前對睪丸腫瘤的發(fā)病機制還不十分清楚，危險因素包括隱睪或睪丸下降不全、家族遺傳因素、Klinefelter綜合征等。近年來，遺傳學研究的不斷進步，改善了臨床上對睪丸腫瘤的診斷和治療。表觀遺傳學研究作為遺傳學研究的新分支，有望為睪丸腫瘤的診斷及分型、制定治療方案和監(jiān)測治療效果、預(yù)測預(yù)后帶來一場革命。

1microRNA的合成、運輸及作用機制

隨著對人類基因組認識的不斷加深，我們現(xiàn)在認識到，只有不到2%的基因是由編碼區(qū)(外顯子)組成的，而這些編碼區(qū)就是合成mRNA的模版[2]。過去認為余下的基因沒有生物功能，然而，近20年來，這些非編碼區(qū)的功能被不斷發(fā)掘出來，對應(yīng)的RNA命名為非編碼RNA(non-coding RNA)[3]，其中一類稱為微小RNA(microRNA/miRNA)。原始miRNA(primary miRNA/pri-miRNA)是莖環(huán)樣結(jié)構(gòu)，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄得到，有多種miRNA基因定位于編碼基因的內(nèi)含子，其中的CpG島是miRNA轉(zhuǎn)錄的啟動子，此外，DNA甲基化可以導致RNA聚合酶Ⅱ基因沉默。原始miRNA在細胞核內(nèi)通過微處理器剪切為獨立的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，稱之為前體miRNA，然后通過exportin-5(輸出蛋白5)的協(xié)助運輸?shù)郊毎|(zhì)，經(jīng)Dicer剪切為長度19～22個核苷酸的成熟miRNA[4]。在細胞質(zhì)內(nèi)，miRNA完全或部分互補結(jié)合到靶mRNA，可以形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，控制mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制，最終調(diào)節(jié)靶基因的表達[5]。每種miRNA可以調(diào)控多種mRNA，并且每種mRNA也都受到多種miRNA的調(diào)控。據(jù)估計，人類有30%～70%的基因受miRNA調(diào)控[6]。研究表明，miRNA不僅參與正常的生理過程，如細胞分化、發(fā)育時序的控制、細胞凋亡、細胞增殖等等，還涉及一些病理過程，例如腫瘤的發(fā)生[7]。

Voorhoeve等發(fā)現(xiàn)，在野生型p53存在的情況下，表達miR-372和miR-373的細胞，可以對抗DNA損傷而防止衰老。對這個機制進一步的探討，發(fā)現(xiàn)miR-372和miR-373可以結(jié)合到p53的下游區(qū)域，并模仿無活性p53的功能[8]。鑒于腫瘤抑制因子2(large tumor suppressor 2，LATS2)刪失可以加速細胞增殖并最終導致腫瘤形成，研究者確定了LATS2是p53信號通路的潛在靶點。在一些LATS2突變的精原細胞瘤中，并不過表達miR-372和miR-373。LATS2蛋白抑制細胞周期蛋白E/CDK2的活性，從而中止細胞周期。最新的研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的精原細胞瘤和大多數(shù)胚胎癌都特定的過表達miR-372和miR-373[9]。

在精子發(fā)生的過程中，基因表達的時間性和空間性至關(guān)重要。精原細胞有周期性的轉(zhuǎn)錄沉默期，因而使得轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)顯得很重要[10]。無論是精原細胞瘤還是非精原細胞瘤，都是由早期的病灶發(fā)展而來，研究發(fā)現(xiàn)原位癌(carcinoma in situ，CIS)源于精原細胞形成精子的功能障礙[11]。在精子的生發(fā)過程中，miRNA表達譜的改變與原位癌的發(fā)生密切相關(guān)，生發(fā)期間上調(diào)的miRNA有miR-136、miR-743a、miR-463，下調(diào)的miRNA有miR290-5p、miR291a-5p、miR-294、miR-293，對以上miRNA的靶點進行分析，提示這些miRNA可能作用于PTEN、CXCR4以及Wnt/β-catenin信號通路，參與睪丸生殖細胞腫瘤的轉(zhuǎn)移[12]。PTEN是一種腫瘤抑制因子，可以阻斷PI3K信號通路，從而對細胞生長起到負性調(diào)節(jié)作用。因此PTEN的抑制促進細胞增殖加速，最終導致腫瘤發(fā)生。原位癌的侵襲性轉(zhuǎn)化也涉及PTEN的缺失[13]。此外，作為PIK激酶的負性調(diào)節(jié)因子，PIK3IP1的缺失與睪丸生殖細胞腫瘤的復發(fā)率上升有關(guān)[14]。miR-199a的功能取決于其下游靶點。在睪丸生殖細胞腫瘤中，MAFB可能是miR-199a-5p的靶點，并且miR-199a-5p的腫瘤抑制效應(yīng)是由MAFB調(diào)控[15]。

2microRNA的診斷意義

通過多重分析和檢測手段，發(fā)現(xiàn)miR-371-3和miR-367對于睪丸癌的診斷有重要意義。在診斷的過程中，可以從患者的血清中分離這些miRNA，并與正常對照做對比。在一項包含病理確診患者和正常對照的研究中，傳統(tǒng)的AFP和hCG檢查的診斷準確率不超過60%，并且對精原細胞瘤的診斷準確率僅有40%，但在結(jié)合TsmiR檢測之后，診斷準確率提高到98%[16]。在精原細胞瘤的診斷中，TsmiR檢測相對現(xiàn)有的AFP/hCG檢查的優(yōu)勢巨大。這個結(jié)果在探討其他起源的睪丸癌的研究中得到了進一步確認[17]。然而，對于患者血清中的miRNA水平是否可以預(yù)測存在轉(zhuǎn)移灶，還需要做進一步的研究。此外，miR-371-3和miR-367可用于高危人群的篩查，例如性發(fā)育障礙(disorders of sex development，DSD)的患者。另外一項報告顯示，如果血清中可以檢測到過表達的miR-371-373和miR-302，提示患有睪丸生殖細胞腫瘤[18]。Murray等分析8例睪丸生殖細胞瘤后發(fā)現(xiàn)，其血清miR-372和miR-367水平在診斷時普遍發(fā)生升高，并且血清miR-372和miR-367水平還與腫瘤總體積有關(guān)[17]。

最近有一項令人興奮的發(fā)現(xiàn)，那就是根據(jù)不同的miRNA表達譜，可以區(qū)別不同的睪丸癌亞型，例如miR-122a只在卵黃囊瘤中表達。miR-371-373和miR-302a-d簇在精原細胞瘤中上調(diào)，但仍低于正常睪丸組織中的水平，可以被用來鑒別畸胎瘤、胚胎細胞癌以及卵巢內(nèi)胚層竇瘤[19]。

3治療、預(yù)測治療反應(yīng)性與監(jiān)測

臨床上對睪丸生殖細胞腫瘤的治療與監(jiān)測，是基于血清生物標志物的檢測之上。然而，僅有不到60%的患者的AFP(a-fetoprotein/甲胎蛋白)、hCG(human chorionic gonadotropin/人絨毛膜促性腺激素)和LDH(lactatec dehydrogenase/乳酸脫氫酶)升高[20]。miRNA在體液內(nèi)高度穩(wěn)定，并且有些miRNA在腫瘤組織內(nèi)大量表達。在一項包括24例睪丸癌患者(20例為Ⅰ期，另外4例為Ⅱ或Ⅲ期)的臨床試驗中，抽取患者在治療前和治療后的血液標本進行分析，顯示所有患者的血清miR-371a-3p、miR-372、miR-373-3p水平明顯高于健康對照(17例)。在Ⅰ期睪丸癌患者中，3種血清miRNA水平在術(shù)后顯著降低，低于正常水平。而在Ⅱ或Ⅲ期患者，血清miRNA水平在治療結(jié)束后回歸到正常水平[21]。另一項研究，11例患者均為Ⅰ期睪丸癌(6例精原細胞瘤，5例非精原細胞瘤，平均年齡35歲)，對照組為12名健康男性(平均年齡36歲)，檢測患者在睪丸切除術(shù)之前和術(shù)后5天的血清miRNA水平，術(shù)前和術(shù)后的miRNA水平比較采用雙側(cè)Mann-Whitney U檢驗，結(jié)果顯示睪丸癌組術(shù)前miR-371-3水平顯著高于對照組，睪丸癌組術(shù)后的miR-371、miR-372、miR-373水平分別為術(shù)前的1/304、1/24、1/13(P<0.01)[22]。

順鉑是治療睪丸生殖細胞腫瘤的常用化療藥物，然而在化療結(jié)束后，順鉑的毒性還會持續(xù)很長一段時間，無疑降低了患者的生活質(zhì)量。癌細胞的miRNA可以影響其對化療的反應(yīng)性，調(diào)節(jié)細胞對化療藥物的敏感性。在一項研究中，研究者評估NT2細胞(睪丸生殖細胞腫瘤細胞株NTERA-2)[23]的miR-302a對順鉑細胞毒性的影響。在順鉑處理的NT2細胞，miR-302a出現(xiàn)了升高。miR-302a的下調(diào)可以增加NT2細胞對順鉑的敏感性，因為miR-302a的下調(diào)促進順鉑誘導的G2/M期阻滯，從而加速細胞凋亡。miR-302a還通過降低凋亡臨界值而提高順鉑的殺傷效果。并且，這種效應(yīng)在另外一種睪丸生殖細胞腫瘤細胞株NCCIT中也可以見到。此外，miR-302a還可以下調(diào)NT2細胞中p21的表達，從而提高細胞對順鉑的敏感性。miR-302a介導的細胞凋亡，還可以通過p53沉默而得到進一步加強。因此，miR-302a可以為睪丸生殖細胞腫瘤的治療干預(yù)提供一個新選擇[24]。另一個研究通過上調(diào)miR-383、抑制蛋白磷酸酶1和調(diào)節(jié)亞基10(PNUTS)的表達，顯著增強順鉑對NT2細胞造成的DNA損傷，這可能是因為miR-383影響H2AX基因的磷酸化[25]。通過轉(zhuǎn)染miR-372和miR-373到人類原生細胞，可以抑制致癌基因Rasv12調(diào)控的細胞增殖，可用來開辟新的治療方法。

4預(yù)后及隨訪

評判生育能力的常用方法是精子質(zhì)量分析和檢測血清激素水平，但這些手段的評價尺度不一，并且對睪丸的某些微小但意義重大的變化不敏感[26]。在動物模型中敏感性很高的組織病理學檢查方法，目前受限于各方面的條件而不能用于臨床[27]。因此，亟需發(fā)掘?qū)ΣG丸損傷敏感的生物標志物，以監(jiān)測生育功能，尤其是在進行生殖腺毒性化療之后。成熟的精子含有miRNA，異常的miRNA與少精癥和無精癥有關(guān)，提示miRNA對于精子發(fā)揮正常功能很重要[28]。有學者認為，精子遞送到卵子的miRNA在正常的胚胎發(fā)育中能發(fā)揮作用[29]。

對睪丸癌患者其睪丸切除術(shù)之前和之后的miRNA水平進行分析，提示miRNA可能具有預(yù)測預(yù)后價值。相比正常對照，所有睪丸切除術(shù)之后的血清標本中的miRNA水平?jīng)]有差異。目前，有研究正在探索TsmiR在隨訪中的作用。無論是在成人或是兒童睪丸癌患者，TsmiR都有望成為隨訪的重要工具[30]。

綜上所述，近年來隨著對miRNA研究的不斷深入，miRNA在睪丸腫瘤的診斷、治療及檢測中，可以同時具有高特異性和高敏感性，并易于檢測。雖然目前的研究表明miRNA有美好的前景，但無疑還需要經(jīng)過大量的研究才能證實。

參考文獻

[1]Albers P，Albrecht W，Algaba F，et al.European Association of Urology.EAU guidelines on testicular cancer：2011 update.European Association of Urology〔J〕.Actas Urol Esp,2012，36(3)：127-145.

[2]Al-Ali BM，Ress AL，Gerger A，et al.MicroRNAs in renal cell carcinoma：implications for pathogenesis，diagnosis，prognosis and therapy〔J〕.Anticancer Res,2012，32(9)：3727-3732.

[3]Ling H，F(xiàn)abbri M，Calin GA，et al.MicroRNAs and other non-coding RNAs as targets for anticancer drug development〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2013，12(11)：847-865.

[4]Cheung HH，Davis AJ，Lee TL，et al.Methylation of an intronic region regulates miR-199a in testicular tumor malignancy〔J〕.Oncogene,2011，30(31)：3404-3415.

[5]Guil S，Esteller M.DNA methylomes，histone codes and miRNAs：tying it all together〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2009，41(1)：87-95.

[6]Shenouda SK，Alahari SK.MicroRNA function in cancer：oncogene or a tumor suppressor?〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2009，28(3-4)：369-378.

[7]Cortez MA，Bueso-Ramos C，F(xiàn)erdin J，et al.MicroRNAs in body fluids--the mix of hormones and biomarkers〔J〕.Nat Rev Clin Oncol,2011，8(8)：467-477.

[8]Beillard E，Ong SC，Giannakakis A，et al.miR-Sens--a retroviral dual-luciferase reporter to detect microRNA activity in primary cells〔J〕.RNA,2012，18(5)：1091-1100.

[9]Looijenga LH，Stoop H，Biermann K.Testicular cancer：biology and biomarkers〔J〕.Virchows Arch,2014，464(3)：301-313.

[10]Papaioannou MD，Nef S.microRNAs in the testis：building up male fertility〔J〕.J Androl,2010，31(1)：26-33.

[11]Zimmermann C，Romero Y，Warnefors M，et al.Germ cell-specific targeting of DICER or DGCR8 reveals a novel role for endo-siRNAs in the progression of mammalian spermatogenesis and male fertility〔J〕.PLoS One,2014，9(9)：e107023.

[12]McIver SC，Stanger SJ，Santarelli DM，et al.A unique combination of male germ cell miRNAs coordinates gonocyte differentiation〔J〕.PLoS One,2012，7(4)：e35553.

[13]Memmel S，Sukhorukov VL，H?ring M，et al.Cell surface area and -

membrane folding in glioblastoma cell lines differing in PTEN and p53 status〔J〕.PLoS One,2014，9(1)：e87052.

[14]Gilbert DC，McIntyre A，Summersgill B，et al.Minimum regions of genomic imbalance in stage I testicular embryonal carcinoma and association of 22q loss with relapse〔J〕.Genes Chromosomes Cancer,2011，50(3)：186-195.

[15]Gu S，Cheung HH，Lee TL，et al.Molecular mechanisms of regulation and action of microRNA-199a in testicular germ cell tumor and glioblastomas〔J〕.PLoS One,2013，8(12)：e83980.

[16]Murray MJ，Coleman N.Testicular cancer：a new generation of biomarkers for malignant germ cell tumours〔J〕.Nat Rev Urol,2012，9(6)：298-300.

[17]Murray MJ，Halsall DJ，Hook CE，et al.Identification of microRNAs -

From the miR-371~373 and miR-302 clusters as potential serum biomarkers of malignant germ cell tumors〔J〕.Am J Clin Pathol,2011，135(1)：119-125.

[18]Palmer RD，Murray MJ，Saini HK，et al.Malignant germ cell tumors display common microRNA profiles resulting in global changes in expression of messenger RNA targets〔J〕.Cancer Res,2010，70(7)：2911-2923.

[19]Looijenga LH.Human testicular (non)seminomatous germ cell tumo-

urs：the clinical implications of recent pathobiological insights〔J〕.J Pathol,2009，218(2)：146-162.

[20]Guan XF，Deng YL，Liu QM，et al.Changes of AFP and beta-hCG in testicular tumors analyzed by a function method〔J〕.Zhonghua Nan Ke Xue,2013，19(1)：59-62.

[21]Dieckmann KP，Spiekermann M，Balks T，et al.MicroRNAs miR-371-3 in serum as diagnostic tools in the management of testicular germ cell tumours〔J〕.Br J Cancer,2012，107(10)：1754-1760.

[22]Belge G，Dieckmann KP，Spiekermann M，et al.Serum levels of microRNAs miR-371-3：a novel class of serum biomarkers for testicular germ cell tumors〔J〕.Eur Urol,2012，61(5)：1068-1069.

[23]Bohn P，Modzelewski R，Rouvet J，et al.Biodistribution and imaging of [99mTc]-HYNIC-RGD in MDA-MB-231 and NTERA-2 cancer cell xenografts〔J〕.Nucl Med Commun,2013，34(7)：709-717.

[24]Liu L，Lian J，Zhang H，et al.MicroRNA-302a sensitizes testicular e-

mbryonal carcinoma cells to cisplatin-induced cell death〔J〕.J Cell Physiol,2013，228(12)：2294-2304.

[25]Huang H，Tian H，Duan Z，et al.microRNA-383 impairs phosphorylation of H2AX by targeting PNUTS and inducing cell cycle arrest in testicular embryonal carcinoma cells〔J〕.Cell Signal,2014，26(5)：903-911.

[26]Hashemitabar M，Sabbagh S，Orazizadeh M，et al.A proteomic analysis on human sperm tail：comparison between normozoospermia and asthenozoospermia〔J〕.J Assist Reprod Genet,2015，32(6)：853-863.

[27]Hemmerle T，Neri D.The antibody-based targeted delivery of interleukin-4 and 12 to the tumor neovasculature eradicates tumors in three mouse models of cancer〔J〕.Int J Cancer,2014，134(2)：467-477.

[28]Abu-Halima M，Hammadeh M，Schmitt J，et al.Altered microRNA expression profiles of human spermatozoa in patients with different spermatogenic impairments〔J〕.Fertil Steril,2013，99(5)：1249-1255.

[29]Metzler-Guillemain C，Victorero G，Lepoivre C，et al.Sperm mRNAs and microRNAs as candidate markers for the impact of toxicants on human spermatogenesis：an application to tobacco smoking〔J〕.Syst Biol Reprod Med,2015，61(3)：139-149.

[30]Gillis AJ，Rijlaarsdam MA，Eini R，et al.Targeted serum miRNA(T-

SmiR) test for diagnosis and follow-up of (testicular) germ cell cancer patients：a proof of principle〔J〕.Mol Oncol,2013，7(6)：1083-1092.

(編輯：甘艷)

(收稿日期2015-04-20修回日期 2015-08-24)

文章編號：1001-5930(2016)04-0694-03

中圖分類號：R737.21

文獻標識碼：B

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.056

通訊作者：錢輝軍