郁　迪　丁冬各　王　斌

(浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心　浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院　舟山　316022)

膠原蛋白廣泛分布于皮膚、骨骼、肌腱、血管系統(tǒng)和結(jié)締組織中,約占動(dòng)物體內(nèi)總蛋白的 30%(Chenet al,2016)。目前,已發(fā)現(xiàn)的膠原蛋白種類(lèi)有29種(類(lèi)型 I—XXIX),且每種膠原蛋白都具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生理功能(Matmarohet al,2011)。傳統(tǒng)上,膠原蛋白主要來(lái)自于陸地動(dòng)物如牛、豬和家禽的加工副產(chǎn)物(Yanget al,2016),被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料、藥品、食物添加劑和化妝品等領(lǐng)域(Liet al,2013a; Liuet al,2015)。然而,瘋牛病(BSE)和口蹄疫(FMD)等病毒性疾病的發(fā)生致使人們對(duì)陸源膠原蛋白的安全性產(chǎn)生疑慮(張雪等,2015; Chuaychanet al,2015)。此外,宗教等原因也限制了膠原蛋白的應(yīng)用范圍(Veerurajet al,2015)。因此,尋找陸源膠原蛋白的替代資源成為研究熱點(diǎn)。

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)報(bào)道,全球每年魚(yú)捕獲量約有 1.5億噸,加工過(guò)程中產(chǎn)生占捕獲量30%以上的加工下腳料,多數(shù)未得到有效利用,既浪費(fèi)了寶貴的資源,也給環(huán)境造成了較大壓力(Yuet al,2014; Wuet al,2015)。現(xiàn)有研究表明,水產(chǎn)加工下腳料,特別是魚(yú)皮、魚(yú)骨、魚(yú)鱗和魚(yú)頭中富含膠原蛋白(Subhanet al,2015),且已從魷魚(yú)皮(張雪等,2015)、金槍魚(yú)魚(yú)骨(Yuet al,2014)、海參體壁(Cuiet al,2007)、大黃魚(yú)和小黃魚(yú)魚(yú)鱗(Wuet al,2015)、鱈魚(yú)魚(yú)骨(?elechowskaet al,2010)和羅非魚(yú)魚(yú)皮(Zenget al,2009)中制備得到膠原蛋白,并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究,為水產(chǎn)膠原蛋白的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。另外,現(xiàn)有研究證明源于海洋生物的膠原蛋白具有低抗原性、低過(guò)敏性等特性,較陸源膠原蛋白具有更廣泛的用途(Liet al,2013b)。因此,以水產(chǎn)加工下腳料進(jìn)行膠原蛋白的開(kāi)發(fā)利用既能保護(hù)環(huán)境,又可以增加水產(chǎn)加工附加值。

綠鰭?cǎi)R面鲀(Navodon septentrionalis)屬于單角鲀科,俗名剝皮魚(yú)、皮匠魚(yú)、橡皮魚(yú)等,在我國(guó)主要產(chǎn)于東海及黃海、渤海,是我國(guó)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一。我國(guó)馬面鲀的年加工數(shù)量約為20萬(wàn)噸,產(chǎn)生10萬(wàn)噸左右的副產(chǎn)物,而其皮膚強(qiáng)韌,利用價(jià)值較低,常作為廢料丟棄?；诖?本論文以綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮為原料,從中制備酸溶性膠原蛋白(ASC)和酶溶性膠原蛋白(PSC),并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究,為馬面鲀加工下腳料的后續(xù)開(kāi)發(fā)利用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

綠鰭?cǎi)R面鲀(Navodon septentrionalis)購(gòu)于浙江省舟山市豐茂菜市場(chǎng),種屬由浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院趙盛龍教授鑒定,標(biāo)本于-20°C存放于浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑為Bio-Rad產(chǎn)品,牛胰蛋白酶(Trypsin,1:250)、豬胃蛋白酶(Pepsin,160000U/g)和牛皮膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(CSC)為Sigma產(chǎn)品。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,購(gòu)買(mǎi)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1ASC和PSC的提取手工剝?nèi)【G鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮,用冷蒸餾水洗凈,然后用剪刀切成小塊后組織搗碎機(jī)破碎,按照料液比 1:15(W/V)加入 0.1mol/L NaOH溶液于 4℃下攪拌浸泡 24h(每 6h換液一次),9000g離心 20min,沉淀物用冷水洗至中性; 充分瀝干后,按料液比 1:20(V/V)加入 15%正丁醇溶液攪拌浸泡 48h(每 12h更換一次)除去殘留的脂肪,脫脂魚(yú)皮用蒸餾水洗凈。

脫脂魚(yú)皮按料液比1:15(W/V)浸泡于0.5mol/L的乙酸中24h,混合物以9000g離心20min,上清液裝入截留分子量為 3500Da的透析袋,于 NaCl濃度為2.6mol/L的Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L,pH7.5)中透析24h,于 20000g離心 15min,沉淀物用乙酸溶液(0.5mol/L)復(fù)溶后依次用乙酸溶液(0.1mol/L)和蒸餾水透析24h和36h,最后透析液凍干得酸溶性膠原蛋白(ASC)。

將ASC提取后的殘?jiān)凑樟弦罕?∶15 (W/V)置于 0.5mol/L乙酸溶液,加入 3%豬胃蛋白酶后在 4°C下攪拌提取48h,于20000g離心30min后得上清液,將上清液裝入截留分子量為 3500Da的透析袋,于NaCl濃度為2.6mol/L的Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L,pH 7.5)中透析24h,于20000g離心15min得沉淀物,沉淀物用0.5mol/L的乙酸溶液復(fù)溶后依次用0.1mol/L的乙酸和蒸餾水透析24h和36h,透析液冷凍干燥得酶溶性膠原蛋白(PSC)。

ASC和PSC的得率按照下面公式計(jì)算:

1.2.2基本成分和氨基酸組成分析水分、灰分、脂肪和蛋白質(zhì)的測(cè)定分別按照 AOAC(2003)中的950.46B、920.153、960.39(a)和928.08方法進(jìn)行分析。氨基酸組成分析參考趙等(2015)方法進(jìn)行。

1.2.3SDS-PAGEASC和 PSC的電泳根據(jù) Chi等(2014)的方法略作修改。分離膠濃度為7.5%,濃縮膠濃度為 4%。樣品(6.0mg/mL,20μL)與上樣緩沖液(60mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,包含25%甘油,2% SDS,0.1%溴酚藍(lán))按4∶1(V/V)置于β-巰基乙醇中,然后將樣品、CSC和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別加入樣品槽中,以100V恒定電壓電泳大約4h后,用考馬司亮藍(lán)R-250染色液(考馬斯亮藍(lán) 0.5g,甲醇 225mL,蒸餾水 225mL,冰醋酸 50mL)染色 15min,脫色液(甲醇 100mL,冰醋酸100mL,蒸餾水800mL)脫色并拍照分析。

1.2.4ASC和PSC的肽譜膠原蛋白樣品溶解于0.5mol/L乙酸中配成濃度為3.5mg/mL的溶液,按照酶/膠原蛋白 1:20(W/W)比例加入胰蛋白酶于 37℃下酶解 3h,加入 SDS-PAGE樣品緩沖液于沸水中保溫5min終止酶解反應(yīng)。其它膠原蛋白樣品的酶解時(shí)間調(diào)整為3min。然后所有樣品用12.0%的分離膠電泳。

1.2.5傅里葉變換紅外光譜(FTIR)稱取充分干燥后的膠原蛋白樣品 1—2mg按照質(zhì)量比 1∶100與干燥KBr充分混合,手動(dòng)壓片,采用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品在450—4000cm–1區(qū)間內(nèi)進(jìn)行吸收波譜掃描。

1.2.6黏度測(cè)定黏度的測(cè)定按照趙玉勤等(2015)方法進(jìn)行。ASC和 PSC水溶液(0.6%)的溫度按 4°C/min的速度從 4°C上升到 40°C。相對(duì)黏度為測(cè)定時(shí)的黏度與 4°C黏度的比值。Td定義為相對(duì)黏度降低50%時(shí)的溫度。黏度分?jǐn)?shù)按照下列公式計(jì)算:

1.2.7溶解度測(cè)定

1.2.7.1pH值對(duì)溶解度的影響取ASC和PSC溶液(3mg/mL,8mL)分別加入到 50mL離心管中,用6mol/L的NaOH/HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值從1—11。用相同 pH的 NaOH/HCl溶液將體積補(bǔ)足至 10mL,4°C 下輕輕攪拌 30min后,于 4°C、15000g離心60min。離心得到的上清液,測(cè)定其蛋白質(zhì)的含量。相對(duì)溶解度按照下列公式計(jì)算:

1.2.7.2氯化鈉濃度對(duì)溶解度的影響分別向ASC和 PSC溶液(6mol/L,5mL)中加入 5mL的0.5mol/L的乙酸溶液,按質(zhì)量體積比向溶液中加入NaCl,使NaCl最終濃度分別達(dá)到0%,1%,2%,3%,4%,5%和6%。將調(diào)好濃度的溶液于4°C下輕輕攪拌30min,于4°C、15000g離心60min,測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量。相對(duì)溶解度按照下列公式計(jì)算:

1.2.8超微結(jié)構(gòu)觀察ASC和 PSC溶解于0.5mol/L乙酸中配制成濃度為 5%(W/V)溶液,用 25倍體積的蒸餾水透析24h后凍干,用JEOL JFC-1200精細(xì)鍍膜儀鍍金90s,電子顯微鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

2　結(jié)果與討論

2.1　ASC和PSC的得率

綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮中酸溶性膠原蛋白(ASC)和酶溶性膠原蛋白(PSC)的得率分別為 0.87%±0.15%和9.52%±0.41%(按魚(yú)皮干重計(jì)算)。酸法提取是采用低離子濃度酸性條件破壞分子間鹽鍵和希夫堿,引起膠原纖維膨脹、溶解,可將沒(méi)有交聯(lián)的膠原分子或者含有醛胺類(lèi)交聯(lián)鍵的膠原纖維釋放到溶劑中。但是,由于部分膠原在體內(nèi)通過(guò)末端肽里的賴氨酸(Lys)或羥賴氨酸形成的共價(jià)鍵交聯(lián)結(jié)合,難于溶解到酸性溶液中。而蛋白酶可以將膠原末端肽切除,導(dǎo)致三螺旋結(jié)構(gòu)的主體部分溶于稀有機(jī)酸而被提取出來(lái),提高膠原蛋白的產(chǎn)率。因此,蛋白酶(如胃蛋白酶、膠原酶和木瓜蛋白酶等)可以作為膠原蛋白提取的輔助工具顯著提高膠原蛋白的得率(Liuet al,2012; Mohammadiet al,2016)。

2.2　基本成分分析

綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮、ASC和PSC的基本成分組成如表1所示。魚(yú)皮的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分含量分別為 62.12%±2.93%、19.83%±0.76%、3.08%±0.11%和14.32%±0.24%。與魚(yú)皮原料相比,膠原蛋白提取過(guò)程中已經(jīng)除去絕大部分雜質(zhì),ASC和PSC的蛋白質(zhì)含量分別為97.93%±0.54%和97.97%±0.38%,而脂質(zhì)(ASC: 0.47%±0.12%,PSC: 0.51%±0.09%),灰分(ASC: 1.29%±0.11%,PSC: 1.42%±0.37%)和水分含量(ASC: 0.18%±0.04%,PSC: 0.16%±0.01%)則顯著降低。

表1　綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮、ASC和PSC中營(yíng)養(yǎng)成分分析(n=3)Tab.1　Composition of bluefin leatherjacket skin,ASC and PSC (n=3)

2.3　氨基酸組成分析

綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮中ASC和PSC的氨基酸組成如表2所示。結(jié)果表明: ASC和PSC具有類(lèi)似的氨基酸組成,含量最高的是氨基酸為Gly,含量分別為323.3殘基/1000殘基和321.7殘基/1000殘基; 其次是Ala、Pro和Hyp。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Chiet al,2013; Liet al,2013a,b),除了 N-端的 14個(gè)氨基酸殘基和 C-端 10個(gè)氨基酸殘基外,膠原蛋白都是由重復(fù)的 Gly三肽(Gly-X-Y)參與的三重螺旋形成,其中 X一般是 Pro,Y主要是Hyp。另外,綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮中ASC和PSC的 Gly含量明顯低于刺河豚魚(yú)皮中得到的 ASC(353殘基/1000殘基)和PSC(340殘基/1000殘基)(Huanget al,2011),而略高于從條紋鯰魚(yú)魚(yú)皮中得到的ASC(309殘基/1000殘基)和PSC(317殘基/1000殘基)(Singhet al,2011)。

此外,Chi等(2013)報(bào)道亞氨基酸(Pro和Hyp)對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要,吡咯烷環(huán)的 Pro和 Hyp限制多肽鏈的構(gòu)象,并可在它們富集區(qū)域形成氫鍵,從而穩(wěn)定膠原蛋白的結(jié)構(gòu)。因此,亞氨基酸的含量有利于提高膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮ASC和PSC的亞氨基酸含量分別為191.1殘基/1000殘基和183.4殘基/1000殘基,低于CSC(215殘基/1000殘基),說(shuō)明綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮ASC和PSC的螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性弱于哺乳動(dòng)物膠原蛋白。

表2　綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮ASC、PSC和CSC的氨基酸組成及含量(殘基/1000殘基)(n=3)Tab.2　Amino acids compositions of ASC,PSC and CSC(residues/1000 residues) (n=3)

2.4　SDS-PAGE和肽譜

現(xiàn)有研究證明: 除了氨基酸組成外,分子量分布、亞基種類(lèi)和比例也對(duì)膠原蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。如圖 1所示,使用 7.5%分離膠對(duì) ASC、PSC和CSC進(jìn)行 SDS-PAGE分析。結(jié)果表明綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮中的ASC含有兩種 α肽鏈(α1和 α2),其中,α1肽鏈的分子量約為 130kDa,含量較高,α2肽鏈的分子量約為110kDa,含量較低; 除α肽鏈外,ASC和PSC尚含有大量 β肽鏈(α肽鏈二聚體),其分子質(zhì)量約為200kDa。另外,在β肽鏈上方還存在一條高分量的條帶,為 γ肽鏈(α肽鏈三聚體),相對(duì)分子質(zhì)量約為300kDa。SDS-PAGE結(jié)果表明 ASC電泳圖譜與CSC(圖1)、大黃魚(yú)魚(yú)鱗ASC(Wuet al,2015)、金槍魚(yú)魚(yú)骨ASC(Yuet al,2014)、灰星鯊魚(yú)皮ASC(Chiet al,2014),以及馬鮫魚(yú)魚(yú)皮和魚(yú)骨ASC(Liet al,2013a,b)類(lèi)似,屬于I型膠原蛋白。然而,PSC的 SDS-PAGE圖譜和ASC和CSC明顯不同。胰蛋白酶處理后,高分子量的亞基成分,包括 α、β和 γ-肽鏈裂解成70-110kDa的低分子量片段。

在pH值為2.5和7.8條件下,利用胰蛋白酶分別對(duì)ASC和PSC進(jìn)行酶解,使用12%分離膠對(duì)酶解物進(jìn)行電泳分析,結(jié)果如圖1B所示: 經(jīng)胰蛋白酶在pH為2.5、37 ℃處理3 h后,ASC的β和γ等高分子量肽鏈幾乎完全消失,而低于 130.0kDa的片段顯著增多;PSC未酶解時(shí)主要組成片段集中在66—100kDa之間,而胰蛋白酶酶解后,大于66kDa的片段基本消失,低于66.0kDa的片段顯著增多。另外,隨著pH值從2.5調(diào)整到胰蛋白酶最佳pH 7.8,ASC和PSC的水解程度都顯著增加。

圖1　馬面鲀魚(yú)皮ASC和PSC的SDS-PAGE圖譜(A)和肽譜(B)Fig.1　SDS-PAGE pattern (A) and peptide mapping (B) of ASC and PSC from skin of bluefin leatherjacket

ASC和PSC的SDS-PAGE圖譜和肽譜說(shuō)明: ASC和 PSC的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、亞基、水解產(chǎn)物和氨基酸序列存在較大差別,ASC組成亞基分子量更大,更難酶解。

2.5　FTIR

綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮ASC和PSC的FTIR如圖2所示。結(jié)果表明: ASC和PSC的FTIR具有顯著的膠原蛋白特征,且類(lèi)似于大黃魚(yú)魚(yú)鱗(Wuet al,2015)、金槍魚(yú)魚(yú)骨(Yuet al,2014)、灰星鯊魚(yú)皮(Chiet al,2014),以及馬鮫魚(yú)魚(yú)皮和魚(yú)骨(Liet al,2013a,b)等魚(yú)類(lèi)來(lái)源的膠原蛋白。

酰胺A帶與N-H伸縮頻率有關(guān),3400cm–1附近是N-H伸縮振動(dòng)峰,當(dāng)肽的N-H基團(tuán)中包含氫鍵時(shí),振動(dòng)轉(zhuǎn)向低頻率。ASC和PSC的酰胺A帶都在3432cm–1,表明ASC和PSC的N-H基團(tuán)中氫鍵含量較少。ASC和 PSC的酰胺 B帶的波數(shù)分別為 2925cm–1和2926cm–1,代表了C-H伸縮振動(dòng)峰。酰胺I帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶的伸縮振動(dòng)與膠原蛋白的成分有直接關(guān)系(Heuet al,2010)。酰胺I帶在1600-1700cm–1范圍有很強(qiáng)的吸光度,這主要與多肽鏈的 C=O的伸縮振動(dòng)相關(guān),能作為多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記。ASC和PSC酰胺 I帶的波數(shù)分別為 1640cm–1和 1642cm–1。由于 C-N的伸縮振動(dòng)與 N-H的彎曲振動(dòng)相耦合,酰胺Ⅱ帶通常出現(xiàn)在 1550—1600cm–1,當(dāng)有氫鍵存在時(shí)轉(zhuǎn)向低波數(shù),ASC和 PSC的酰胺Ⅱ帶波數(shù)為1548cm–1和 1549cm–1,該數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮ASC和PSC中存在少量氫鍵。此外,酰胺Ⅲ帶(1220—1320cm–1)與 N-H 變形和 C-N 伸縮頻率有關(guān)。ASC和PSC的酰胺Ⅲ帶波數(shù)為1240cm–1,其峰面積與1452cm–1峰面積之比約等于1證明ASC和PSC存在3股螺旋結(jié)構(gòu)(Heuet al,2010; Liet al,2013a,b)。

圖2　馬面鲀魚(yú)皮ASC和PSC的紅外光譜(FTIR)Fig.2　FTIR spectra of ASC and PSC from skin of bluefin leatherjacket

2.6　ASC和PSC溶液的黏度

隨著溫度的升高,膠原蛋白的分子內(nèi)氫鍵會(huì)逐漸斷裂,由氫鍵維系的膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài),并伴隨著物理性質(zhì),如黏度、溶解度、沉降、擴(kuò)散、光散射和光學(xué)活動(dòng)等的變化(Chiet al,2014)。如圖 3所示,ASC和 PSC從 4℃(ASC:7453.33±27.92mPa·s,PSC: 7332.30±4318.13mPa·s)加熱至 32℃(ASC: 361.27±11.95mPa·s,PSC: 233.67±9.28mPa·s),黏度快速下降,在 32℃以上黏度的變化很小。

圖3　溫度對(duì)馬面　鲀魚(yú)皮ASC和PSC黏度的影響(n=3)Fig.3　Thermal behaviours of ASC and PSC from skin of bluefin leatherjacket (n=3)

變性溫度(Td)為相對(duì)黏度降低 50%時(shí)的溫度。ASC和PSC的Td分別為21.5℃和18.9℃。PSC的Td值略低于 ASC,該結(jié)果表明胃蛋白酶的酶解破壞了膠原蛋白分子的部分氫鍵,造成膠原蛋白分子量降低,穩(wěn)定性減弱。綠鰭?cǎi)R面鲀生活在溫度為13—20℃的海洋,其魚(yú)皮膠原蛋白的變性溫度比阿根廷鱈魚(yú)(10.0℃)、波羅海鱈魚(yú)(15.0℃)和阿拉斯加狹鱈(16.8℃)等冷水魚(yú)高,并低于熱帶魚(yú)類(lèi),如常見(jiàn)的鯖魚(yú)(26.1℃)、鰻魚(yú)(29.3℃)、七星鱸魚(yú)(26.5℃)、鰹魚(yú)(29.7℃)、香魚(yú)(29.7℃)、澳洲烏魴(28.4℃)和尼羅河鱸魚(yú)(36.5℃)(Liet al,2013a,b; Sionkowskaet al,2015)。該結(jié)果與Zeng等(2009)報(bào)告相一致,即: 環(huán)境和機(jī)體溫度與膠原蛋白的熱穩(wěn)定性有關(guān)。此外,Td結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)亞氨基酸含量較低會(huì)影響膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。

另一方面,綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮的ASC和PSC的變性溫度低于牛皮和豬皮膠原蛋白的變性溫度(37℃)(Huanget al,2011),該數(shù)據(jù)表明綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮中的膠原蛋白的穩(wěn)定性弱于哺乳動(dòng)物膠原蛋白,更適合作為膠原肽的制備原料。

2.7　溶解度

2.7.1NaCl濃度對(duì)膠原蛋白溶解度的影響圖4(A)表明當(dāng) NaCl濃度從 0上升至 6%(W/V)時(shí),綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮 ASC和 PSC的溶解度變化曲線略有不同。當(dāng)NaCl濃度到達(dá)2%(W/V)時(shí),ASC的溶解度高(90%以上),當(dāng) NaCl濃度為 2%—4%(W/V)時(shí)溶解度大幅下降,之后當(dāng)NaCl濃度為4%—6%(W/V)時(shí)降幅減小。當(dāng)NaCl濃度為6%(W/V)時(shí)溶解度僅為 20.0%±1.2%。該結(jié)果與NaCl濃度對(duì)金槍魚(yú)魚(yú)骨、赤魟軟骨、孔鰩軟骨、灰星鯊魚(yú)皮和軟骨、條紋鯰魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白溶解度的影響類(lèi)似(Chiet al,2013; Liet al,2013a,b; Matmarohet al,2011; Singhet al,2011)。膠原蛋白在水溶液中的溶解度由其周?chē)H水基團(tuán)與水形成水化膜的程度,以及所帶電荷的情況決定。隨著 NaCl濃度的增加,NaCl對(duì)水分子的親和力大于膠原蛋白,于是膠原蛋白分子周?chē)乃訙p弱乃至消失。同時(shí),NaCl加入溶液后,離子強(qiáng)度發(fā)生改變,蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和,進(jìn)而導(dǎo)致膠原蛋白溶解度降低,使膠原蛋白分子之間聚集而沉淀。

圖4　NaCl濃度(A)和pH(B)對(duì)馬面鲀魚(yú)皮ASC和PSC溶解度的影響(n=3)

與 ASC溶解度圖相比,當(dāng) NaCl濃度到達(dá)2%(W/V)時(shí) PSC的溶解度顯著下降,但在相同的NaCl濃度下PSC比ASC表現(xiàn)出更大的溶解度,主要因?yàn)榻?jīng)胃蛋白酶酶解后,PSC的分子量顯著低于ASC,親水性更強(qiáng),從而溶解度更大。

2.7.2pH值對(duì)膠原蛋白溶解度的影響pH值對(duì)ASC和PSC溶解度的影響如圖4(B)所示。ASC和PSC的溶解度在酸性pH值介于1—3時(shí)最大,當(dāng)pH上升至3—7時(shí)溶解度顯著降低,當(dāng)pH為7—8時(shí)ASC和PSC的溶解度達(dá)到最小值,分別為 25.2%±1.9%和44.4%±2.0%。文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)pH值低于或高于蛋白等電點(diǎn)(pI),蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷或正電荷會(huì)隨之增加,相互之間的排斥力變大,溶解度升高; 相反,等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)之間排斥力最小,則沉淀析出。所以,ASC和PSC的等電點(diǎn)分別為pH值7和8,與已有報(bào)道膠原蛋白的等電點(diǎn)在 6—9之間相一致(Huanget al,2011; Chiet al,2013; 趙玉勤等,2015)。

2.8　超微結(jié)構(gòu)

圖 5結(jié)果表明:凍干的綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮ASC呈現(xiàn)片狀結(jié)果,而相同處理下的 PSC呈現(xiàn)疏松片狀和多孔結(jié)構(gòu)。ASC與PSC超微結(jié)構(gòu)的差異主要由其分子量差異導(dǎo)致溶解度的不同,進(jìn)而在溶液中 PSC分步更加均勻。但是ASC和PSC均顯示出良好的成膜性能,可以作為藥物載體進(jìn)行開(kāi)發(fā)。同時(shí)本研究結(jié)果說(shuō)明分子量和溶解度對(duì)膠原蛋白的超微結(jié)構(gòu)均有一定影響,后續(xù)研究可以根據(jù)需求調(diào)整膠原蛋白的分子量和溶解度來(lái)制備所需的生物材料(Mohammadiet al,2016)。

圖5　馬面鲀魚(yú)皮ASC(A)和PSC(B)的超微結(jié)構(gòu)圖Fig.5　SEM images of ASC (A) and PSC (B) from skin of bluefin leatherjacket

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用酸提法和酶提法從綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮中制備了兩種膠原蛋白,成分分析和SDS-PAGE電泳結(jié)果表明,提取的酸溶性膠原蛋白(ASC)和酶溶性膠原蛋白(PSC)具有較高的純度; 氨基酸組成分析、SDS-PAGE和FTIR證實(shí)ASC屬于I型膠原蛋白,但是PSC在亞基組成和分子量等方面與ASC存在一定差異; ASC和PSC的變性溫度低于熱帶魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物來(lái)源的膠原蛋白,適合作為膠原肽的制備原料進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用; 超微結(jié)構(gòu)揭示可以根據(jù)需求調(diào)整馬面鲀魚(yú)皮膠原蛋白的分子量和溶解度,進(jìn)行生物材料開(kāi)發(fā)。因此,本研究為綠鰭?cǎi)R面鲀魚(yú)皮的高值化利用提供了一種新的思路,也為馬面鲀魚(yú)皮膠原蛋白應(yīng)用于食品和生物醫(yī)藥行業(yè)提供理論依據(jù)。

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