徐圣釗　林　勉　閆松松　史雨紅　苗　亮　李明云　陳　炯

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院　生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室　寧波　315211)

大黃魚(Larimichthys crocea)屬硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科、黃魚屬,是我國(guó)“四大海水經(jīng)濟(jì)魚類”之一(姚康等,2008)。20世紀(jì)90年代人工繁育成功后,大黃魚成為我國(guó)人工育苗量和養(yǎng)殖規(guī)模最大的海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖品種,其經(jīng)濟(jì)效益顯著。由于不重視種質(zhì)保護(hù)和人工選育,目前人工養(yǎng)殖大黃魚在體形、生長(zhǎng)、肉質(zhì)、性成熟、抗逆性、抗病性等多鐘性狀上出現(xiàn)了衰退,遺傳多樣性降低,在一定程度上限制了其養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展(Gaoet al,2010)。因此,有必要對(duì)大黃魚進(jìn)行品質(zhì)改良,培育出具有生長(zhǎng)快、抗病強(qiáng)、體型肉質(zhì)好、耐低溫等性狀的優(yōu)良品種。

DNA分子標(biāo)記是根據(jù)個(gè)體間基因組DNA的多態(tài)性發(fā)展起來的一類遺傳標(biāo)記技術(shù),相比形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記具有一定的優(yōu)越性(魏東旺等,2001),已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種。大黃魚遺傳育種也普遍采用DNA分子標(biāo)記技術(shù)。王志勇等(2002)采用 AFLP技術(shù)(Amplified fragment length polymorphism)分析顯示,大黃魚野生群體和 2個(gè)養(yǎng)殖群體,2個(gè)福建養(yǎng)殖大黃魚群體的遺傳多樣性低于野生群體。李明云等(2003)采用RAPD技術(shù)(Random amplified polymorphic DNA)分析表明,象山港網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚群體遺傳多樣性水平較低。李鵬飛等(2008)采用魚線粒體 DNA的細(xì)胞色素b(Cytochrome b,Cytb)基因片段多態(tài)性可以區(qū)分大黃魚、鯢魚和美國(guó)紅魚。王曉清等(2008)采用 AFLP和 SSR技術(shù)(Simple sequence repeats)對(duì)親本與雜交子代分析結(jié)果表明,雜交子代與母本大黃魚之間的遺傳同質(zhì)性極高,屬于異源精子誘導(dǎo)大黃魚雌核發(fā)育個(gè)體。寧岳(2007)分離獲得的AFLP和SSR標(biāo)記應(yīng)用于大黃魚的雌性和雄性連鎖圖譜的構(gòu)建,同時(shí)確定了大黃魚性別決定機(jī)制。此外,也陸續(xù)篩選獲得許多有價(jià)值的SSR標(biāo)記(Guoet al,2005; Changet al,2009)。早期DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要應(yīng)用于大黃魚遺傳多樣性檢測(cè)、系譜確認(rèn)、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建中(Yeet al,2014)。近年來,研究者主要致力于采用DNA分子標(biāo)記技術(shù)篩選性狀相關(guān)標(biāo)記。劉賢德等采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同大黃魚家系和群體進(jìn)行分析,篩選到與大黃魚生長(zhǎng)性狀緊密相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記(劉賢德等,2012,2013; 葉華等,2014)。薛良義等(2013)研究表明大黃魚肌肉生長(zhǎng)抑制素基因 3’端非編碼區(qū)微衛(wèi)星序列多態(tài)性與大黃魚體長(zhǎng)、體質(zhì)量之間的相關(guān)系數(shù)沒有達(dá)到顯著水平。但生長(zhǎng)性狀相關(guān)標(biāo)記發(fā)掘較少,此外是否可用于生產(chǎn)實(shí)踐還需進(jìn)一步驗(yàn)證,因此還需繼續(xù)篩選生長(zhǎng)性狀相關(guān)標(biāo)記。

多樣性芯片技術(shù)(Diversity arrays technology,DArT)是一種基于基因芯片技術(shù)的 DNA指紋圖譜分析方法,可廣泛用于檢測(cè)和分析動(dòng)物、植物和微生物的DNA差異以及構(gòu)建遺傳圖譜、QTL定位和品種指紋圖譜鑒定(Sánchez-Sevillaet al,2015)。與常規(guī)技術(shù)相比,DArT不需要明確物種的基因組DNA序列信息,具有高通量和低成本的顯著特點(diǎn),克服了以往跑電泳凝膠為主的標(biāo)記技術(shù)產(chǎn)量低、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、自動(dòng)化程度低等缺點(diǎn),只用少量成本就可進(jìn)行全基因組的高通量圖譜分析。目前該技術(shù)已成功用于水稻、大麥、小麥、油菜、桉樹、蘋果、木薯、擬南芥、木豆、大麥病原菌、沙門氏菌等生物的遺傳連鎖圖譜以及基因定位研究中(Hacklet al,2010; Schoutenet al,2012)。在水產(chǎn)動(dòng)物的研究中僅見該技術(shù)應(yīng)用于三疣梭子蟹地理種群多樣性分析(榮曄婧等,2014)。

本研究旨在采用DArT技術(shù)鑒定與大黃魚體長(zhǎng)相關(guān)的DArT標(biāo)記。首先按分離群體標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析法篩選“東海1號(hào)”大黃魚體長(zhǎng)相關(guān)的DArT標(biāo)記,后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證其相關(guān)性,以期為大黃魚選育和種質(zhì)資源利用提供有用參考資料。

1　材料與方法

1.1　樣品采集

2012年11月從寧波象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司網(wǎng)箱養(yǎng)殖的“東海 1號(hào)”大黃魚(1齡)中挑選健康無(wú)損傷的大黃魚199尾,測(cè)量每條魚的體長(zhǎng),并在魚鰓蓋內(nèi)側(cè)較軟部位植入電子標(biāo)記。然后分別將其放入水泥池中暫養(yǎng)。使用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,分別建立體長(zhǎng)的正態(tài)分布圖,取體長(zhǎng)位于 10%的高值個(gè)體記為“極端大群體”(20尾),10%低值個(gè)體記為“極端小群體” (20 尾)。

1.2　基因組代表性DNA片段文庫(kù)構(gòu)建

文庫(kù)構(gòu)建方法參照 Jaccoud等(2001)描述。采用酚-氯仿法提取基因組 DNA,并將“極端大群體”和“極端小群體”的大黃魚基因組DNA等量混合。500ng混合基因組DNA用切割頻率低的限制性內(nèi)切酶PstI分別與切割頻率高的AluI、BanⅡ、Bsp1286I、BstNI、HaeIII、RsaI和TaqI組合進(jìn)行酶切。在T4 DNA連接酶作用下,純化的 DNA連接上PstI特異性接頭(Wenzlet al,2004)。連接產(chǎn)物作為模板用于后續(xù)PCR擴(kuò)增,所用引物為DArT-PstI引物(Wenzlet al,2004),反應(yīng)程序如下: 94°C變性5min后,以下程序重復(fù)35個(gè)循環(huán),94°C變性30s,53°C復(fù)性30s,72°C延伸1min,循環(huán)完成后 72°C延伸反應(yīng) 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至載體pMD19-T,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F并涂布于含氨芐青霉素和X-gal的LB培養(yǎng)基上。

1.3　基因組DNA復(fù)雜性降低方法的優(yōu)化

1.3.1探針制備及芯片點(diǎn)制從代表性基因組DNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選單菌落,利用質(zhì)粒載體上的通用引物M13F-47和M13R-48對(duì)插入的DNA片段進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物用 1倍體積異丙醇沉淀。每個(gè) 7種降低基因組復(fù)雜性方法基因組代表性DNA片段數(shù)為 840個(gè)。在芯片中布置質(zhì)控探針,陰性對(duì)照探針,陽(yáng)性對(duì)照探針,空白對(duì)照探針,工作探針。每個(gè)探針包含三個(gè)重復(fù)。每張芯片包含4個(gè)點(diǎn)陣,每個(gè)點(diǎn)陣25行、27列,每個(gè)點(diǎn)的位置用“行標(biāo)-列標(biāo)”表示。其中1-1—1-3為質(zhì)控探針,1-19—1-21為陽(yáng)性對(duì)照探針,1-7—1-18、1-22—2-3為陰性對(duì)照探針,2-4—25-12為工作探針,1-4—1-6、25-13—25-27為空白對(duì)照探針。從PstI/AluI、PstI/BanII、PstI/Bsp1286I、PstI/BstNI、PstI/HaeIII、PstI/RsaI、PstI/TaqI文庫(kù)中獲得的 840個(gè)基因組代表性DNA片段依次排布在4個(gè)點(diǎn)陣中。采用晶芯SmartArrayerTM48點(diǎn)樣儀進(jìn)行點(diǎn)制。

1.3.2熒光標(biāo)記基因組代表性 DNA片段的制備用M13F-47和M13R-48引物對(duì)未插入外源DNA片段的載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,該P(yáng)CR產(chǎn)物作為reference DNA。經(jīng)乙醇沉淀后,加入 20μL滅菌水溶解,放–30°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用酚-氯仿法提取大黃魚“極端大群體”與“極端小群體”基因組DNA,兩組 DNA先分別使用7組限制性內(nèi)切酶(PstI/AluI、PstI/BanII、PstI/Bsp1286I、PstI/BstNI、PstI/HaeIII、PstI/RsaI、PstI/TaqI)降低基因組復(fù)雜性,再加PstI特異性接頭,接著用PstI引物對(duì)加接頭產(chǎn)物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,最后擴(kuò)增產(chǎn)物使用DNAmate沉淀濃縮10倍體積。

取 150ng基因組代表性 DNA片段變性后用DecaLabel DNA Labeling Kit進(jìn)行Cy3標(biāo)記,加入含十堿基隨機(jī)引物的 5×緩沖液、MixC、Cy5-dCTP、exo-Klenow fragment共 2.1μL,37°C 孵育 10min 后,加入 dNTPs 0.4μL,37°C 孵育 30min,加入 0.1μL EDTA (pH 8.0)終止反應(yīng)。取150ng reference DNA變性后用DecaLabel DNA Labeling Kit進(jìn)行Cy5標(biāo)記。

1.3.3芯片雜交Cy3和Cy5標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物混合,再加入1μL鮭精DNA(10g/L)和50μL ExpressHyb?雜交液混合后,96°C變性 3min,冰浴驟冷 1min。將上述反應(yīng)產(chǎn)物加入預(yù)處理的 DArT芯片中,在晶芯?雜交儀中進(jìn)行雜交(65°C孵育過夜。雜交后先用0.3×SSC,0.1% SDS清洗一次,再用0.06×SSC清洗兩次,離心甩干。

1.3.4芯片的掃描與數(shù)據(jù)處理雜交后采用晶芯? LuxScanTM10K-A雙通道激光共聚焦掃描儀進(jìn)行掃描,并用LuxScan3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的提取。若對(duì)應(yīng)的reference DNA雜交熒光強(qiáng)度較弱,則屬于壞點(diǎn),棄之。質(zhì)量符合條件的探針,其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度按照l(shuí)g[Cy3 Target/Cy5 Reference]進(jìn)行計(jì)算均一化。利用模糊 C-均值聚類分析法(模糊度為 1.5)將歸一化后的芯片信號(hào)值分為 2組聚類簇(cluster),如果計(jì)算出的聚類簇之間方差至少大于總方差的 80%,則認(rèn)為此探針具有多態(tài)性,模糊 C-均值聚類分析法可將其在不同芯片樣本內(nèi)分成0/1兩組類別(Wenzlet al,2004)。采用ANOVA單側(cè)檢驗(yàn)(one-way ANOVA)分析組差異標(biāo)記。計(jì)算P值、q值和FDR,并制作相應(yīng)的散點(diǎn)圖。

1.4　大黃魚生長(zhǎng)相關(guān)分子標(biāo)記的篩選

從PstI/RsaI代表性基因組DNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選3360個(gè)克隆,PCR擴(kuò)增插入片段,重新點(diǎn)制芯片。在芯片中布置質(zhì)控探針,陰性對(duì)照探針,陽(yáng)性對(duì)照探針,空白對(duì)照探針,工作探針。每個(gè)探針包含三個(gè)重復(fù)。每張芯片包含16個(gè)點(diǎn)陣,每個(gè)點(diǎn)陣的設(shè)置同1.3.1。各取500ng基因組DNA,分別用PstI與RsaI組合進(jìn)行雙酶切。酶切后加PstI特異性接頭,用 DArT-PstI引物引物對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。熒光標(biāo)記基因組DNA代表性片段的制備方法同1.3.2。芯片預(yù)處理、雜交、掃描、數(shù)據(jù)提取及數(shù)據(jù)初步處理方法同 1.3.3和 1.3.4。

1.5　大黃魚生長(zhǎng)相關(guān)DArT標(biāo)記的驗(yàn)證

在后期驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中,重新取177尾網(wǎng)箱養(yǎng)殖的健康、無(wú)損傷1齡“東海1號(hào)”大黃魚。使用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析建立體長(zhǎng)的正態(tài)分布圖。這個(gè)群體每個(gè)個(gè)體基因組DNA代表性片段制備、芯片預(yù)處理、雜交、掃描、數(shù)據(jù)提取及數(shù)據(jù)初步處理方法同 1.3.2—1.3.4。篩選獲得的候選DArT標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序,同時(shí)用BLAST2GO (http://www.blast2go.org)軟件對(duì)鑒定的DArT標(biāo)記進(jìn)行基因功能注釋。

2　結(jié)果

2.1　大黃魚體長(zhǎng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

隨機(jī)選擇199個(gè)大黃魚樣本測(cè)量其體長(zhǎng)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)群體中的體長(zhǎng)最大值為16.30cm、最小值為11.50cm,均值為 13.45cm,標(biāo)準(zhǔn)偏差 1.0337。經(jīng)過 Shapiro-Willie過程進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),峰度為0.192,偏度為–0.210,計(jì)算得到P=0.257,樣品符合正態(tài)分布(P＞0.05)。因而根據(jù)采用分離群體分組分析法(Bulked Segregate Analysis,BSA)建立關(guān)于體長(zhǎng)的正態(tài)分布圖(圖 1),在各群體中選取 10%的高值個(gè)體即體長(zhǎng)大于14.80 cm的記為極端大群體,選取10%的低值個(gè)體即體長(zhǎng)小于 12.00 cm的記為極端小群體,兩組之間體長(zhǎng)差異極顯著(P＜0.01)。可用于與生長(zhǎng)相關(guān) DArT標(biāo)記的初步篩選。

圖1　大黃魚體長(zhǎng)正態(tài)分布頻率直方圖Fig.1　Normal distribution frequency histogram of body length of large yellow croaker

2.2　大黃魚基因組代表性DNA片段文庫(kù)的構(gòu)建

本研究中大黃魚基因組 DNA完整,純度高,無(wú)RNA 污染(圖 2A)。將不同體長(zhǎng)的大黃魚混合后,分別用PstI/AluI、PstI/BanII、PstI/Bsp1286I、PstI/BstNI、PstI/HaeIII、PstI/RsaI、PstI/TaqI酶切后純化(圖 2B)。在 T4DNA連接酶作用下,純化的 DNA酶切片段與PstI特異性接頭連接。連接產(chǎn)物作為模板進(jìn)行后續(xù) PCR擴(kuò)增(圖 2C)。PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10F’,所得7個(gè)基因組代表性DNA文庫(kù)滴度≥105(表1),陽(yáng)性克隆平均插入片段長(zhǎng)度＞500bp(圖 2D—J),符合 DArT芯片點(diǎn)制要求。

圖2　大黃魚基因組代表性DNA片段文庫(kù)構(gòu)建Fig.2　Construction of genomic representations library of large yellow croaker

2.3　降低基因組復(fù)雜性方法

大黃魚“極端大群體” 與“極端小群體”樣品提取基因組 DNA,分別采用 7種酶切組合(PstI/AluI、PstI/BanII、PstI/Bsp1286I、PstI/BstNI、PstI/HaeIII、PstI/RsaI、PstI/TaqI)降低基因組復(fù)雜性。經(jīng)標(biāo)記后的DNA片段分別與各自DArT芯片雜交,雜交結(jié)果清晰可靠。7種酶切組合中,PstI/RsaI不僅可降低基因組復(fù)雜性,且多態(tài)性率最高(17.62%)(表1)。因此,選擇PstI/RsaI基因組代表性DNA片段文庫(kù)用于大黃魚體長(zhǎng)相關(guān)DArT標(biāo)記的篩選。

2.4　大黃魚生長(zhǎng)相關(guān)DArT標(biāo)記的篩選

重新點(diǎn)制的PstI/RsaI DArT芯片,其克隆數(shù)增加至3360個(gè)(圖3A)。并按照上述方法制備“極端大群體”與“極端小群體”PstI/RsaI大黃魚基因組代表性 DNA片段,并加上Cy3熒光標(biāo)記,reference DNA為Cy5熒光標(biāo)記。雜交后進(jìn)行芯片掃描(圖3A)和數(shù)據(jù)提取。每張芯片經(jīng)過歸一化處理后,通過用模糊 C-均值聚類分析法獲得0/1矩陣。根據(jù)計(jì)算所得的p值獲得散點(diǎn)圖(圖2B)。散點(diǎn)圖中黑色為無(wú)差異位點(diǎn),紅色為差異顯著位點(diǎn)(P≤0.05),各位點(diǎn)集中在對(duì)角線附近,偏離對(duì)角線越大越容易呈現(xiàn)紅色。上述差異位點(diǎn)中只有18個(gè)DArT候選標(biāo)記在“極端大群體”與“極端小群體”中聚類結(jié)果穩(wěn)定,且組間P＜0.01(表2),其中17個(gè)為“極端大群體”DArT候選標(biāo)記,1個(gè)“極端小群體”DArT候選標(biāo)記(表2)。

表1　7個(gè)基因組DNA代表性文庫(kù)由于所用限制性內(nèi)切酶組合不同而造成的差異克隆數(shù)和多態(tài)性率Tab.1　The number of unique clone and polymorphism level in genomic representative library differing in enzymes used for co-digestion

圖3　x827樣品雜交結(jié)果(A)及雜交歸一化信號(hào)P值散點(diǎn)圖(B)Fig.3　Result of DArT microarray assay of x827 (A) and the P value scatter plot of normalization signals from maximal length group and minimal length group (B)

表2　“極端大群體”和“極端小群體”0/1矩陣及統(tǒng)計(jì)分析Tab.2　The 0/1 matrix of maximal length group and minimal length group,and the statistics

2.5　大黃魚生長(zhǎng)相關(guān)DArT標(biāo)記的驗(yàn)證

為驗(yàn)證所篩選 DArT候選標(biāo)記的有效性,又重新挑選了浙江象山港灣網(wǎng)箱養(yǎng)殖的“東海1號(hào)”F6代大黃魚(1齡) 177尾大黃魚,這個(gè)群體體長(zhǎng)經(jīng)過Shapiro-Willie過程進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),也符合正態(tài)分布(P＞0.05)。從檢驗(yàn)結(jié)果可以看到,RsaI1-23等8個(gè)DArT標(biāo)記仍與體長(zhǎng)性狀緊密相關(guān)(P＜0.01) (表3)。為了進(jìn)一步確定篩選獲得的大黃魚 DArT候選標(biāo)記,將上述候選標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用BLAST2GO軟件進(jìn)行Blastn分析。結(jié)果顯示測(cè)定的序列中6個(gè)為已知序列,2個(gè)為未知序列(表3)。

表3　大黃魚體長(zhǎng)相關(guān)DArT標(biāo)記再次驗(yàn)證結(jié)果Tab.3　Re-verification for body-length-related DArT markers in large yellow croaker

3　討論

傳統(tǒng)選育需要經(jīng)歷多個(gè)生命周期才能分離出穩(wěn)定遺傳的經(jīng)濟(jì)性狀。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,運(yùn)用 DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行選育,從分子水平研究與水產(chǎn)動(dòng)物優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀相連鎖的分子標(biāo)記極大地縮短了選育時(shí)間(劉賢德等,2013)。目前,SSR技術(shù)常用于尋找與生長(zhǎng)、抗逆等性狀緊密連鎖或相關(guān)標(biāo)記。如樊佳佳等(2009)關(guān)聯(lián)分析得到 7 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)與體重、體長(zhǎng)和體高顯著相關(guān)(P＜0.05)或極顯著相關(guān)(P＜0.01)。Yi等(2015)從100個(gè)SSR標(biāo)記中找到8個(gè)基因座上 9個(gè)基因型與鱖魚生長(zhǎng)性狀(體重、體長(zhǎng)和體高)相關(guān)。研究者也試圖通過生長(zhǎng)、抗逆等性狀緊密連鎖或相關(guān)標(biāo)記指導(dǎo)大黃魚遺傳育種實(shí)踐。高國(guó)強(qiáng)等(2010)進(jìn)行了大黃魚耐低溫標(biāo)記的篩選,找到一個(gè)標(biāo)記(LYC0002)可能與耐低溫有關(guān)。劉賢德等采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)鑒定了LYC0088和LYC0143與大黃魚不同家系和群體生長(zhǎng)性狀緊密相關(guān)(劉賢德等,2012,2013; 葉華等,2014)。薛良義等(2008)研究表明大黃魚肌肉生長(zhǎng)抑制素基因 3’端非編碼區(qū)微衛(wèi)星序列多態(tài)性與大黃魚體長(zhǎng)、體質(zhì)量無(wú)相關(guān)性。Ni等(2012)在浙江養(yǎng)殖大黃魚生長(zhǎng)基因內(nèi)含子 1的 196位SNP(Single nucleotide polymorphysim)與體長(zhǎng)和體高相關(guān),在兩個(gè)群體大黃魚生長(zhǎng)基因內(nèi)含子2的692位SNP與體重全長(zhǎng)顯著相關(guān)。本研究中首次采用DArT技術(shù)鑒定了8個(gè)大黃魚體長(zhǎng)相關(guān)DArT標(biāo)記,其中7個(gè)為“極端大群體”DArT候選標(biāo)記,1個(gè)“極端小群體”DArT候選標(biāo)記。

一般有兩種方法篩選和鑒定水產(chǎn)動(dòng)物目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記,一種是分離群體標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析法,該方法可快速獲得與目的性狀連鎖的分子標(biāo)記,缺點(diǎn)是靈敏度和精確度都較低; 另一種為隨機(jī)選擇群體標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析法,該方法可全面分析所選用的標(biāo)記,準(zhǔn)確度和精確度較好,缺點(diǎn)是需要檢測(cè)的樣本量大和分析費(fèi)用較高(樊佳佳等,2009)。本研究采用分離群體標(biāo)記關(guān)聯(lián)析法進(jìn)行初步篩選,根據(jù)“東海 1號(hào)”大黃魚體長(zhǎng)數(shù)據(jù)挑出“極端大群體”和“極端小群體”,從兩個(gè)群體中獲得18個(gè)與體長(zhǎng)相關(guān)DArT候選標(biāo)記。隨后新群體中驗(yàn)證確認(rèn)RsaI1-23等8個(gè)DArT標(biāo)記仍與體長(zhǎng)性狀緊密相關(guān)。由于仍不能保證本研究中所篩選到的標(biāo)記在其它群體適用,因而在后續(xù)研究中尚需擴(kuò)大群體的規(guī)模和類型,進(jìn)行多方比較進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,為下一步基因輔助育種、進(jìn)一步提高性狀選擇的準(zhǔn)確性提供依據(jù)。

4　結(jié)論

本研究從PstI/RsaI基因組代表DNA片段文庫(kù)中擴(kuò)增獲得3360個(gè)基因組代表性DNA片段,制備大黃魚體長(zhǎng)相關(guān)多樣性芯片。雜交信號(hào)轉(zhuǎn)換為0/1矩陣并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析篩選,初步獲得 18個(gè)大黃魚體長(zhǎng)相關(guān)DArT候選標(biāo)記。之后經(jīng)過驗(yàn)證表明仍有8個(gè)DArT標(biāo)記與新群體的體長(zhǎng)相關(guān)。本研究成功應(yīng)用DArT技術(shù)篩選到與體長(zhǎng)相關(guān)標(biāo)記,該方法也可以應(yīng)用于其它生長(zhǎng)相關(guān)性狀標(biāo)記篩選。同時(shí)本研究成果可直接指導(dǎo)大黃魚人工選育工作; 也可作為進(jìn)一步研究大黃魚生長(zhǎng)相關(guān)的遺傳連鎖圖譜提供基礎(chǔ),并對(duì)其它水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的遺傳育種的建立提供理論依據(jù)與實(shí)踐參考。

王志勇,王藝?yán)?林利民等,2002. 福建官井洋大黃魚 AFLP指紋多態(tài)性的研究. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),9(3): 198—202

王曉清,王志勇,謝中國(guó)等,2008. 大黃魚(♀)與鮸(♂)雜交的遺傳分析. 水產(chǎn)學(xué)報(bào),32(1): 51—57

葉華,劉洋,劉賢德等,2014. 大黃魚微衛(wèi)星標(biāo)記與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析. 西南大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版,36(3):27—33

寧岳,2007. 大黃魚遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建. 集美: 集美大學(xué)碩士學(xué)位論文,23—52

劉賢德,韋信鍵,蔡明夷等,2012. 大黃魚22個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在F1家系中的分離方式及與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)分析. 水產(chǎn)學(xué)報(bào),36(9): 1322—1330

劉賢德,隋班良,王志勇等,2013. 大黃魚快長(zhǎng)相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選與驗(yàn)證. 水生生物學(xué)報(bào),37(6): 1036—1043

李明云,張海琪,薛良義等,2003. 網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚遺傳多樣性的同工酶和RAPD分析. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),10(6): 523—525

李鵬飛,周永東,徐漢祥,2008.大黃魚、鮸魚及美國(guó)紅魚線粒體DNA的Cytb基因序列比較. 南方水產(chǎn),4(3): 43—47

榮曄婧,陳強(qiáng),史雨紅等,2014. 基于DArT標(biāo)記的三疣梭子蟹地理種群遺傳多樣性分析. 生物學(xué)雜志,31(2): 18—21

姚康,王文策,耿梅梅等,2008. 大黃魚緊密連鎖α-和β-珠蛋白基因間序列功能分析. 水生生物學(xué)報(bào),32(3): 413—416

高國(guó)強(qiáng),常玉梅,韓啟霞等,2010. 大黃魚耐低溫性狀相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選. 遺傳,32(3): 248—253

樊佳佳,白俊杰,李小慧等,2009. 大口黑鱸生長(zhǎng)性狀的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記篩選. 遺傳,31(5): 515—522

薛良義,孫升,肖章奎等,2008. 大黃魚肌肉生長(zhǎng)抑制素基因微衛(wèi)星序列多態(tài)性分析. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),24(10): 980—985

魏東旺,樓允東,孫效文等,2001. 鯉魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選. 動(dòng)物學(xué)研究,22(3): 238—241

Chang Y M,Ding L,Wang W Wet al,2009. Isolation and characterization of 11 microsatellite markers for the large yellow croaker,Pseudosciaena crocea. Conservation Genetics,10(5): 1405—1408

Gao G Q,Chang Y M,Han Q Xet al,2010. Screening of microsatellite markers associated with cold tolerance of large yellow croaker (Pseudosciaena croceaR.). Hereditas,32(3): 248—253

Guo W,Wang Z Y,Wang Y Let al,2005. Isolation and characterization of six microsatellite markers in the large yellow croaker (Pseudosciaena croceaRichardson).Molecular Ecology Notes,5(2): 369—371

Hackl E,Konrad-K?szler M,Kilian Aet al,2010. Phage-type specific markers identified by Diversity Arrays Technology(DArT) analysis ofSalmonella entericassp.entericaserovars Enteritidis and Typhimurium. J Microbiol Meth,80(1): 100—105

Jaccoud D,Peng K M,Feinstein Det al,2001. Diversity arrays: a solid state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Res,29(4): e25

Ni J,You F,Xu J Het al,2012. Single nucleotide polymorphisms in intron 1 and intron 2 ofLarimichthys croceagrowth hormone gene are correlated with growth traits. Chin J Oceanol Limnol,30(2): 279—285

Sánchez-Sevilla J F,Horvath A,Botella M Aet al,2015.Diversity Arrays Technology (DArT) marker platforms for diversity analysis and linkage mapping in a complex crop,the Octoploid cultivated strawberry (Fragaria × ananassa).PLoS One,10(12): e0144960

Schouten H J,van de Weg W E,Carling Jet al,2012. Diversity arrays technology (DArT) markers in apple for genetic linkage maps. Mol Breed,29(3): 645—660

Wenzl P,Carling J,Kudrna Det al,2004. Diversity Arrays Technology (DArT) for whole-genome profiling of barley.Proc Natl Acad Sci U S A,101(26): 9915—9920

Ye H,Liu Y,Liu X Det al,2014. Genetic mapping and QTL analysis of growth traits in the large yellow croakerLarimichthys crocea. Mar Biotechnol,16(6): 729—738

Yi T L,Fang L,Liang X F,et al,2015. Characterization of microsatellite markers and their correlations with growth traits in Mandarin fish (Siniperca chuatsi). Genet Mol Res,14(3): 8926—8934