王曉梅，張鐘文，楊　楠吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，吉林長春130118

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辣椒疫霉病無毒基因RXLR128001克隆與蛋白表達純化

王曉梅*，張鐘文，楊楠
吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，吉林長春130118

摘要：本文從強致病辣椒疫霉菌SD33分離克隆了1個效應分子RXLR128001基因，利用生物信息學軟件BLAST and SignalP4.1 Server，分析了該效應分子的基因序列結構。在此基礎上進行了該基因大腸桿菌（Escherichia coli）表達與純化，界定了適宜該基因高效表達的誘導條件，經(jīng)過親和層析和離子交換層析，獲得了RXLR128001基因較高純度的蛋白，以利于后續(xù)晶體的培養(yǎng)與優(yōu)化研究。

關鍵詞：辣椒疫霉；效應蛋白；基因克隆；蛋白表達純化

辣椒疫霉病（Phytophthora capsici）是一種重要的土傳卵菌病害[1，2]，呈世界性分布，該病害嚴重發(fā)生，常給辣椒生產(chǎn)造成嚴重減產(chǎn)，乃至絕收[3]。其病原菌寄主范圍廣，可侵染辣椒、西葫蘆、黃瓜、茄子、番茄等20多種作物[4]。近年來，已有關于辣椒疫霉菌關鍵致病因子及致病流行機制的探索研究[5，6]。

植物病原菌侵染寄主植物過程中常分泌若干效應蛋白分子（effectors）[7]，植物病原卵菌在與寄主植物互作過程中，也分泌效應蛋白分子進入寄主細胞中，通過破壞或干擾寄主細胞代謝，而促進自身的分泌和傳遞[7]。病原卵菌效應蛋白具誘導寄主細胞壞死而導致寄主植物發(fā)病，或誘導寄主細胞產(chǎn)生防衛(wèi)反應的性能[8]。這類效應分子共同特點是在N-端含有一個信號肽，協(xié)助效應分子分泌滲入寄主細胞內，后比鄰一個保守的RXLR-dEER motif，該類效應蛋白分子通常含100至400個氨基酸[9-11]。生物信息學比對發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉基因組中含300余個RXLR效應分子，但有關辣椒疫霉RXLR效應分子基因克隆、蛋白表達純化及其功能機制特性的研究資料積累較少，本研究克隆了辣椒疫霉的1個RXLR效應分子，基于蛋白表達純化技術獲得了該效應分子較高純度的蛋白，為該蛋白晶體優(yōu)化培養(yǎng)及結構研究提供了基礎。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌種辣椒疫霉菌株SD33由山東農(nóng)業(yè)大學真菌研究室分離鑒定。

1.2辣椒疫霉RxLR效應分子基因克隆

1.2.1辣椒疫霉效應蛋白分子RXLR128001界定與引物設計利用基因信息軟件比對發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉基因組JGI（http://genome.jgi.doe.gov/）中含1個效應蛋白分子RXLR128001，基于RXLR128001基因全長序列設計克隆引物RxLR128001-F: 5`-ATGCGCCTCCTTTATTTGGC-3`；RXLR128001-R: 5`-CTACACACTGTTGAGTTTCG-3`，該對引物由上海博尚生物有限公司合成。

1.2.2RXLR128001基因克隆基因克隆載體pGEM-T Easy Vector購自Promega公司，大腸桿菌Escherichia coli DH5α JM109菌株購自上海Sangon公司。以辣椒疫霉菌基因組DNA為模板，對RXLR128001基因進行PCR擴增：95℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。產(chǎn)物電泳后，含目的DNA的瓊脂糖膠，回收。克隆步驟：1）制備100 μg/mLAmp LB平板室溫下放置2～3 h備用；2）從-80℃取出E. coli DH5（JM109）感受態(tài)細胞，冰浴中融化，輕彈混勻，然后在無菌1.5 mL Ep管加入10 μL回收產(chǎn)物，取50 μL感受態(tài)細胞與連接產(chǎn)物輕輕混勻，冰浴中放置30 min；3）放入42℃水浴中，熱激90 s，然后冰浴2 min；4）每管中加入500 μL LB培養(yǎng)基，37℃200 r/min培養(yǎng)45 min；5）離心1 min（8000～10000 r/min），用100 μL LB培養(yǎng)基回溶，取適量（100 μL）涂布于培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h后出現(xiàn)菌落；6）取單菌落，于液體LB培養(yǎng)基中37℃，200 r/min培養(yǎng)12～16 h后OD＝0.5左右時，菌落PCR鑒定，然后送樣測序。

1.3RXLR128001基因原核表達與蛋白純化

1.3.1原核表達載體構建選用pET-28a為表達載體，為保證目的基因片斷單方向插入質粒中，在片斷5`和3`端分別設計BamHI和EcoRI酶切位點，合成一對特異性引物RXLR128001-F: 5`-CGCGGATCCCTCTCCACGCCTACGGCACCTG-3`；RXLR128001-R:5`-CCGGAATTCTTAGCCGG ACACCACACCCAC-3`用于RxLR128001基因PCR擴增，設計引物切除信號肽序列后，PCR擴增片段為RXLR128001基因成熟肽序列，PCR擴增體系和反應條件參照文獻[12]，擴增后的基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進行純化回收，對目的基因和載體質粒進行雙酶切[12]，酶切之后通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化回收，之后進行基因和載體連接轉化[12]。重組質粒經(jīng)菌落PCR篩選，測序鑒定。

1.3.2轉化宿主蛋白表達目的蛋白試表達：將陽性重組質粒轉入表達宿主BL21（DE3），涂于Kana抗性平板。

1）從LB平板上分別挑取5個單克隆菌落，接入5 mL LB（50 mg/L Kana）的15 mL離心管中，于37℃震蕩培養(yǎng)OD值至0.6～0.8之間；

2）每管各取500 μL菌液和15%的甘油1:1（V/V）混合后裝至滅菌凍存管中，-80℃保存；

3）每管取500 μL菌液，做為誘導表達前的對照；

4）每管中加入5 μL IPTG（終濃度為1 mM/L），37℃200 r/min誘導表達4 h；

5）誘導結束后各取500 μL菌液，與誘導前菌液共離心，12000 r/min，2 min；

6）棄上清，各加入10 μL的5×樣品緩沖液，100℃加熱5 min變性，12000 r/min，5 min；

7）15%SDS-PAGE電泳分析表達結果。

1.3.3蛋白表達條件優(yōu)化在獲得可溶性蛋白基礎上，需進一步確定最佳表達條件，具體操作：

1）分別取5個含100 mL LB（100 mg/mL Kana）250 mL錐形瓶，1～5號錐形瓶分別加入重組的RXLR128001-28a菌液1 mL，37℃200 r/min振蕩培養(yǎng)。

2）菌液OD600約為0.6～0.8，對1～5號錐形瓶進行條件篩選，不同誘導劑濃度（IPTG終濃度為0.2 mM/L、0.4 mM/L、0.6 mM/L、0.8 mM/L、1.0 mM/L）下誘導表達，誘導結束后離心，4℃，5000 r/min，6 min，棄上清，用10 mL預冷的重懸液重懸沉淀，于4℃下超聲波細胞破碎，破碎后離心，4℃15000 r/min，30min，1～5號分別取上清、沉淀，加入10 μL的5×樣品緩沖液，于100℃加熱5 min變性，上樣前離心，12000 r/min，5 min。

3）15%SDS-PAGE電泳分析，確定可溶性蛋白最優(yōu)表達條件。

1.3.4融合蛋白大量表達在上述研究基礎上，挑取陽性克隆，接種致10 mL LB（50 mg/L Kana）培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6～0.8，然后按1:100接種至1 L LB培養(yǎng)基（50 mg/L Kana），37℃震蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6～0.8，按上述最佳優(yōu)化條件表達，冷卻至16℃，添加IPTG至最適濃度，培養(yǎng)20 h，然后5000 r/min，離心6 min收集菌體，待用。

1.4融合蛋白的純化

1.4.1親和層析純化1）每1 L培養(yǎng)物細胞沉淀懸于50 mL預冷重懸液（20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 8.5）中，于4℃下超聲波破碎（600 W，每6 s間隔6 s共100次），4℃、14000 r/min離心30 min，收集上清，0.22 μm濾膜過濾備用。

2）親和層析純化融合蛋白①將超聲破碎后上清溶液加入裝有預處理Ni-NTA瓊脂糖介質柱中，4℃下自然通過層析柱，重復3次。②用洗雜液（20mM/LTris-HCl，150mM/LNaCl，20mM/L咪唑，pH8.5）沖洗掛過蛋白Ni-NTA柱。③用含50～1000 mM咪唑緩沖液（20 mM/L Tris-HCl，150 mM/L NaCl，pH 8.5）梯度洗脫目標蛋白，收集洗脫液。④用SDS-PAGE鑒定梯度洗脫效果，確定最佳洗脫濃度，供后續(xù)純化使用。

1.4.2離子交換純化1）將親和柱純化的樣品用分子截留量為10 KD的超濾管進行濃縮至1 mL左右，并將原溶液換成（20 mM Tris-HCl，50 mM/L NaCl，pH 8.5）。

2）濃縮好的樣品4℃，12000 rpm離心15 min，取上清，用于離子交換層析上樣。

3）將ResourcesQ柱接到AKTA蛋白純化儀上，用低鹽緩沖液（20 mM Tris-HCl，50 mM/L NaCl，pH8.5）進行柱平衡約5個柱體積。

4）將蛋白樣品加到上樣器中，運行程序，采用鹽濃度梯度洗脫的方式純化目的蛋白。其中高鹽緩沖液為（20mMTris-HCl，2 M/LNaCl，pH8.5），低鹽緩沖液為（20mMTris-HCl，50mM/LNaCl，pH8.5）。

5）不同濃度鹽的洗脫液進行收集，并用SDS-PAGE檢驗分離效果。

2　結果與分析

2.1辣椒疫霉RxLR128001基因克隆與基因序列結構分析

利用辣椒疫霉基因組中效應蛋白RXLR128001基因設計引物，從高致病性菌株SD33內克隆RXLR128001基因?？寺y序以及BLAST比對最終獲得了RXLR128001基因，并且全部上傳Genbank （Genbank no KT726224），利用SignalP4.1 Server軟件預測RXLR128001基因信號肽。辣椒疫霉RXLR128001基因序列數(shù)據(jù)分析如下（圖1）。

辣椒疫霉效應蛋白RXLR128001基因完整的開放閱讀框ORF序列為2016 bp，編碼671個氨基酸，預測編碼蛋白的分子量為75.8 kDa，信號肽含21個氨基酸。

圖1　辣椒疫霉菌效應蛋白分子RXLR128001基因氨基酸序列Fig.1　Amino-acid sequence of Phytophthora capsici effector gene RXLR128001陰影部分為信號肽氨基酸序列，*為終止密碼子Amino acids within shady indicate the signal peptide，* is terminal code

2.2RXLR128001表達與純化

2.2.1RXLR128001重組質粒構建與鑒定PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖顯示有特異DNA條帶，與預期值2016 bp大小相符，見圖2。

RXLR128001-28a重組質粒構建后，經(jīng)PCR篩選，結果證明為陽性。將重組質粒送上海博尚生物公司測序，結果表明讀碼框架完全正確，表明RXLR128001-28a重組質粒構建成功。

2.2.2RXLR128001蛋白表達將pET28a（＋）-RXLR128001重組質粒轉到表達菌株BL21中，由IPTG誘導表達后取樣進行15%SDS-PAGE檢測，圖3所示，電泳圖顯示RXLR128001重組融合蛋白在大腸桿菌中大量表達，圖中1號泳道為誘導前，2～5號泳道為加入IPTG，37℃誘導4 h后，可發(fā)現(xiàn)明顯的增強帶，大小和目的蛋白75.8 KDa相吻合。

通過對不同溫度、誘導劑濃度和誘導時間等表達條件優(yōu)化，結果顯示：在16℃，IPTG終濃度1 mM/L，誘導16 h條件下，pH10.3的Buffer中，破菌后的上清液RXLR128001蛋白可溶性和表達較好，由此確定蛋白大量表達的適宜條件。

2.2.3RXLR128001蛋白純化

（1）RXLR128001蛋白親和層析純化對RXLR128001蛋白超聲裂解后SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)在中性及弱堿性條件下蛋白質均不溶，說明RXLR128001蛋白可溶性較差，疏水性較高，提高pH 10.3及在洗脫液中加入尿素改善其疏水情況，用含50～500 mM咪唑洗脫液進行梯度洗脫，確定最佳洗脫條件確定為100 mM，分別對不同洗脫濃度取樣，進行SDS-PAGE檢測（圖4），發(fā)現(xiàn)目標蛋白主要在100 mM咪唑濃度下能被大量洗脫，剩余少量蛋白在200 mM咪唑可有效洗脫，圖4中1號泳道為超聲后上清液，2～7號泳道分別為50 mM、100 mM、200 mM、300 mM、400 mM、500 mM咪唑洗脫的蛋白。

圖4　RXLR128001蛋白親和層析純化Fig.4　Purification of RXLR128001 protein with affinity chromatography

（2）RXLR128001蛋白離子交換層析純化親和純化后的蛋白樣品，在ResourceQ柱純化中大約在250 mM/L的NaCl濃度下，可看到一個明顯的高峰如圖5:B所示，此時目的蛋白已經(jīng)被洗脫下來，收集不同鹽濃度的洗脫蛋白組分進行SDS-PAGE分析，結果如圖5:A所示，通過離子交換層析后，已除去部分雜蛋白，初步獲得了RxLR128001的較高純度的蛋白。

圖5　A: RXLR128001蛋白離子交換層析純化；B: RXLR128001蛋白ResourceQ柱純化峰值,＊號所示Fig.5　A: Purification of RXLR128001 protein with ion exchange chromatography B: Purification of RXLR128001 protein with ResourceQ column, The peak value was showed by *

3　結論與討論

本研究從辣椒疫霉全基因組JGI（http://genome.jgi-psf.org/）中選取了1個效應蛋白分子RXLR，該基因辣椒疫霉全基因組中的序列號為128001，由此將該基因命名為RXLR128001。基于辣椒疫霉全基因組信息，本研究從辣椒疫霉強致病菌株SD33中分離鑒定了RXLR128001基因，該基因的ORF 含2016 bp，編碼671個氨基酸，編碼的蛋白分子量為75.8 kDa，其氨基酸數(shù)量與蛋白分子量大小均超過了前人預測的卵菌效應蛋白分子RXLR氨基酸數(shù)（100～400個氨基酸）及其蛋白分子量大小[9-11]，因此該基因進化歷程中可能發(fā)生了較大的變化。此外，RXLR128001基因含1個信號肽（21個氨基酸），卵菌效應蛋白分子信號肽具調控效應蛋白分泌或協(xié)調效應分子在寄主細胞內的功能行使[11]?；谏鲜龇治鐾茰yRXLR128001基因可能是一個重要的功能基因，在辣椒疫霉菌與辣椒寄主互作過程中，可被分泌至辣椒寄主細胞，并具明顯的破壞或干擾辣椒寄主細胞代謝的性能，或者可能具誘導寄主細胞壞死或誘導寄主產(chǎn)生防衛(wèi)反應的功能。因此，在已克隆RXLR128001基因和分析該基因序列信息基礎上，利于后續(xù)深入開展該基因功能的研究。

目前有關卵菌效應蛋白結構生物學研究信息積累較少，但如解讀具重要功能的效應蛋白三級結構，基于結構信息基礎上，深入開展基因功能機制的研究，利于探明效應蛋白分子分泌、誘導細胞壞死致病乃至誘導寄主細胞產(chǎn)生防衛(wèi)反應的性能。因此，針對性的開展卵菌效應蛋白表達純化，獲得高純度蛋白，對于開展晶體結構生物學具重要的意義。本研究開展了RXLR128001基因的原核表達研究，證明該基因重組蛋白可在大腸桿菌中大量表達，并進一步優(yōu)化了適宜該基因高效表達的誘導因子。在此基礎上，借助親和層析和離子交換層析技術，對RXLR128001效應蛋白進行了多次純化，獲得了較高純度的蛋白（圖4，圖5）。本研究制備了該效應蛋白的高純度蛋白，為進一步優(yōu)化及進行蛋白結構生物學研究提供了扎實的技術儲備。在此基礎上，開展晶體優(yōu)化培養(yǎng)和蛋白結構生物學和基因功能機制研究，利于深入探明卵菌不同效應蛋白分子-病菌寄主互作過程中的分子作用機制，預期研究具重要的科學意義。

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Clone of Nontoxic Gene RXLR128001 in Phytophthora capsici and Expression and Purification of Effector Protein

WANG Xiao-mei*，ZHANG Zhong-wen，YANG Nan
College of Agronomy/Jilin Agricultural University, Changchun 130118，China

Abstract:In this study，we cloned a nontoxic gene RXLR128001 from Phytophthora capsici and then analyzed the sequence structure of it based on the BLAST and SignalP4.1 Server software. At the same time，we expressed and purified RXLR128001 gene in Escherichia coli and determined the optimal conditions that could induce RXLR128001 gene to be effective expressed. Finally，we prepared the high pure protein of RXLR128001 gene to be beneficial to the further study on the crystal cultivation and optimization of it.

Keywords:Phytophthora capsici；effector protein；gene clone；expression and purification of protein

*通訊作者：Author for correspondence. E-mail:wxm820@126.com

作者簡介：王曉梅（1971-），女，副教授，主要從事植物病理學研究. E-mail:wxm820@126.com

基金項目：轉基因生物新品種培育重大專項（2014ZX0801004B）

收稿日期：2015-10-11俢回日期：2015-10-20

中圖法分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-2324（2016）01-0025-05