■趙彩春　區(qū)毅垣　史寶軍

（廣東海大集團股份有限公司，廣東廣州511400）

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納豆芽孢桿菌FK- 3液體發(fā)酵條件優(yōu)化

■趙彩春區(qū)毅垣史寶軍

（廣東海大集團股份有限公司，廣東廣州511400）

摘要：文章旨在研究一株納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)FK-3液體發(fā)酵的最佳發(fā)酵條件及培養(yǎng)基配方。采用單因素試驗以及正交試驗，對培養(yǎng)條件如溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量、初始pH值以及培養(yǎng)基配方的碳源、氮源、無機鹽等因素進行研究，試驗數(shù)據(jù)通過SPSS 22軟件展開單因素方差分析、正交試驗極差分析及方差分析。結(jié)果表明，該菌株的最適培養(yǎng)條件是初始pH值為7.5，溫度33℃，搖床轉(zhuǎn)速190 r/min，裝液量為60 ml/250 ml三角瓶，接種量為4%，種齡是20 h，收獲時間為20 h。培養(yǎng)基配方為米糠1.0%，玉米粉1.0%，玉米淀粉2.0%，豆粕4%，酵母膏1.0%，磷酸氫二鈉0.1%，硫酸鎂0.05%，氯化鈣0.05%，硫酸錳0.01%。FK-3在15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵活菌量達1.41×1010cfu/ml，芽孢數(shù)為1.37×1010cfu/ml，芽孢率為97%。

關鍵詞：納豆芽孢桿菌；發(fā)酵條件；培養(yǎng)基配方；單因素試驗；正交試驗；SPSS

納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)是1906年日本遲村對納豆進行研究時，分離出得到的一種產(chǎn)蛋白酶益生菌[1]。納豆芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的一個亞種[2]，其產(chǎn)生的堿性蛋白酶納豆激酶被發(fā)現(xiàn)為最具潛力的口服溶纖蛋白酶[3]，在醫(yī)藥和保健食品等領域得到了廣泛的研究和應用，并且納豆菌也是我國被列入農(nóng)業(yè)部公布允許使用的飼料級微生物添加劑之一[4]。近年來，國內(nèi)外掀起納豆激酶的研究和開發(fā)熱潮，大部分關于納豆芽孢桿菌的研究主要集中在其本身的生理功能和產(chǎn)物納豆激酶上，如納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選、納豆激酶的純化[5-8]。相對于納豆芽孢桿菌其它方面的研究，涉及到納豆芽孢桿菌發(fā)酵工藝摸索的研究以固體發(fā)酵形式居多，而關于納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵工藝研究則相對較少，國內(nèi)關于以提高納豆芽孢桿菌活菌量為目的的液體發(fā)酵條件優(yōu)化的文獻非常之少[9-10]。本文以液體發(fā)酵出發(fā)，研究了納豆芽孢桿菌FK-3液體發(fā)酵活菌量的影響因素，篩選出最適培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配方組成，為該菌株后續(xù)應用于微生態(tài)制劑提供一定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種來源

納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus natto)為本實驗室分離保存并經(jīng)廣東微生物檢測中心鑒定。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基及活菌計數(shù)用培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，水1 L，pH值7.2。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），購自美國BD。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，水1 L，pH值7.2。

摸索培養(yǎng)基配方用培養(yǎng)基：玉米粉1%，玉米淀粉2%，酵母膏1%，硫酸鎂0.05%，氯化鈣0.05%，硫酸錳0.01%。待選碳源（蔗糖、葡萄糖、乳糖、米糠），待選氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕），待選無機鹽（氯化鉀，氯化鈉，磷酸氫二鉀，磷酸氫二鈉）。

1.2試驗方法

1.2.1細菌計數(shù)

摸索培養(yǎng)條件試驗通過發(fā)酵液OD600值來檢測發(fā)酵液中生物量。

摸索培養(yǎng)基配方試驗通過稀釋涂平板活菌計數(shù)來檢測發(fā)酵液中生物量。

芽孢率(%)=(水浴熱處理后樣品計數(shù)結(jié)果/水浴熱處理前樣品計數(shù)結(jié)果)×100

1.2.2試驗設計

1.2.2.1生長曲線制作

挑取一環(huán)菌落接種到種子培養(yǎng)液中30℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，按1%接種至裝有30 ml LB培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，30℃，180 r/min搖床培養(yǎng)。每隔4 h取樣用空白LB稀釋10倍后檢測OD600值，繪制生長曲線。根據(jù)生長曲線確定細菌種齡及收獲時間，為后續(xù)優(yōu)化試驗做準備。

1.2.2.2培養(yǎng)條件單因素試驗

在LB培養(yǎng)基中，分別控制初始pH值（6、7、8、9）、轉(zhuǎn)速（180、200、220 r/min）、溫度（30、33、36℃）、裝液量(30、40、50、60 ml/250 ml)、接種量(1%、3%、5%、7%)開展試驗，根據(jù)1.2.2.1節(jié)得出最佳培養(yǎng)時間取發(fā)酵液稀釋10倍檢測OD600值，對各單因素試驗中發(fā)酵液OD600值進行單因素方差分析，篩選出對發(fā)酵活菌量具有顯著性影響的因素。

1.2.2.3培養(yǎng)條件正交試驗

根據(jù)1.2.2.2節(jié)結(jié)果選取顯著性影響因素，采用SPSS22設計正交試驗，每個因素圍繞單因素實驗中OD600值最高的處理水平設置3個水平。根據(jù)1.2.2.1節(jié)生長曲線中的最佳培養(yǎng)時間取發(fā)酵液稀釋10倍測OD600，通過極差分析及方差分析，得出最佳培養(yǎng)條件組合。

1.2.2.4培養(yǎng)基成分單因素試驗

以玉米粉1.0%，玉米淀粉2.0%，酵母膏1.0%，硫酸鎂0.05%，氯化鈣0.05%，硫酸錳0.01%為固定成分，分別加入不同碳源(蔗糖、葡萄糖、乳糖、米糠)，以1.2.2.3節(jié)篩選出的最佳條件組合為培養(yǎng)條件進行碳源單因素試驗，活菌計數(shù)篩選出最優(yōu)碳源；分別加入不同氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕），開展氮源單因素試驗，篩選出最優(yōu)氮源；分別加入不同無機鹽（氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉），開展無機鹽單因素試驗，篩選出最優(yōu)無機鹽。

1.2.2.5培養(yǎng)基成分正交試驗

根據(jù)1.2.2.4節(jié)中得出的最優(yōu)碳源、氮源、無機鹽，結(jié)合文獻資料，設計3因素3水平的正交試驗，根據(jù)

1.2.2.3節(jié)得出的最優(yōu)培養(yǎng)條件組合開展試驗，根據(jù)

1.2.2.1節(jié)得出的培養(yǎng)時間取發(fā)酵液活菌計數(shù)，通過極差分析及方差分析，得出最佳培養(yǎng)基配方。

2　結(jié)果

2.1生長曲線制作

FK-3的生長曲線如圖1所示，F(xiàn)K-3的生長延遲期非常短，在新鮮培養(yǎng)液中能迅速進入增殖狀態(tài)進入生長數(shù)期，在20 h時生物量達到最高，之后進入短暫的平臺期，24 h后菌液濃度明顯開始下降，菌株生長進入衰退期。因此在后續(xù)試驗中可選擇20 h為菌株種齡。鏡檢顯示FK-3在培養(yǎng)20 h時芽孢率約95%以上，因此20 h也可作為發(fā)酵收獲時間。

2.2培養(yǎng)條件單因素試驗

2.2.1溫度對FK-3發(fā)酵活菌量的影響溫度單因素影響

試驗結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過SPSS軟件單因素方差分析，F(xiàn)K-3在33℃條件發(fā)酵液稀釋10倍OD600達0.764±0.02，在P=0.05水平上顯著高于30℃（0.710± 0.02）及36℃（0.452±0.03)。說明溫度能顯著影響FK-3發(fā)酵活菌量，且最適溫度為33℃。

圖1 FK-3生長曲線

圖2溫度對FK-3生長影響

2.2.2轉(zhuǎn)速對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

轉(zhuǎn)速對FK-3發(fā)酵活菌量的影響試驗結(jié)果如圖3所示，經(jīng)SPSS軟件AVONA分析表明，180 r/min條件對FK-3發(fā)酵活菌量具有顯著優(yōu)勢（P＜0.05）。

圖3轉(zhuǎn)速對FK-3生長的影響

2.2.3初始pH值對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

發(fā)酵液初始pH值對FK-3發(fā)酵活菌量影響如圖4所示，F(xiàn)K-3能適應pH值6～8范圍，在pH值9完全不生長。經(jīng)SPSS軟件AVONA分析，顯示pH值8時菌液濃度顯著高于其他條件（P＜0.05）。

圖4初始pH值對FK-3生長的影響

2.2.4裝液量對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

裝液量對FK-3發(fā)酵活菌量的影響如圖5所示，經(jīng)SPSS軟件AVONA分析顯示，裝液量為60 ml時，活菌量顯著高于其他體積條件下（P＜0.05），說明裝液量對FK-3發(fā)酵活菌量影響顯著。

圖5裝液量對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

2.2.5接種量對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

接種量對FK-3發(fā)酵活菌量的影響如圖6所示，經(jīng)SPSS軟件AVONA及Duncan多重比較顯示，接種比例為5%時菌量顯著高于1%及3%條件下活菌量（P＜0.05），但與接種量7%時無顯著差異（p＞0.05），從資源節(jié)省角度出發(fā)，5%接種量最佳。

圖6接種量對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

2.3培養(yǎng)條件正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用SPSS設計4因素3水平正交試驗表，如表1所示。

表1 FK-3培養(yǎng)條件正交試驗設計因素水平

正交試驗結(jié)果分析見表2，2次重復試驗結(jié)果納入分析，極差分析顯示RC＞RD＞RB＞RA，表明各因素對試驗結(jié)果的影響大小依次為C＞D＞B＞A。最佳組合為A3B1C2D1，即轉(zhuǎn)速190 r/min，pH值7.5，裝液量60，接種量4%。

通過SPSS 22對正交試驗結(jié)果進行方差分析，如圖7所示，據(jù)第3平方和可看出因素對結(jié)果影響大小依次為C＞D＞B＞A,各因素對活菌量均具有顯著影響，最佳組合為A3B1C2D1。方差分析與極差分析結(jié)果吻合，均表明最佳組合為轉(zhuǎn)速190 r/min，pH值為7.5，裝液量為60 ml/250 ml，接種量為4%。

表2 FK-3培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果分析

圖7培養(yǎng)條件正交試驗SPSS軟件方差分析

2.4培養(yǎng)基成分單因素試驗

2.4.1碳源對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

碳源對FK-3發(fā)酵活菌量影響如圖8所示，4種碳源中，米糠作為碳源時發(fā)酵活菌數(shù)最高，經(jīng)單因素方差分析，米糠作為碳源發(fā)酵活菌數(shù)高于其它碳源活菌數(shù)達到顯著水平（P＜0.05）。

2.4.2氮源對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

氮源對FK-3發(fā)酵活菌量影響如圖9所示，4種氮源中，豆粕作為氮源時發(fā)酵活菌數(shù)最高，經(jīng)單因素方差分析，豆粕作為氮源發(fā)酵活菌數(shù)高于其它氮源活菌數(shù)達到顯著水平（P＜0.05）。

2.4.3無機鹽對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

無機鹽對FK-3發(fā)酵活菌量影響如圖10所示，4種無機鹽中，磷酸氫二鈉處理組發(fā)酵活菌數(shù)最高,經(jīng)單因素方差分析，磷酸氫二鈉處理組顯著優(yōu)于其它無機鹽處理組(P＜0.05)，故選磷酸氫二鈉為FK-3發(fā)酵的最佳無機鹽。

圖8碳源對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

圖9氮源對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

圖10無機鹽對FK-3發(fā)酵活菌量的影響

2.5培養(yǎng)基配方正交試驗

根據(jù)培養(yǎng)基單因素試驗結(jié)果，采用SPSS設計3因素3水平正交試驗表，如表3所示。

表3培養(yǎng)基組分正交試驗設計

培養(yǎng)基組分正交試驗結(jié)果如下表4所示。

由極差分析結(jié)果可看出，RA＞RB＞RC,即各因素對活菌量影響大小依次為米糠＞豆粕＞無機鹽。從表中結(jié)果可看出最佳理論組合是A2B1C3,正交試驗中沒有與這個理論組合一致的組合，因此需要按照理論最佳組合開展驗證試驗。在500 ml三角瓶中活菌量達5.0×109cfu/ml，在15 L發(fā)酵罐中活菌量可達1.41× 1010cfu/ml，芽孢數(shù)為1.37×1010cfu/ml，芽孢率為97%。

用SPSS軟件對正交實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果如圖11所示，從第三方平方和看，米糠＞豆粕＞無機鹽，說明3個因素對活菌量影響大小依次是米糠＞豆粕＞無機鹽，與極差分析結(jié)果一致。其中米糠含量對發(fā)酵活菌量的影響顯著（P＜0.05）。

表4 FK-3培養(yǎng)基組分正交試驗結(jié)果

圖11培養(yǎng)基配方正交試驗SPSS軟件方差分析結(jié)果

3　結(jié)論

納豆枯草芽孢桿菌FK-3液體發(fā)酵受發(fā)酵條件影響，如溫度，初始pH值，轉(zhuǎn)速，裝液量及接種量，這些因素都顯著影響著FK-3液體發(fā)酵活菌量。培養(yǎng)基組分米糠的含量也顯著影響著發(fā)酵活菌量水平。本試驗篩選的最佳培養(yǎng)基配方組合為：米糠1.0%，玉米粉1.0%，玉米淀粉2.0%，豆粕4.0%，酵母膏1.0%，磷酸氫二鈉0.1%，硫酸鎂0.05%，氯化鈣0.05%，硫酸錳0.01%，初始pH值7.5，裝液量60 ml/250 ml,接種量為4%，33℃，190 r/min，培養(yǎng)20 h。以該培養(yǎng)條件組合在250 ml瓶中發(fā)酵活菌量可達5×109cfu/ml，芽孢率約為90%。在15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵中發(fā)酵活菌量達1.41×1010cfu/ml，芽孢數(shù)為1.37×1010cfu/ml，芽孢率為97%。

參考文獻

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（編輯：王芳，xfang2005@163.com）

Optimization of liquid fermentation condition for Bacillus natto FK-3

Zhao Caichun, Qu Yiyuan, Shi Baojun

Abstract：This experiment was conducted to study the optimization of liquid fermentation condition and medium for a Bacillus natto strain FK-3. The single-factor method and orthogonal experimental method were used to optimize the fermentation condition of initial pH, temperature, rotation speed, in?oculation amount and the fermentation medium factors of carbon sources, nitrogen sources and inorgan?ic salts. ANOVA and orthogonal test range analysis and variance analysis were conducted by SPSS22. The result showed the optimization condition for Bacillus natto strain FK-3 are as following: initial pH was 7.5, temperature was 33℃, rotation speed was 190 r/min, liquid volume was 60 ml/250 ml, inocu?lation amount was 4.0%, fermentation time was 20 h. The optimization medium component are as fol?lowing : rice bran 1.0%,corn flour 1.0%,corn starch 2.0%, soybean meal 4.0%, yeast extract 1.0%, Na2HPO40.1%, MgSO40.05%,CaCl20.05%,MnSO40.01%. The bacteria number of FK-3 was 1.41× 1010cfu/ml when fermentation in 15 L fermenter and spores number was 1.37×1010cfu/ml, The spores rate was 97%.

Key words：Bacillus natto；fermentation condition；fermentationmeduim；single-factor experimental；or?thogonal experimental；SPSS

收稿日期：2015-10-21

作者簡介：趙彩春，碩士，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖微生態(tài)制劑研究。

中圖分類號：S816.6

文獻標識碼：A

文章編號：1001-991X（2016）03-0039-05

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.03.008