王 　 爽，　王 　 璐，　許 春 雨，　馬 志 揚(yáng)，　李 　 晗，　葉 淑 紅

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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銀杏內(nèi)生菌EndoGin Ya6合成胞外多糖培養(yǎng)條件的優(yōu)化

王 爽，王 璐，許 春 雨，馬 志 揚(yáng)，李 晗，葉 淑 紅

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:銀杏內(nèi)生菌Endo Gin Ya6能產(chǎn)生與銀杏多糖具有相似功能性的胞外多糖。試驗優(yōu)化了銀杏內(nèi)生菌Endo Gin Ya6合成胞外多糖的培養(yǎng)條件，測定菌株胞外多糖含量，并以多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，采用單因素與正交試驗相結(jié)合的方法，最終確定出該菌株合成胞外多糖最佳培養(yǎng)基組成為：蔗糖12%，酵母浸粉0.8%，氯化鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，氯化鉀0.1%，培養(yǎng)基初始pH 7.5。最佳發(fā)酵條件為：裝液量70 mL，發(fā)酵溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，接種量為2%，培養(yǎng)時間36 h。在此條件下，菌株產(chǎn)胞外多糖能力可達(dá)10.265 g/L。

關(guān)鍵詞:銀杏；植物內(nèi)生菌；胞外多糖

0引言

銀杏(GinkgobilobaL.)是我國特有的藥食同源植物[1]，其中銀杏多糖是銀杏葉提取物中重要的活性成分[2-3]。近年來的研究表明，銀杏多糖具有清除自由基、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化、延緩機(jī)體衰老進(jìn)程的作用；能促進(jìn)荷瘤小鼠及環(huán)磷酰胺損傷小鼠脾淋巴細(xì)IL-2胞活性，抑制血清sIL-2R的形成，從而提高小鼠的免疫功能；并有抑制人急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞增殖作用等功能[4-6]。另外，由于銀杏多糖獨特的功能性和安全性及其可改善食品的食用品質(zhì)、加工品質(zhì)等特性，可作為抗氧化劑、穩(wěn)定劑以及乳化劑等應(yīng)用于食品的生產(chǎn)加工中[7]。

基于某些內(nèi)生菌能產(chǎn)生和其共生植物相同或相似生物活性物質(zhì)的特點[8-10]，可從植物中篩選出可產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的內(nèi)生菌，并通過發(fā)酵得到大量的產(chǎn)物[11-13]。從銀杏健康組織中篩選出的細(xì)菌可產(chǎn)生與銀杏葉多糖結(jié)構(gòu)和功能相似的胞外多糖，通過深層發(fā)酵可實現(xiàn)工業(yè)化[14]，從而避免從植物中提取多糖造成的資源枯竭，使生產(chǎn)不再受到地域及季節(jié)的限制[15]。目前，國內(nèi)外對銀杏內(nèi)生菌的研究大都集中在抗菌活性或可以產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生菌，對產(chǎn)生類銀杏多糖內(nèi)生菌還鮮有研究。本試驗通過優(yōu)化銀杏內(nèi)生菌EndoGin Ya6合成胞外多糖的發(fā)酵條件，提高該菌株產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量，以期為類銀杏葉多糖的研究開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

銀杏內(nèi)生菌EndoGin Ya6：由本試驗室從銀杏芽中分離、鑒定并保藏。

1.1.2發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鉀1 g，水1 000 mL，pH 7.3～7.5[16]。

1.2方法

1.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，用苯酚硫酸法于490 nm下測定吸光度，橫坐標(biāo)為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液曲線[16]。

1.2.2胞外多糖含量測定

取10 mL發(fā)酵液在4 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液加3倍體積95%乙醇，4 ℃下醇沉過夜，離心取沉淀，加適量水復(fù)溶后[17]，用苯酚硫酸法測定多糖含量[18]。

1.2.3發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)基的優(yōu)化

分別以乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖為碳源(3%)，確定最佳碳源；改變培養(yǎng)基中碳源的添加量，確定碳源添加量；將培養(yǎng)基的氮源分別改為0.3%酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、硝酸鈉、氯化銨、尿素，以確定最佳氮源；培養(yǎng)基中氮源的添加量分別為0.2%～1.0%，確定氮源添加量；鈉、鉀、鐵、錳、鈣、鎂等是常見的生長因子，因此在添加0.5%氯化鈉的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基中分別加入0.1%的磷酸氫二鉀、硫酸鐵、氯化錳、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂，確定培養(yǎng)基中無機(jī)鹽添加的種類；用氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH，確定培養(yǎng)基最佳pH?；A(chǔ)發(fā)酵條件為接種量2%、28 ℃、180 r/min、36 h。

1.2.4發(fā)酵產(chǎn)糖條件的優(yōu)化

使用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別改變裝液量、溫度、搖床轉(zhuǎn)速以及接種量，考察各發(fā)酵條件對菌株胞外多糖產(chǎn)量影響。

1.2.5正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果采用L9(34)正交試驗，如表1所示以蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酵母浸粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)以及pH(C)和裝液量(A)、溫度(B)、搖床轉(zhuǎn)速(C)及接種量(D)作為考察因素(表2)，選取3個水平進(jìn)行試驗，確定最佳培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件。

表1　培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗因素和水平

表2　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素和水平

2結(jié)果與討論

2.1發(fā)酵培養(yǎng)基條件的優(yōu)化

2.1.1碳源的選擇

由圖1可知，以蔗糖作為碳源菌株的產(chǎn)糖能力最高，同時蔗糖還能為菌株生長提供多種氨基酸和所需維生素，為菌株提供了適宜的生長環(huán)境，故選擇蔗糖作為碳源。

圖1　不同碳源對胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.1.2碳源用量

以蔗糖為碳源，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖對發(fā)酵過程中胞外多糖產(chǎn)量的作用，如圖2所示。隨著蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，多糖的產(chǎn)量也隨之增加，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過12%，多糖的產(chǎn)量反而下降。這可能是由于碳源的含量較小而無法滿足微生物的生長需要，而當(dāng)碳源的濃度過高時，也會對微生物的生長有抑制作用。

2.1.3氮源的選擇

考察不同氮源對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響。

圖2　蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對Endo Gin Ya6菌株胞

如圖3所示，以酵母浸粉作為氮源時，菌株產(chǎn)糖量最高，可達(dá)到6.88 g/L，以尿素作為氮源時菌株的產(chǎn)糖量最低。這說明與無機(jī)氮源相比，有機(jī)氮源更有利于菌株的產(chǎn)糖發(fā)酵。因此，選擇酵母浸粉作為該菌株產(chǎn)糖發(fā)酵的氮源。

圖3　不同氮源對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.1.4氮源用量

考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酵母浸粉對菌株胞外多糖的產(chǎn)量的影響。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)基中氮源的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時，菌株的產(chǎn)糖量最高，因此選擇氮源的添加量為0.8%。

圖4　酵母浸粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對菌株胞外多糖產(chǎn)量的

2.1.5無機(jī)鹽

由圖5可知，在添加氯化鈉的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中添加氯化鉀和磷酸二氫鉀時對多糖產(chǎn)量有促進(jìn)作用，且磷酸氫二鉀具有緩沖液的性質(zhì)，可為菌株提供穩(wěn)定的代謝環(huán)境，因此，選擇氯化鉀和磷酸二氫鉀兩種無機(jī)鹽作為除氯化鈉以外的無機(jī)鹽的輔助，以豐富培養(yǎng)基的營養(yǎng)。

圖5　無機(jī)鹽種類對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.1.6初始pH

培養(yǎng)基的初始pH對菌株胞外多糖產(chǎn)量也有較大影響。由圖6可知，當(dāng)pH為8.5時，菌株的產(chǎn)糖量最高，可達(dá)9.55 g/L。

圖6　初始pH對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.1.7培養(yǎng)基組成的正交試驗結(jié)果

對培養(yǎng)基組成進(jìn)行正交試驗，結(jié)果如表3所示，3個因素對菌株胞外多糖含量影響的主次順序為C,A,B，最佳組合為A2B2C1，即蔗糖12%，酵母浸粉0.8%，培養(yǎng)基初始pH 7.5，在此條件下進(jìn)行驗證試驗，菌株胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)9.233 g/L。

表3　培養(yǎng)基組成正交試驗數(shù)據(jù)分析表

2.2發(fā)酵產(chǎn)糖條件的優(yōu)化

2.2.1裝液量

在250 mL錐形瓶中裝入不同體積的培養(yǎng)基，考察不同的裝液量對多糖產(chǎn)量的影響。從圖7可知，當(dāng)裝液量達(dá)到70 mL時，菌株的產(chǎn)糖量最高。

圖7　裝液量對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.2.2溫度

在發(fā)酵時，溫度對微生物的生長有密切的影響，且對微生物代謝產(chǎn)物的合成有重要作用。由圖8可以看到，在28 ℃時菌株胞外多糖產(chǎn)量最高，這可能是因為該溫度最適合菌株生長，其胞外多糖產(chǎn)量也達(dá)到最高。

圖8　溫度對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.2.3搖床轉(zhuǎn)速

在發(fā)酵過程中，搖床轉(zhuǎn)速越高，溶氧量越多，越適合菌株的生長。如圖9所示，在一定范圍內(nèi)，多糖的產(chǎn)量同轉(zhuǎn)速呈正相關(guān)。達(dá)到一定轉(zhuǎn)速時，多糖產(chǎn)量增速變慢，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選擇搖床的轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.2.4接種量

如圖10所示，當(dāng)接種量低于3%時，菌體數(shù)量較少，相同時間內(nèi)通過發(fā)酵得到的多糖含量也較低；當(dāng)接種量超過3%時，菌體數(shù)量過多，菌體間存在著競爭，影響了胞外多糖的合成與積累。

圖9　搖床轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量的影響

圖10　接種量對菌株胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.2.5發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗結(jié)果

對菌株產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果如表4所示，4個因素對試驗結(jié)果影響的主次順序為A，C，B，D，最佳組合為A2B2C3D1，即裝液量為70 mL，28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量2%，在此最佳條件下進(jìn)行驗證試驗，菌株胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)到10.265 g/L。

表4　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗數(shù)據(jù)分析表

3結(jié)論

菌株EndoGin Ya6產(chǎn)胞外多糖最佳培養(yǎng)基組成：蔗糖12%，酵母浸粉0.8%，氯化鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，氯化鉀0.1%，培養(yǎng)基初始pH 7.5。最佳發(fā)酵條件為：裝液量70 mL，28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量2%，培養(yǎng)時間36 h，在此條件下進(jìn)行驗證試驗，菌株產(chǎn)胞外多糖能力可達(dá)10.265 g/L。

本試驗表明，不同培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件對銀杏內(nèi)生菌EndoGin Ya6產(chǎn)胞外多糖的能力有不同影響。對EndoGin Ya6合成胞外多糖的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，菌株胞外多糖的產(chǎn)量可達(dá)10.265 g/L，與戴余軍等[19]和陳義勇等[20]直接從銀杏葉中提取銀杏葉多糖相比，發(fā)酵多糖具有優(yōu)勢，為銀杏多糖的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions of extracellular polysaccharides fromEndoGin Ya6

WANGShuang,WANGLu,XUChunyu,MAZhiyang,LIHan,YEShuhong

( School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:Extracellular polysaccharides from Endo Gin Ya6 was similar to that from Ginkgo biloba L. in functional properties. In this paper, the yield of extracellular polysaccharides was estimated and the culture condition of extracellular polysaccharides from Endo Gin Ya6 was optimized by orthogonal experiment. The optimal culture condition for extracellular polysaccharides production were: sucrose 12%, yeast extract 0.8%, NaCl 0.5%, K2HPO40.1%, KCl 0.1% at pH 7.5 and 200 r/min, 28 ℃ for 36 h. The highest yield of extracellular polysaccharides of Endo Gin Ya6 was 10.265 g/L

Key words:ginkgo; endophyte; extracellular polysaccharide

作者簡介:王 爽(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：葉淑紅(1972-)，女，教授.

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(31370554).

收稿日期:2014-12-31.

中圖分類號:TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1674-1404(2016)01-0001-05