丁運華,李德浩,鄧婷婷
(惠州學(xué)院生命科學(xué)系,廣東 惠州 516007)
羅非魚肌肉乙酰膽堿酯酶的制備及凍干穩(wěn)定性研究
丁運華,李德浩,鄧婷婷
(惠州學(xué)院生命科學(xué)系,廣東 惠州 516007)
以羅非魚(Oreochromis aurea)肌肉組織為材料提取乙酰膽堿酯酶,采用正交試驗法研究了不同提取條件(離心轉(zhuǎn)速、提取液質(zhì)量體積比W/V、勻漿時間)下肌肉粗酶液的酶活力,得到提取酶的最佳條件組合為離心轉(zhuǎn)速6000rmp,提取液質(zhì)量體積比W/V為1:4,勻漿時間為20s。在酶的冷凍干燥穩(wěn)定性實驗中,添加5%聚乙二醇或5%蔗糖作為穩(wěn)定劑能有效保護酶活力,凍干時剩余酶活力約為80%。作為保護劑5%聚乙二醇和5%蔗糖兩者的差異不顯著。酶干粉保存15d時,三種保存溫度下(-20℃,0-4℃,20-25℃),添加保護劑與不添加保護劑的酶活力差值約為10%;30d時,差值為10%~15%;60d時,差值為30%~40%。隨著保存溫度的提高,添加保護劑的穩(wěn)定效應(yīng)逐漸被較高溫度對酶活力的不利影響抵消。添加5%聚乙二醇作為穩(wěn)定劑,-20℃,60d時,酶干粉測得剩余酶活力為74%。
羅非魚;乙酰膽堿酯酶;冷凍干燥;穩(wěn)定劑
隨著人們食品安全意識的不斷提高,農(nóng)藥殘留的快速檢測法越來越多地應(yīng)用到生活實踐中。酶抑制法簡便、靈敏、經(jīng)濟,是目前國內(nèi)應(yīng)用最廣泛的的農(nóng)藥殘留快速檢測方法,此法的關(guān)鍵是獲得對農(nóng)藥敏感、活力高、價格成本適中的膽堿酯酶(乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的總稱)。乙酰膽堿酯酶(AChE)是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶,能高效水解神經(jīng)傳遞物質(zhì)乙酰膽堿,保證神經(jīng)沖動在突觸間的正常傳導(dǎo);同時,它也是有機磷農(nóng)藥的靶酶。乙酰膽堿酯酶與有機磷農(nóng)藥結(jié)合后,該酶活性中心的絲氨酸的羥基發(fā)生磷?;瑥亩乖撁覆荒茉賲⑴c水解乙酰膽堿,最終導(dǎo)致突觸間神經(jīng)傳遞物質(zhì)的積聚,阻斷了神經(jīng)傳導(dǎo)。利用AChE被有機磷特異性抑制的原理,可以將其作為生物標(biāo)志物用于農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境、軍事等領(lǐng)域中有機磷化合物的檢測[1-3]。目前該酶主要從家蠅、電鰻等提取,提取過程復(fù)雜、成本偏高。因此市場的膽堿酯酶價格昂貴,國內(nèi)還不能大批量生產(chǎn)膽堿酯酶。膽堿酯酶粗酶液用于基層現(xiàn)場快速檢測有很多不便,如不利攜帶、難以儲藏、穩(wěn)定性差等[4],冷凍干燥技術(shù)在微生物的保存中研究和應(yīng)用較多,如乳桿菌,雙岐桿菌,乳酸菌,黑曲霉孢子粉等[5],而酶的冷凍干燥的研究則比較少見[6]。本文以羅非魚肌肉為材料,探討羅非魚肌肉乙酰膽堿酯酶的制備及凍干穩(wěn)定性,為膽堿酯酶的大批量生產(chǎn)提供參考。
1.1 材料
試驗材料選用奧利亞羅非魚(Oreochromis aurea),體長(30±2)cm,
由廣東省惠州市水產(chǎn)科學(xué)研究所試驗場提供,體長(30±2)cm,體質(zhì)健康,規(guī)格一致,自然死亡率低于1%,試驗前馴養(yǎng)7d以上;試驗用水為曝氣3d后除氯的自來水。
1.2 試劑與儀器
碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)、碘化硫代丁酰膽堿(BuTChI)及二硫代雙對硝基苯甲酸(DTNB)均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司的進(jìn)口分裝產(chǎn)品,其余試劑為國產(chǎn)分析純或生化試劑規(guī)格。GL-20B型高速冷凍離心機:上海安亭科學(xué)儀器廠;722G型可見光分光光度計:INESA上海儀電分析儀器有限公司;DK-8B型電熱恒溫水槽:上海精宏實驗設(shè)備有限公司;LGJ-18型真空冷凍干燥機:北京四環(huán)科學(xué)儀器廠。
1.3 方法
1.3.1 乙酰膽堿酯酶提取
取新鮮羅非魚背部肌肉用絞肉機絞成肉糜,加入pH8.0的PBS,4℃勻漿,冷凍靜置15min(使目標(biāo)酶充分釋放出來到溶液中),4℃離心15min,取上清液,即得乙酰膽堿酯酶粗酶液。根據(jù)已有文獻(xiàn)研究,影響乙酰膽堿酯酶提取的主要因素包括離心轉(zhuǎn)速、提取液質(zhì)量體積比和勻漿時間。本試驗設(shè)計3因素3水平正交試驗L9(33),詳見表1。
表1 正交試驗中影響因素及水平
按正交表L9(33)所列9個處理組合進(jìn)行實驗,測定酶活力,每個處理重復(fù)3次,每個重復(fù)測定3次。
1.3.2 乙酰膽堿酯酶(AChE)酶活力測定
采用Ellman[7]方法,結(jié)合董之海[8]的終點法稍作修改。反應(yīng)總體積為3.13ml,空白管不加底物,代之以0.1mol/L,pH8.0 PBS,作為調(diào)零管。具體操作為:取數(shù)支試管,分別加入0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液3.0ml,加入待測酶50μl,顯色劑DTNB50μl,將試管置于37℃水浴中保溫15min,向空白試管中加入0.1mol/L pH8.0磷酸緩沖液50μl,作為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)零;向其余各待測管中加入30μl碘化硫化乙酰膽堿底物溶液.試管中溶液混合均勻后立即倒入比色杯中進(jìn)行比色,記錄3min(加入底物混勻后開始計時)前后的吸光值,求出前后的差值ΔA412。酶活力定義為每1 mL酶液每1min催化底物轉(zhuǎn)換為產(chǎn)物的μmol數(shù)。
酶活計算公式:
ΔA412:反應(yīng)前后吸光度的差值(前反應(yīng)值記計為0)
V:反應(yīng)體系總體積(3.15×10-3L)
ε:黃色產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)(1.36×10-4L/mol· cm)
T:反應(yīng)時間3min
D:比色皿寬1cm
1.3.3 酶的冷凍干燥
同一批次的粗酶液測定酶活后,分成三等份,按粗酶液:酶穩(wěn)定劑=1:0.2的比例,分別添加5%的蔗糖穩(wěn)定劑,5%的聚乙二醇穩(wěn)定劑,以及不添加穩(wěn)定劑的空白酶液,置于冷凍干燥機的樣品盤(樣品盤加樣量200ml左右),冰箱-18℃,24h冷凍至清液結(jié)冰。預(yù)凍好的樣品進(jìn)行冷凍干燥,冷阱溫度為-55℃,干燥室壓力<15pa,冷凍時間≥24h,直至樣品呈干爽的絮狀。收取凍干成品時,取出樣品架用干燥的勺子將酶粉轉(zhuǎn)移到塑料自封袋,小心壓碎并擠出袋中空氣,密封好后再套一個自封袋,放入冰箱冷藏室備用。
1.3.4 穩(wěn)定劑、保存溫度、保存時間對酶活的影響
將按1.3.3中制得的酶凍干粉,分別置于-20℃、0~4℃、20~25℃下保存5d,10d,15d,30d,60d,并測定酶活力。
2.1 酶提取的正交實驗
表2 酶提取的不同處理組合的酶活力值
重復(fù)3次,每個重復(fù)測定3次。表中數(shù)據(jù)為平均值。
表3 L9(33)正交試驗極差分析表
表3是對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析的結(jié)果,從中得出各因素對粗酶液提取影響的順序依次為:勻漿時間>提取液質(zhì)量體積比>離心轉(zhuǎn)速。其中勻漿時間的極差最大,表明該因素對酶提取的影響最大。
應(yīng)用極差分析的結(jié)果可以得出各因素的最優(yōu)水平。A因素的最優(yōu)水平是2,即提取粗酶液的離心轉(zhuǎn)速為6000rpm;B因素的最優(yōu)水平為1,即提取液質(zhì)量體積比W/V為1:4;C因素的最優(yōu)水平是1,即勻漿時間為20s。
2.2 添加不同穩(wěn)定劑的凍干酶粉的穩(wěn)定性
表4 添加不同穩(wěn)定劑的凍干酶粉在不同溫度下及保存天數(shù)時的酶活力(OD值)
由表4和圖2、圖3、圖4可知,在酶液冷凍干燥制成干粉階段,酶活力降低幅度最大,酶活下降接近50%;凍干時添加穩(wěn)定劑能有效保護酶活力,凍干時剩余酶活力約為80%;其中在同一保存溫度,同一保存時間下,添加5%聚乙二醇穩(wěn)定劑對酶活力的保護效果比5%蔗糖好,但差異不顯著(P>0.05)。添加5%蔗糖或5%的聚乙二醇的酶制劑,在同一種保存溫度下(-20℃、0-4℃、20-25℃)保存同樣的時間,兩者的酶穩(wěn)定性差異不大。隨著保存時間的延長,添加保護劑后的酶活保護效應(yīng)表現(xiàn)得較為明顯:酶干粉保存15d時,三種保存溫度下,添加保護劑與不添加保護劑的酶活差值約為10%;30d時,差值為10%~15%;60d時,差值為30%~40%。隨著保存溫度的提高,添加保護劑的穩(wěn)定效應(yīng)逐漸被較高溫度對酶活的不利影響抵消。添加5%聚乙二醇作為穩(wěn)定劑,-20℃,60d時,酶干粉剩余酶活為74%。
圖2 -20℃,添加2種穩(wěn)定劑的凍干酶粉在6個時間段的酶活變化
圖4 20-25℃,添加不同穩(wěn)定劑的凍干酶粉在6個時間段的酶活變化
本研究應(yīng)用正交試驗法確定了提取羅非魚肌肉乙酰膽堿酯酶粗酶液的最佳條件。勻漿時間和方式最為關(guān)鍵,勻漿時間過長,獲取大量肌肉組織泡沫,粗酶液量非常少,且酶活力損失大。所以本研究經(jīng)過反復(fù)摸索,采取勻漿20s,效果最佳。最終結(jié)果表明:提取粗酶液的最優(yōu)條件為離心轉(zhuǎn)速為6000rpm,提取液質(zhì)量體積比為1:4;材料攪拌時間為20s,并利用這一結(jié)果為今后對羅非魚乙酰膽堿酯酶粗酶液的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。本實驗室其他小組在提取魚肌肉乙酰膽堿酯酶時采用加入0.1%Triton X-100的提取液,效果較好。但考慮到Triton X-100對后期的冷凍干燥可能會有干擾,所以我們采用不含Triton X-100的提取方法。
冷凍干燥是先將待干燥物料中的水凍成冰,然后使冰升華而除去水分的一種干燥方法,干制品體積小,重量輕,易復(fù)水,適合儲藏和運輸。隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展,多肽蛋白質(zhì)類等生物大分子制劑不斷涌現(xiàn)。為防止大分子變性,目前廣泛采用冷凍干燥法制備。但冷凍干燥會產(chǎn)生多種應(yīng)力使蛋白類變性。因此,為了保護蛋白酶類的活性,通常添加保護劑。常用的保護劑有:①糖類,如蔗糖,甘露醇,海藻糖等。②聚合物,如聚乙二醇,葡聚糖,白蛋白等。③無水溶劑,如甘油,二甲亞砜。保護劑的保護作用與它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān),糖類和聚乙二醇都有大量的羥基,在溶液中易結(jié)合水分子,減少游離水的含量。酶蛋白分子中存在大量氫鍵,保護劑的羥基能在蛋白質(zhì)冷凍干燥失去水分后替代其表面的水的羥基,使酶蛋白表面形成一層假定的水化膜,穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[5]。
快速檢測用的膽堿酯酶要求酶活基本要達(dá)到3min吸光度的變化ΔA412在0.3以上[10],但本次實驗所得的酶干粉酶活偏低,可能有以下幾種情況:①凍干保護劑添加比例還要進(jìn)一步研究,最大限度保護酶活避免較大的損失;②實驗室內(nèi)沒有抽濕機,室內(nèi)濕度較大,酶干粉從樣品盤轉(zhuǎn)移到密封袋的過程中,會吸咐一定水氣,導(dǎo)致后面酶干粉保存時間變短,所測酶活偏低。
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【責(zé)任編輯:吳躍新】
Preparation of Muscle Acetylcholinesterase inOreochromis aureaand Its Stability Analysis of Freeze-drying
DING Yun-hua,LI De-hao,DENG Ting-ting
(Department of Life Science,Huizhou University,Huizhou 516007,Guangdong China)
This paper is aimed to present the author’s research on preparation and freeze-drying stability of muscle acetylcholinesterase(AChE)in Oreochromis aurea.Using orthogonal test,the optimal extraction condition was:6000rpm,w/v of extraction as 1:4,homogenizing time as 20s.In research of freeze-drying stability,5%polyethylene glycol or 5%sucrose are effective in protecting enzyme activity,with remaining enzyme activity as 80%.There is no significant difference between 5%polyethylene glycol and 5%sucrose.After 15 days,with or without protective agent,the difference of enzyme activity among three temperature(-20℃,0-4℃,20-25℃)is 10%,and after 30 days,the difference is 10%~15%,and after 60 days,the difference is 30%~40%,which means as temperature rises,the effect of protective agent would be neutralized.With 5%polyethylene glycol as protective agent,the remaining enzyme activity is 74%60 days under-20℃after freeze-drying.
Oreochromis aurea;acetylcholinesterase;freeze-drying;protective-agent
Q814.1
A
1671-5934(2015)06-0014-04
2016-06-21
廣東省科技計劃項目(2011B030800021);惠州市科技計劃項目(2012P16)
丁運華(1966-),女,湖南益陽人,副教授,碩士,研究方向為酶的研究與應(yīng)用、食品安全與營養(yǎng)。