廖建良，單沛賢

（惠州學(xué)院生命科學(xué)系/生物技術(shù)研究所，廣東 惠州 516007）

烏蕨、雞屎藤提取物的抑菌活性研究

廖建良，單沛賢

（惠州學(xué)院生命科學(xué)系/生物技術(shù)研究所，廣東 惠州 516007）

本文采用濾紙片擴(kuò)散法，稀釋倒平板法，研究烏蕨及雞屎藤提取液的抑菌作用。選用菌種為金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、綠膿桿菌、青霉菌和黑曲霉。目的在于研究烏蕨及雞屎藤利用到食品防腐領(lǐng)域的可能性。結(jié)果表明：烏蕨的乙醇提取液對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草桿菌具有一定的抑菌作用，尤其是對金黃色葡萄球菌的效果更佳，對兩種真菌沒有抑菌作用。其對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌最低抑菌濃度在0.25g/ml。烏蕨的水提取物對細(xì)菌抑菌效果明顯，對兩種真菌沒有抑菌作用。烏蕨的抑菌效果具有熱穩(wěn)定性，但pH值對烏蕨的抑菌效果影響明顯，在pH值7至9之間，烏蕨的抑菌效果減弱或完全喪失。而雞屎藤的乙醇提取物和水提取物對供試菌種均無抑菌作用。同時烏蕨與雞屎藤在水提取的情況下抑菌活性沒有聯(lián)合提高的效果。

烏蕨提取液；雞屎藤提取液；抑菌活性

由微生物引起的食品霉變、腐敗對人類的生產(chǎn)和生活帶來很大的影響，造成了巨大損失。為了更好地保全食品原有的風(fēng)味和更大限度地提高食品的貨價期，食品防腐劑成了首選。但近年來，食品防腐劑對人體安全健康的影響受到了社會的密切關(guān)注。而天然防腐劑的開發(fā)也成了社會研究的課題。[1-4]天然的生物防腐劑一般來源于植物，因其天然、高效、無毒或低毒以及不破壞食品的原有風(fēng)味等顯著特性，成為國際食品添加劑市場的新寵[2]。我國是世界上植物資源最豐富的國家之一，藥用植物種類繁多，應(yīng)用歷史悠久[5]，在植物源天然防腐劑研究領(lǐng)域有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。烏蕨[Stenoloma chusanum（L.）Ching]鱗始蕨科（又稱陵始蕨科）（Lindsaeaceae）烏蕨屬植物，又名大葉金花草、小葉野雞尾、蜢蚱參、細(xì)葉鳳凰尾等，是一種民間中草藥。根狀莖短而橫走，密生赤褐色鉆狀鱗片。葉羽狀細(xì)裂，厚革質(zhì)，無毛；孢子囊群位于裂片頂部，頂生于小脈上，每裂片1-2枚；囊群蓋厚紙質(zhì)，杯形或淺杯形，口部全緣或多少嚙斷狀[6]。烏蕨在民間有“萬能解毒藥”之稱，廣泛用于解食物和農(nóng)藥中毒，還用于治瘡毒、毒蛇咬傷等[7]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，烏蕨具有保肝、抗炎、止血、抗菌作用，臨床上用于治療慢性腎衰、下肢頑固性潰瘍具良好效果[7]。其主要有效成分是黃酮類化合物[8]。雞屎藤[Paederia scandens（Lour.）Merr.]茜草科（Rubiaceae）多年生草質(zhì)藤本植物。藤本，通常長3-5米，多分枝。葉對生，紙質(zhì)。聚傘花序排成頂生帶葉的大圓錐花序或腋生而疏散少花[9]。性平，味甘、微苦。能祛風(fēng)利濕，消食化積，止咳，止痛；用于風(fēng)濕筋骨痛、鐵打損傷、外傷性疼痛、腸胃絞痛、黃疸型肝炎等；本品有鎮(zhèn)痛、降壓與抑菌作用[10]。有關(guān)烏蕨和雞屎藤提取物的抑菌活性研究鮮見報道。本實(shí)驗(yàn)對烏蕨及雞屎藤等藥用植物進(jìn)行深入研究，對植物抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行篩選，提取高效安全的活性物質(zhì)。用濾紙擴(kuò)散法研究其不同提取液對對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、綠膿桿菌、青霉菌和黑曲霉的抑菌作用和抑菌效果穩(wěn)定性分析試驗(yàn)，目的在于研究出具有保健與防腐功能、高效、安全、無或低副作用的天然防腐劑，應(yīng)用于食品保鮮與藥物保鮮。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

1.1.1 藥材

新鮮烏蕨、新鮮雞屎藤地上部分采于惠州學(xué)院后山。以上材料均于采摘后洗凈，自然風(fēng)干24h后，磨碎，備用。

1.1.2 供試菌種

金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、綠膿桿菌、青霉菌和黑曲霉均由惠州學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器

LDZX-40KB立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；HD-650-U超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；PSH-525生化培養(yǎng)箱（重慶試驗(yàn)設(shè)備廠）；MJ-250BPOZA Midea多功能食物攪拌器（廣東美的生活電器制造有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器水浴槽（上海青浦瀘西儀器）；PC-1000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；PHS-3C精密級數(shù)字式酸度計（上海弘毅儀器儀表有限公司）

1.2.2 應(yīng)用試劑

95％乙醇（臺山市粵僑試劑塑料有限公司）；氯化鈣（天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心）；氯化鈉（臺山市粵僑試劑塑料有限公司）；葡萄糖（臺山市粵僑試劑塑料有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：稱取蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂粉15g，牛肉膏粉3g，加水定容至1000ml，加熱至沸騰，分裝至錐形瓶，于0.1MPa，121℃滅菌20min。用于細(xì)菌的培養(yǎng)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：稱取去皮馬鈴薯200g，加入蒸餾水800ml，加熱煮沸30min，用四層紗布過濾，取濾液，加入葡萄糖20g，瓊脂粉16g，加蒸餾水定容至1000ml，加熱至沸騰，分裝至錐形瓶，于0.1MPa，121℃滅菌20min。用于青霉菌和黑曲霉菌的培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 烏蕨與雞屎藤乙醇提取液的制備

稱取自然風(fēng)干磨碎的新鮮烏蕨地上部分100g，加入適量的95％乙醇，在40℃的水浴槽中旋轉(zhuǎn)水浴12h，抽濾，取濾液，再加入適量的95％乙醇，在40℃的水浴槽中旋轉(zhuǎn)水浴12h，抽濾，取兩次濾液，用RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器水浴槽于40℃減壓濃縮至30min內(nèi)無乙醇蒸出為止，得濃縮液，定容至100ml.即為質(zhì)量濃度為1g/ml的醇提物供試品。制備好的提取液保存于4℃的冰箱中。

雞屎藤乙醇提取液制備方法同上。

1.4.2 烏蕨與雞屎藤水提取液的制備

稱取自然風(fēng)干磨碎的新鮮烏蕨地上部分100g，加入適量的蒸餾水，在80℃的水浴槽中旋轉(zhuǎn)水浴12h，抽濾，取濾液，再加入適量的蒸餾水，在80℃的水浴槽中旋轉(zhuǎn)水浴12h，抽濾，取兩次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器水浴槽于80℃減壓濃縮至30min無水蒸出為止，得濃縮液，定容至100ml.即為質(zhì)量濃度為1g/ml的水提物供試品。制備好的提取液保存于4℃的冰箱中。

雞屎藤水提取液制備同上。

取25ml制備好的烏蕨水提取液及25ml制備好的雞屎藤水提取液充分混合，得到烏蕨雞屎藤混合水提取液。

1.4.3 供試菌株的活化

從微生物實(shí)驗(yàn)室中取出菌種，接種到無菌斜面培養(yǎng)基中，細(xì)菌于恒溫培養(yǎng)箱中用37℃培養(yǎng)24h，霉菌于恒溫培養(yǎng)箱中用28℃培養(yǎng)48h后密封保存于4℃的冰箱中備用。

1.4.4 菌懸液的制備

冰箱中取出以活化的菌種，于無菌操作臺中用燒紅冷卻的接種環(huán)挑取少許已活化的菌種，置于裝有9ml無菌生理鹽水的試管中，充分混合，密封備用。

1.4.5 圓濾紙片的制備

用標(biāo)準(zhǔn)6.00mm打孔器打出濾紙片，置于干凈的試管中密封，于0.1MPa，121℃滅菌20min，備用。

1.4.6 提取液抑菌效果的測定

采用濾紙擴(kuò)散法[4]。用滅菌后的鑷子取出無菌濾紙片，于足量的提取液（質(zhì)量濃度1 g/mL）中浸泡15min，備用。選用直徑為9ml培養(yǎng)皿，經(jīng)過0.1MPa，121℃滅菌20min處理后，每皿加入10ml的培養(yǎng)基，待冷卻凝固后，用微量可調(diào)節(jié)移液槍于每培養(yǎng)皿中加入50ul的菌懸液，用滅菌的棉簽均勻涂開菌種。待平板干燥后，用滅菌后的鑷子夾出充分浸泡過提取液的濾紙片，輕輕貼于平板表面。每個平板放置3三片，每個菌種重復(fù)3個平板。以無菌蒸餾水作為對照組，細(xì)菌于恒溫培養(yǎng)箱中用37℃培養(yǎng)24h，霉菌于恒溫培養(yǎng)箱中用28℃培養(yǎng)48h。取出后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的大小，比較其抑菌效果。抑菌圈直徑大于8 mm為有明顯抑菌作用，小于6 mm為沒有抑菌作用，抑菌圈在6～8 mm之間為有一定的抑菌作用。

1.4.7 提取液最低抑菌濃度（MIC）的測定

采用稀釋法[4]。分別用無菌蒸餾水將各個提取液稀釋（V/V）成1、0.5、0.25、0.125g/ml等系列濃度。用微量可調(diào)節(jié)移液槍吸取各個濃度的提取液1ml，分別加入到無菌培養(yǎng)皿中，再傾入10ml培養(yǎng)基，充分搖勻。待冷卻凝固后，用微量可調(diào)節(jié)移液槍于每培養(yǎng)皿中加入50ul的菌懸液，用滅菌的棉簽均勻涂開菌種。待平板冷卻凝固后，用微量可調(diào)節(jié)移液槍于每培養(yǎng)皿中加入50ul的菌懸液，用滅菌的棉簽均勻涂開菌種。一個濃度梯度每個菌種重復(fù)3個平板，以無菌蒸餾水作為對照，細(xì)菌于恒溫培養(yǎng)箱中用37℃培養(yǎng)24h，霉菌于恒溫培養(yǎng)箱中用28℃培養(yǎng)48h。取出觀察各菌種生長情況，以沒有菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度（MIC）。提取液的最低抑菌濃度越低，表明其抑菌效果越明顯。

1.4.8 提取液熱穩(wěn)定性測定

采用濾紙擴(kuò)散法[4]。用滅菌后的鑷子取出無菌濾紙片，加入到足量的提取液（質(zhì)量濃度1 g/mL）中，分別置于40℃、60℃、80℃中水浴處理30min，選用直徑為9ml培養(yǎng)皿，于0.1MPa，121℃滅菌20min處理后，于每皿加入10ml的培養(yǎng)基，待冷卻凝固后，用微量可調(diào)節(jié)移液槍于每培養(yǎng)皿中加入50ul的菌懸液，用滅菌的棉簽均勻涂開菌種。待平板干燥后，用滅菌后的鑷子夾出充分浸泡過提取液的濾紙片，輕輕貼于平板表面。每個平板放置3三片，一種溫度處理每個菌種重復(fù)3個平板。細(xì)菌于恒溫培養(yǎng)箱中用37℃培養(yǎng)24h，霉菌于恒溫培養(yǎng)箱中用28℃培養(yǎng)48h。取出后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑大小，比較溫度對其抑菌效果的影響。

1.4.9 pH對抑菌效果的影響

酸堿調(diào)節(jié)溶液調(diào)節(jié)提取液的pH值，考慮原溶液的pH，將原溶液的pH值調(diào)節(jié)成pH=7，pH=9時，用1.4.6的方法進(jìn)行抑菌效果的測定，每種提取液的不同pH值按每菌種3個重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，對比pH值對其抑菌效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 濾紙片法測定抑菌效果

由表1可知，烏蕨的乙醇提取液對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌圈平均直徑分別為7.15、9.23、7.52mm；烏蕨水提取液對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌圈平均直徑分別為13.83、11.54、6.33mm；烏蕨雞屎藤混合水提取液對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌的抑菌圈平均直徑分別為8.09、8.12、8.09mm。同時以上3種提取液對黑曲霉菌和青霉菌均無出現(xiàn)抑菌圈。而雞屎藤的兩種提取液以及對照組對5種試驗(yàn)菌種都沒有出現(xiàn)抑菌圈。綜上所述可知烏蕨對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌有一定的抑菌作用，對黑曲霉菌和青霉菌沒有抑菌作用。雞屎藤的兩種提取物對五種試驗(yàn)菌種均沒有抑菌作用。烏蕨雞屎藤混合水提取液抑菌圈均比烏蕨水提取液的抑菌圈小，烏蕨雞屎藤混合水提取液對三種細(xì)菌的抑菌效果比烏蕨的水提取液抑菌效果還差，說明烏蕨和雞屎藤的抑菌作用沒有聯(lián)合提高疊加的效果。

表1 烏蕨和雞屎藤提取液抑菌效果（24h）

2.2 烏蕨乙醇提取物最低抑菌濃度（MIC）測定

2.2.1 烏蕨乙醇提取物最低抑菌濃度（MIC）測定

由表2可知烏蕨乙醇提取液對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑制作用，其最低抑菌濃度為0.25g/ ml，對枯草桿菌的抑菌作用相對較弱，對黑曲霉菌和青霉菌沒有抑菌作用。

表2 烏蕨乙醇提取液最低抑菌濃度（MIC）

2.2.2 烏蕨水提取物最低抑菌濃度（MIC）測定

由表3可知烏蕨水提取液對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌具有一定的抑菌效果，最低抑菌濃度為1g/ml。對黑曲霉菌和青霉菌沒有抑菌作用。

表3 烏蕨水提取液最低抑菌濃度（MIC）

2.3 烏蕨提取物熱穩(wěn)定性測定

2.3.1 烏蕨乙醇提取物熱穩(wěn)定性測定

由表4可知在室溫20℃至80℃，烏蕨乙醇提取物對3種細(xì)菌（綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌）的抑菌效果在20℃至60℃差異不明顯，在80℃時，抑菌活性有相對明顯的提高，且其抑菌效果在80℃以內(nèi)具有熱穩(wěn)定性。在不同溫度條件，烏蕨乙醇提取物對黑曲霉菌和青霉菌沒有抑菌效果。

表4 熱處理對烏蕨乙醇提取液抑菌效果的影響

2.3.2 烏蕨水提取物熱穩(wěn)定性測定

由表5可知在室溫20℃至80℃，對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果雖有變化，但其抑菌直徑仍然大于8mm，對枯草桿菌的抑菌效果受溫度的影響不大，說明烏蕨水提取物對細(xì)菌的抑菌作用在20℃至80℃范圍內(nèi)具有熱穩(wěn)定性。在不同溫度條件，烏蕨乙醇提取物對黑曲霉菌和青霉菌沒有抑菌效果。

表5 熱處理對烏蕨水提取液抑菌效果的影響

2.4 不同PH值環(huán)境對烏蕨提取物抑菌效果的影響

2.4.1 pH對烏蕨乙醇提取液的抑菌效果影響

由表6可知，pH環(huán)境對烏蕨乙醇提取物具有較大的影響，在pH值5.11至9的范圍內(nèi)，烏蕨乙醇提取物對3種細(xì)菌（綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌）的抑菌效果隨pH值的升高而減弱，pH=9時對金黃色葡萄球菌的無抑菌作用，具體原因有待研究。在不同pH值環(huán)境中，烏蕨乙醇提取物對黑曲霉菌和青霉菌沒有抑菌效果。

表6 pH對烏蕨乙醇提取液的抑菌效果影響

2.4.2 pH對烏蕨水提取液的抑菌效果影響

由表7可見，pH值對烏蕨水提取物抑菌效果有一定影響。在PH4.57至9之間，烏蕨水提取物對枯草桿菌的抑菌隨PH值增加而減弱。烏蕨水提取物在PH7至9之間，對金黃色葡萄球菌無抑菌作用效果；在PH為9時，對綠膿桿菌無抑菌效果。在不同PH值環(huán)境中，烏蕨水提取物對黑曲霉菌和青霉菌沒有抑菌效果。

表7 烏蕨水提取液的pH對抑菌效果影響

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明烏蕨的水提取物和乙醇提取物對于綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌具有一定的抑菌效果，尤其是對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果更為明顯；其抑菌效果隨著濃度的增加而增強(qiáng)，尤其是烏蕨的乙醇提取液對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度僅為0.25g/ml，抑菌效果較好。烏蕨的水提取物和乙醇提取物對青霉菌，黑曲霉菌無抑菌效果。烏蕨的水提取物對綠膿桿菌，金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為1g/ml，抑菌效果較好。烏蕨的水提取物和乙醇提取物的抑菌活性均有良好的熱穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明烏蕨的水提取物和乙醇提取物在偏酸性的環(huán)境下抑菌效果最佳，在中性至堿性環(huán)境中抑菌效果受抑制。這與報道基本吻合，烏蕨具有一定的保健效果[7-8]。雞屎藤的水提取物和乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、綠膿桿菌、青霉菌和黑曲霉均無抑菌效果。同時烏蕨與雞屎藤混合后其抑菌作用沒有相加效應(yīng)。

雞屎藤是筆者家鄉(xiāng)廣東省紫金縣人經(jīng)常使用的民間藥方，用于治療喉嚨發(fā)炎、感冒、消食消腫，在天氣炎熱時稀濃度作為解暑藥，筆者及家人也經(jīng)常使用，效果好。但，本實(shí)驗(yàn)沒發(fā)現(xiàn)雞屎藤的抑菌作用，這與《中草藥學(xué)》[10]中記載的具有抗菌作用效果不一，與民間作為常用藥效果不一[10]。雞屎藤的水提取物對金黃色葡萄球菌沒有明顯的抑菌作用，與陳偉明[11]等人試驗(yàn)結(jié)果不一，與陳忠[12]、龍正海[13]、張梅[14]等人結(jié)果相似，具體原因有待進(jìn)一步的研究。

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【責(zé)任編輯：吳躍新】

Study on Antimicrobial Activities of Extract from Leaves ofStenoloma Chusanum and Paederia Scandens

LIAO Jian-liang，SHAN Pei-xian
（Department of Life Science/Institute of Biotechnology，Huizhou University，Huizhou 516007，Guangdong China）

The antimicrobial activities of Stenoloma chusanum Ching and Paederia scandens extracts are studied in this paper by using filter paper diffusion process and dull dilution method.Cultures selected are Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，p.aeruginosa，Penicillium sp，and Aspergillus niger.The purpose is to study the possibility of Stenoloma chusanum Ching and Paederia scandens use to the field of food preservation.Results show that:the ethanol extract of Stenoloma chusanum Ching against Staphylococcus aureus，Pseudomonas aeruginosa，and Bacillus subtilis has a certain inhibitory effect，especial of Staphylococcus aureus，and no antimicrobial effects for two kinds of fungi.The minimum inhibitory concentration to Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis is 0.25g/ml.The water extract of Stenoloma chusanum Ching has antimicrobial effects for bacteria，and no antimicrobial effects for fungi.The inhibitory effect of Stenoloma chusanum Ching has thermal stability，but the antimicrobial activities PH tolerance range from 7 to 9，inhibitory effect of Stenoloma chusanum Ching weakens or completely loses.Paederia scandens ethanol extract and water extract have no inhibitory effect on the tested strains.And Stenoloma chusanum Ching and Paederia scandens in the case of water extracted antibacterial activity jointly improve the effect.

extract ofStenoloma chusanum；extract ofPaederia scandens；antimicrobial activities

Q949.95

A

1671-5934（2016）03-0009-05

2016-05-26

惠州學(xué)院生化與分子生物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目[惠院科發(fā)（2009）41號]；廣東省專業(yè)綜合改革試點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目（粵教高函[2013]-113號）

廖建良（1965-），男，教授，碩士，廣東紫金人，研究方向?yàn)橹参飳W(xué)。