苑志國，劉舒云，郝春香，黃靖香，張莉，眭翔，孟昊業(yè)，郭維民，王明杰，張雨，彭江，汪愛媛，盧世璧，郭全義

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脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相半月板支架的制備及其生物相容性的研究

苑志國*，劉舒云*，郝春香，黃靖香，張莉，眭翔，孟昊業(yè)，郭維民，王明杰，張雨，彭江，汪愛媛，盧世璧，郭全義

【摘要】

目的成功制備脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相半月板支架，并與半月板纖維軟骨細胞結合研究其生物相容性。

方法聯(lián)合利用濕法粉碎、差速離心等物理方法和胃蛋白酶等化學方法制備脫細胞半月板細胞外基質(zhì)，利用改良 Urist法制備脫鈣骨基質(zhì)，并利用灌注、冷凍干燥等方法分別制備脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架等三種不同的支架，并從組織學、分子生物學、生物力學等方面研究三種支架的異同；原代培養(yǎng)兔半月板纖維軟骨細胞，并將 P3代的纖維軟骨細胞分別種植在以上三種支架上，利用掃描電鏡、死/活細胞染色等觀察細胞生長情況，并分別在 3、7、14 d 時檢測纖維軟骨細胞的增殖情況以及分泌膠原和糖胺多糖的含量。

結果物理化學聯(lián)合法脫細胞可以去除半月板中絕大部分的細胞成分，并且很好地保留正常半月板細胞外基質(zhì)的膠原以及糖胺多糖成分；脫細胞半月板基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架三種支架均具有良好的孔隙率，合適的孔徑大小，掃描電鏡結果顯示纖維軟骨細胞可以很好地在支架上生長，死/活細胞染色結果顯示三種支架均可以維持良好的細胞活性，但是脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架具有更好的生物力學特性，脫細胞半月板基質(zhì)支架和脫鈣骨基質(zhì)/脫細胞半月板基質(zhì)雙相支架在促進纖維軟骨細胞增殖和維持細胞表型方面要比單純脫鈣骨基質(zhì)支架更優(yōu)。

結論脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架具有較好的生物力學特性，良好的生物相容性，可以促進纖維軟骨細胞增殖，同時也可以維持纖維軟骨細胞的表型，是一種可以應用于組織工程半月板再生的支架。

【關鍵詞】細胞外基質(zhì)；關節(jié)半月板；生物相容性；生物力學；脫鈣骨基質(zhì)

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術, 2016, 11(1):4-12

作者單位：100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科研究所，北京市再生醫(yī)學重點實驗室/全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷重點實驗室（苑志國、劉舒云、黃靖香、張莉、眭翔、孟昊業(yè)、郭維民、王明杰、張雨、彭江、汪愛媛、盧世璧、郭全義），麻醉科（郝春香）

*同為第一作者

半月板損傷是常見的膝關節(jié)運動損傷之一，而半月板一旦損傷后，難以自行修復，常規(guī)方法難以徹底治愈此類疾病，組織工程半月板再生技術是最有希望解決此類問題的方法之一[1]，然而在半月板組織工程方面依然面臨很多困難，其中之一就是支架材料的選擇[2]，本研究創(chuàng)新性的聯(lián)合利用脫細胞半月板細胞外基質(zhì)和脫鈣骨基質(zhì)天然材料制備脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相半月板支架，該支架既有利于半月板纖維軟骨細胞生長的微環(huán)境（脫細胞半月板基質(zhì)），也有起到支撐作用的骨架（脫鈣骨基質(zhì)），具有更好的生物力學特性。本實驗通過物理化學聯(lián)合法脫細胞制備脫細胞半月板細胞外基質(zhì)，聯(lián)合脫鈣骨基質(zhì)構建脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架，并對其理化性能和生物相容性進行研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料及試劑新鮮豬半月板、牛骨若干，250 ml 離心管為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；2.5%雙氧水、鹽酸、無水乙醇、甲苯胺藍染料、番紅 O染料、蘇木素染液、伊紅染液、苦味酸-天狼猩紅染料購自北京化學試劑有限公司；Hoechst33258 染料購自上海碧云天生物技術有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.2% II 型膠原酶、胃蛋白酶、0.25% 胰蛋白酶購自美國 Sigma 公司；Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA Assay Kit購自美國Invitrogen 公司；DNA 提取試劑盒購自 Tiangen公司；糖胺多糖（GAG）定量檢測試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；羥脯氨酸定量試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.1.2主要儀器RC-6+ 低溫高速離心機為德國Thermo 公司產(chǎn)品；冷凍干燥機為北京博醫(yī)康技術公司產(chǎn)品；BH-2 型倒置顯微鏡、IX 70 型熒光顯微鏡均為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；BB5060 型CO2培養(yǎng)箱為德國 Heraeus 公司產(chǎn)品；TCS SP8共聚焦顯微鏡為德國 Leica 公司產(chǎn)品；掃描電鏡為日本 Hitachi 公司產(chǎn)品；生物力學試驗機為美國Bose 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1脫細胞半月板細胞外基質(zhì)的制備將豬半月板組織剪成 1 mm × 1 mm × 1 mm 的薄片，酸性氧化電位水清洗 3 次，每次 5 min，雙氧水漂洗3 次，每次 30 min，然后無菌蒸餾水漂洗 3 次，每次 3 min，然后再用無菌 PBS 溶液漂洗 3 次，每次 5 min。用勻漿機在低溫條件下將剪碎后的半月板組織勻漿，制備半月板漿料，然后加入冰醋酸和胃蛋白酶，4 ℃ 過夜。低溫高速離心機梯度離心：2000 r/min，離心 10 min，去除沉淀；6000 r/min，離心 10 min，去除沉淀；10 000 r/min，30 min，收集沉淀。再次加入無菌蒸餾水，10 000 r/min 離心，收集沉淀，制備濃度大約為 4% 的脫細胞半月板基質(zhì)漿料，4 ℃ 保存，備用。

1.2.2改良 Urist 法制備脫鈣骨基質(zhì)取新鮮牛骨若干，無水乙醇脫水 2 h，乙醚脫脂 1 h，風干0.5 h，無菌蒸餾水沖洗 3 次，每次 5 min，0.5 mol/L鹽酸脫鈣，蒸餾水沖洗至 pH 為 7.0 左右，無水乙醇脫水 2 h，乙醚脫脂 1 h，通風干燥，4 ℃ 保存，備用。

1.2.3脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架的制備將制備好的脫細胞半月板細胞外基質(zhì)漿料放入模具中，冷凍干燥獲得脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架；脫鈣骨基質(zhì)冷凍干燥后制備脫鈣骨基質(zhì)支架；將制備好的 4% 的脫細胞半月板細胞外基質(zhì)漿料灌注到脫鈣骨基質(zhì)中，使脫鈣骨基質(zhì)的孔隙中充滿脫細胞半月板細胞外基質(zhì)漿料，然后冷凍干燥制備脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架。

1.2.4兔半月板纖維軟骨細胞的原代培養(yǎng)取3 ～ 4 周齡的新西蘭大白兔 2 只，麻醉，備皮，消毒鋪單，取膝關節(jié)縱行切口，暴露關節(jié)腔，游離半月板，切斷半月板前后角韌帶，無菌取出半月板組織，置入盛有 Hank′s 液的培養(yǎng)皿中，并在超凈臺中去除半月板外側部分，將半月板內(nèi)側部分置入無菌玻璃瓶中，用眼科剪將半月板組織剪成 1 mm × 1 mm × 1 mm 的薄片，再加入 0.2% II 型膠原酶，加入無菌磁珠后放在磁力攪拌器上，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中 40 ～ 60 min，至組織塊被完全消化，加入帶有血清的 DMEM 培養(yǎng)液終止消化，離心后將纖維軟骨細胞植入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，待生長至 90% 融合時傳代，取 P3代細胞備用。

1.2.5死/活細胞染色將 P3代的兔纖維軟骨細胞分別種植到三種支架上，每塊支架種植大約 8 × 106個細胞，構建細胞-支架復合體，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 3 d 后，取出，在避光條件下進行死/活細胞染色，觀察三種支架對細胞的毒性；無菌 PBS 溶液清洗 2 次，加入二乙酸熒光素（FDA）孵育 5 min，去除 FDA，PBS 清洗 2 次，碘化丙啶（PI）孵育5 min，去除 PI，PBS 清洗 2 次，然后進行共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.6掃描電鏡檢測單純支架掃描電鏡：干燥后噴金直接鏡檢。細胞-支架復合物掃描電鏡：2.5%戊二醛固定，梯度無水乙醇脫水，臨界點干燥后噴金鏡檢。

1.2.7生物力學檢測制備統(tǒng)一規(guī)格的樣品用于力學測試。壓縮試驗樣品長寬高為 5 mm × 5 mm × 5 mm，拉伸試驗樣品為 5 mm × 3 mm × 1 mm，樣品在試驗前用 PBS 浸潤，壓縮試驗時，最大壓縮20%，壓縮速率為 5 mm/min；拉伸試驗時，在拉伸之前預加載 0.5 N，拉伸速率也為 5 mm/min；利用生物力學機獲得力-位移曲線，然后利用 Origin 8.0 軟件求得應力-應變曲線，獲得樣品壓縮及拉伸彈性模量。

1.2.8組織學染色4% 多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，切片后染色，三種單純支架切片后分別進行甲苯胺藍染色、番紅 O 染色以及 I、II 型膠原免疫組化。細胞-支架復合物切片后行 Honchest 染色以及 I 型膠原免疫熒光檢測。

1.2.9DNA 定量分析對半月板脫細胞前后的DNA 含量進行測定，判斷脫細胞后 DNA 的殘留；并對三種單純支架以及不同時間點細胞-支架復合物的 DNA 含量進行測定，DNA 含量用以判斷纖維軟骨細胞的增殖情況，細胞 DNA 含量的計算為總 DNA（細胞支架中 DNA 含量）減去本底（單純支架 DNA 含量）。在進行 DNA 測量時利用 PicoGreen 熒光法進行，具體實驗步驟依據(jù)Quant-iTTMPicoGreen?dsDNA Reagent and Kits 說明進行。

1.2.10膠原含量測定羥脯氨酸在膠原蛋白中約占 13.4%，在彈性蛋白中極少，不存在其他蛋白中，因此羥脯氨酸的量能反映膠原的含量。將統(tǒng)一規(guī)格的三種單純支架、不同時間點的細胞-支架復合物及其培養(yǎng)液取材（每組 5 個樣本），采用羥脯氨酸法測定不同支架以及細胞-支架復合物的膠原含量，具體實驗步驟依據(jù)羥脯氨酸測試盒說明進行。纖維軟骨細胞分泌膠原含量用總含量（細胞支架復合物 + 培養(yǎng)液）減去本底（單純支架的含量）表示。

1.2.11糖胺多糖含量測定將統(tǒng)一規(guī)格的三種單純支架、不同時間點的細胞-支架復合物及其培養(yǎng)液取材（每組 5 個樣本），利用二甲基亞甲基藍（DMMB）比色法測定糖胺多糖的含量。實驗步驟依據(jù) GENEMD 糖胺多糖總含量二甲基亞甲基藍比色法定量檢測試劑盒說明進行。纖維軟骨細胞分泌糖胺多糖含量用總含量（細胞支架復合物 + 培養(yǎng)液）減去本底（單純支架的含量）表示。

1.3統(tǒng)計學處理

采用 SPSS15.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示。統(tǒng)計支架孔隙率、孔徑大小及吸水率時使用單因素方差分析，其余定量實驗結果均采用兩兩之間獨立 t 檢驗，P < 0.05 時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1物理、化學聯(lián)合法脫細胞前后的比較

脫細胞前后的 Hoechst 染色顯示，脫細胞前大量的細胞核存在（圖1A），脫細胞后細胞核基本消失（圖1B），DNA 定量分析也顯示脫細胞后DNA 的殘留量為痕量，DNA 殘留小于 100 pg/mg（圖2A）。脫細胞前后天狼猩紅染色均顯示有大量很強雙折光性呈黃色或紅色的 I 型膠原纖維，也有部分呈弱折光性的綠色細纖維（III 型膠原）和少量呈多種色彩疏松網(wǎng)狀分布的 II 型膠原（圖1C、D），同時膠原定量結果也顯示脫細胞前后膠原含量的差異無統(tǒng)計學差異（P > 0.05）（圖2B）。脫細胞前后甲苯胺藍染色均顯示有大量染色陽性（呈紫色）區(qū)域（圖1E、F、G、H），同時糖胺多糖定量分析結果也顯示脫細胞前后糖胺多糖含量的差異無統(tǒng)計學差異（P > 0.05）（圖2C）。

2.2脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架三種支架物化特性的比較

圖1　脫細胞前后染色比較(A ～ F 放大 100 倍；G、H 放大 400 倍）Figure 1　The comparison between the results before and after decellularization (A - F magnified 100 times; G, H magnified 400 times)

圖2　脫細胞前后定量分析[A：DNA 含量的比較；B：膠原含量的比較；C：糖胺多糖含量比較（**P < 0.01）]Figure 2　The quantitative analysis between the results before and after decellularization [A: DNA content; B: Collagen content; C: GAG content (**P < 0.01)]

表1　三種支架的孔隙率、孔徑大小及吸水率的比較Table 1　The comparision of the three different scaffolds for porosity, pore size and water absorption

圖3　三種支架掃描電鏡結果比較（A：脫細胞半月板基質(zhì)支架；B：脫鈣骨基質(zhì)支架；C：脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架）Figure 3　The SEM of three different scaffolds (A: DMECM scaffold; B: DBMS scaffold; C: DMECM/DBMS diphasic scaffold)

脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架這三種支架的孔隙率、孔徑大小和吸水率的具體參數(shù)見表1，三種支架的孔隙率均在 90%，孔徑大小均在 100 μm 以上（圖3），可以滿足細胞種植對支架孔隙率和孔徑大小的要求。三種支架 Hoechst 染色均為陰性（圖4A、B、C），DNA 定量為痕量，三種支架的 DNA 殘留均小于100 pg/mg（圖4M）；天狼猩紅染色結果顯示：脫鈣骨基質(zhì)支架多為呈強折光的紅色或者黃色的 I 型膠原，脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架及雙相支架除呈強折光的紅色或黃色的 I 型膠原外，還可見部分綠色細纖維（III 型膠原）及疏松狀纖維（II 型膠原）（圖4D、E、F），膠原定量分析結果顯示三種支架差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）（圖4N）。番紅O 染色及甲苯胺藍染色結果顯示：脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架及雙相支架均顯示有大量染色陽性區(qū)域（糖胺多糖）（圖4G、I、J、L），而脫鈣骨基質(zhì)支架染色為陰性（圖4H、K），同時糖胺多糖定量分析結果顯示脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架及雙相支架的糖胺多糖含量均高于脫鈣骨基質(zhì)支架（圖4O）。生物力學測試結果顯示雙相支架的壓縮彈性模量高于脫鈣骨基質(zhì)支架，并且遠遠高于脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架，同時拉伸彈性模量也高于脫鈣骨基質(zhì)支架，并且遠遠高于脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架（圖4P、Q）。

2.3半月板纖維軟骨細胞種植于三種不同支架上時其掃描電鏡、死/活細胞染色結果

圖4　三種支架物化特性比較[A、B、C：分別為三種支架的 Hoechst 染色；D、E、F：分別為三種支架的天狼猩紅染色；G、H、I：分別為三種支架的番紅 O 染色；J、K、L：分別為三種支架的甲苯胺藍染色；M、N、O：分別為三種支架的 DNA、膠原及糖胺多糖定量分析結果；P、Q：分別為三種支架的壓縮及拉伸彈性模量（DMECMS：脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架；DBMS：脫鈣骨基質(zhì)支架；DMECM/DBMS：脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架）]Figure 4　The comparison of physico-chemical propertys of the three different scaffolds [A, B and C are the Hoechst staining of the three scaffolds; D, E and F are the Sirius red staining of the three different scaffold; G, H and I are the safranine O staining of the three different scaffolds; J, K and L are Toluidine blue staining of the three different scaffolds; M, N and O are the quantitative analysis results of DNA, collagen and GAG content of the three different scaffolds; P and Q are the tensile and compressive properties and the measurement of the in plane elastic moduli of the three different scaffolds (DMECMS refers to decellularized meniscal extracellular matrix scaffold; DBMS refers to demineralized bone matrix scaffold; DMECM/DBMS refers to decellularized meniscal extracellular matrix/demineralized bone matrix diphasic scaffold)]

掃描電鏡結果（圖5A、B、C）顯示半月板纖維軟骨細胞均可在三種支架上良好生長，三種支架表面均可見纖維軟骨細胞，同時死/活細胞染色證實半月板纖維軟骨細胞均可以在三種支架上生長，活細胞染色可見大量綠色熒光亮點（圖5D、G、J），死細胞染色可見紅色熒光亮點較少（圖5E、H、K），可說明三種支架都對細胞毒性很?。ㄆ浠罴毎嚷示蛇_到 90% 以上），并且三種支架的活細胞比率之間差異無統(tǒng)計學意義（圖5M）。

2.4半月板纖維軟骨細胞種植于三種不同支架上其增殖及分泌膠原、糖胺多糖含量的比較

將 P3代的兔半月板纖維軟骨細胞種植于三種支架上，分別在 3、7、14 d 時測量纖維軟骨細胞的增殖及分泌膠原和糖胺多糖的含量。結果顯示：種植于脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架和雙相支架上的纖維軟骨細胞其增殖情況優(yōu)于脫鈣骨基質(zhì)支架上的（圖6A）。脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架和雙相支架上的纖維軟骨細胞在 7 和 14 d 時其分泌膠原的含量高于脫鈣骨基質(zhì)支架上纖維軟骨細胞分泌的（圖6B、C）；同樣脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架和雙相支架上的纖維軟骨細胞在 7 和14 d 時其分泌糖胺多糖（GAGs）的含量高于脫鈣骨基質(zhì)支架上纖維軟骨細胞分泌的（圖6D、E）。

圖5　兔半月板纖維軟骨細胞（P3）種植于三種不同支架上時掃描電鏡及細胞活性比較（A、B、C：3 d 時掃描電鏡結果；D、G、J：3 d 時活細胞染色；E、H、K：3 d 時死細胞染色；F、I、L：3 d 時疊加后的圖像；M：細胞存活率的定量分析結果）Figure 5　Comparison of SEM results and cell vitality when rabbit meniscus fibrochondrocytes (P3) are seeded in the three different scaffolds (A, B and C show the third day result of SEM since fibrochondrocytes was seeded in the three different scaffolds; D, G and J show live cell staining; E, H and K show dead cell staining; F, I and L are superposition images; M shows the quantitative analysis result of cell vitality)

圖6　兔半月板纖維軟骨細胞（P3）種植于三種不同支架上 3、7、14 d 時，其細胞增殖及分泌膠原、糖胺多糖含量（A：三種不同支架上的纖維軟骨細胞 DNA 含量的比較；B：三種不同支架上的纖維軟骨細胞分泌膠原含量的比較；C：三種支架上纖維軟骨細胞分泌膠原與 DNA 含量的比的比較；D：三種不同支架上的纖維軟骨細胞分泌糖胺多糖含量的比較；E：三種支架上纖維軟骨細胞分泌糖胺多糖與 DNA 含量的比的比較）Figure 6　The proliferation results and the collagen and GAGs express results of the rabbit meniscus fibrochondrocytes (P3) seeded in the three different scaffolds on the 3 rd,　th and 14 th day (A shows the DNA content after the fibrochondrocytes seeded in the three different scaffolds; B shows the collagen content secretion by the fibrochondrocytes seeded in the three different scaffolds; C is the ratio of collagen to DNA content; D is the GAG content secretion by the fibrochondrocytes seeded in the three different scaffolds; E is the ratio of GAG to DNA content)

3　討論

隨著全民運動的興起和車輛數(shù)量的不斷攀升，運動損傷和車禍等導致的膝關節(jié)半月板損傷的患者越來越多，然而，臨床上對于半月板損傷的治療方式相對有限，多采用緩解癥狀的姑息治療，難以徹底治愈，同時同種異體半月板移植又由于匹配困難、來源有限等問題難以在臨床廣泛應用[3]。隨著再生醫(yī)學的發(fā)展，組織工程半月板技術給半月板損傷帶來了新的希望[4]，然而組織工程半月板支架材料的選擇依然是困擾半月板再生的難題之一。本研究創(chuàng)新性地利用脫鈣骨基質(zhì)和脫細胞半月板細胞外基質(zhì)兩種天然材料聯(lián)合作為組織工程半月板的支架材料，半月板細胞外基質(zhì)可以調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化[5-6]，是半月板纖維軟骨細胞天然的微環(huán)境[7-8]，在支持、連接細胞的同時參與和維持半月板纖維軟骨細胞以及半月板組織的各項生理功能[9-10]，而脫鈣骨基質(zhì)具有天然的三維孔隙結構和較好的生物力學特性[11]，聯(lián)合利用這兩種天然材料，使半月板支架既具有半月板纖維軟骨細胞天然的微環(huán)境，又有較好的生物力學特性，因此，脫鈣骨基質(zhì)/脫細胞半月板基質(zhì)可能是一種良好的組織工程半月板支架。

本實驗采用物理化學聯(lián)合法脫細胞，制備脫細胞半月板細胞外基質(zhì)，可以較徹底地去除 DNA 物質(zhì)，并且可以很好地保留半月板天然的細胞外基質(zhì)成分。Honchest 染色顯示脫細胞后 DNA 物質(zhì)清除較為徹底，同時 DNA 定量分析結果也顯示脫細胞后 DNA 殘留小于100 pg/mg。甲苯胺藍染色、番紅 O 染色以及天狼猩紅染色均顯示脫細胞半月板細胞外基質(zhì)與天然半月板具有相似的膠原以及糖胺多糖成分，同時膠原以及糖胺多糖定量分析結果也顯示脫細胞前后膠原以及糖胺多糖差異無統(tǒng)計學意義。

利用脫鈣骨基質(zhì)以及脫細胞半月板基質(zhì)制備的脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架、脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架，這三種支架均具有良好的孔隙率、孔徑大小以及很好的生物相容性。三種支架的組織學以及膠原和糖胺多糖的定量分析結果顯示脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架和雙相支架糖胺多糖含量更多，而三種支架的膠原含量差異無統(tǒng)計學意義，掃描電鏡以及死/活細胞染色結果顯示三種支架均具有良好的生物相容性。生物力學測試結果顯示，雙相支架具有更好的生物力學特性。而從種植于三種支架上的半月板纖維軟骨細胞在 3、7、14 d 結果顯示，雙相支架以及脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架可以更好地促進纖維軟骨細胞增殖以及分泌膠原和糖胺多糖。

因此，相對于單純脫鈣骨基質(zhì)支架以及脫細胞半月板細胞外基質(zhì)支架，脫細胞半月板細胞外基質(zhì)/脫鈣骨基質(zhì)雙相支架具有更好的生物力學特性以及可以更好地促進纖維軟骨細胞增殖以及分泌膠原和糖胺多糖，是一種良好的組織工程半月板的支架。

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Author Affiliation: Institute of Orthopaedics (YUAN Zhi-guo, LIU Shu-yun, HUANG Jing-xiang, ZHANG Li, SUI Xiang, MENG Hao-ye, GUO Wei-min, WANG Ming-jie, ZHANG Yu, PENG Jiang, WANG Ai-yuan, LU Shi-bi, GUO Quan-yi); Department of Anesthesia (HAO Chun-xiang), Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(1):4-12

·論著·

Preparation and biocompatibility research on the decellularized meniscal extracellular matrix/demineralized bone matrix diphasic meniscal scaffold

YUAN Zhi-guo, LIU Shu-yun, HAO Chun-xiang, HUANG Jing-xiang, ZHANG Li, SUI Xiang, MENG Hao-ye, GUO Wei-min, WANG Ming-jie, ZHANG Yu, PENG Jiang, WANG Ai-yuan, LU Shi-bi, GUO Quan-yi

【Abstract】

ObjectiveTo manufacture a decellularized meniscal extracellular matrix/demineralized bone matrix diphasic meniscal scaffold and then integrate it with fibrochondrocytes to investigate the biocompatibility of the materials.

MethodsThe decellularized meniscal extracellular matrix was prepared by physical methods such as the waterproof pulverization and differential centrifugation, as well as some chemical approaches like the pepsin digestion. The demineralized bone matrix was prepareded by the improved Urist method. We utilized infusing and lyophilization methods to construct the decellularized meniscal extracellular matrix scaffold (DMECMS), demineralized bone matrix scaffold (DBMS), and decellularized meniscal extracellular matrix/demineralized bone matrix diphasic scaffold (DMECMS/DBMS), respectively, and then examined the histology, molecular biology, and biomechanical characters of the three different scaffolds. The rabbit meniscus fibrochondrocytes of passage 3 were seeded in the three different scaffolds, and then evaluated the biocompatibility by scanning electron microscopy (SEM) and Live/Dead staining. The collagen and GAGs secreted by fibrochondrocytes on the three scaffolds were detected on the 3rd, 7th, and 14th day.

ResultsThe physico-chemical decellularization method eliminated most of the cellular elements, and preserved the collagen and GAGs components of the meniscal extracellular matrix. The DMECMS, DBMS and DMECMS/DBMS had appropriate porosity and pore size. The SEM and Live/Dead staining results showed that the fibrochondrocytes could grow in the three different scaffolds and maintain good viability. However, the DMECMS/DBMS had the best biomechanics property, and the DMECMS and the DMECMS/DBMS promoted the fibrochondrocytes proliferation and collagen and GAGs secretion.

ConclusionThe DMECMS/DBMS has good biomechanics property and biocompatibility, and can promote fibrochondrocytes proliferation and collagen and GAGs secretion. In conclusion, it is a good scaffold for meniscal tissue engineering.

【Key words】Extracellular matrix;Semilunar cartilages;Biocompatibile;Biomechanics;Demineralized bone matrix

Corresponding Author:GUO Quan-yi, Email: doctorguo@163.com

收稿日期：2015-09-15

通信作者：郭全義，Email：doctorguo@163.com

基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃（863 計劃）（2012AA020502、2015AA020303）；國家自然科學基金重點項目（21134004）；國家自然科學基金面上項目（81472092）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.003