陳成娟，王偉

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生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在蛋白酶活性檢測(cè)中的應(yīng)用

陳成娟，王偉

作者單位：100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）是 20 世紀(jì)中葉在海洋生物，例如維多利亞水母和軟體珊瑚蟲海腎中發(fā)現(xiàn)的一種自然現(xiàn)象[1]，能量從生物發(fā)光蛋白如熒光素酶（供體）轉(zhuǎn)移到熒光物質(zhì)（受體）。在軟體珊瑚蟲海腎中海腎熒光素酶將腔腸素氧化，發(fā)出波長(zhǎng)為 480 nm 的光，與近距離的海腎綠色熒光蛋白之間發(fā)生一個(gè)非輻射的能量轉(zhuǎn)移，發(fā)出 509 nm的光[1-3]。實(shí)際上，共振能量轉(zhuǎn)移理論早在 1948 年就已經(jīng)被 F?rster 提出并被稱為共振能量轉(zhuǎn)移（F?rster resonance energy transfer，F(xiàn)RET）[4]。根據(jù)供體不同，共振能量轉(zhuǎn)移分為以熒光物質(zhì)如熒光蛋白[5]、有機(jī)分子[6-7]、納米無(wú)機(jī)熒光材料等為供體的 FRET 以及熒光素酶或者發(fā)光蛋白為供體的 BRET[8]。共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)，供體發(fā)出的部分光轉(zhuǎn)移到受體熒光蛋白，受體發(fā)出波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光。共振能量轉(zhuǎn)移只有在受體分子的吸收光譜與供體分子的發(fā)射光譜有效重疊后才能發(fā)生。其發(fā)生取決于供體分子與受體分子的距離（一般在 1 ～ 10 nm）和兩者的相對(duì)方向[9-10]。BRET 首次報(bào)道是用于檢測(cè)細(xì)菌節(jié)律鐘蛋白 KaiB 相互作用[8]，隨后被廣泛用于研究蛋白-蛋白相互作用（多數(shù)是蛋白偶聯(lián)受體的二聚化和寡聚化的相關(guān)研究）[11-13]以及活體成像[14-16]等，同時(shí) BRET 在蛋白酶檢測(cè)及藥物篩選中也發(fā)揮了巨大的作用[17]。

1　BRET 體系的特點(diǎn)

BRET 不需外源光激發(fā)，其背景極低，靈敏度高。與FRET 相比，BRET 能量供體為催化腔腸素發(fā)射熒光的熒光素酶，不需要外源光源激發(fā)熒光供體，更利于能量的定量轉(zhuǎn)移，并且避免了 FRET 中強(qiáng)光源激發(fā)引起的很多副反應(yīng)[18]，如光漂白[9]，直接激發(fā)受體，激發(fā)環(huán)境中的發(fā)光物質(zhì)，損傷組織，光源光強(qiáng)被組織吸收而弱化等；同時(shí) BRET 的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以分別對(duì)能量供體和受體進(jìn)行定量[19]。BRET分析技術(shù)應(yīng)用于生物體內(nèi)生理活動(dòng)的分析時(shí)不會(huì)對(duì)細(xì)胞組織造成有害影響，且可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，信號(hào)產(chǎn)生迅速，適合于高通量的篩選實(shí)驗(yàn)[20]。因此，在一些需要低背景和高靈敏的實(shí)驗(yàn)中，BRET 顯示出巨大優(yōu)勢(shì)，在相關(guān)研究中發(fā)揮了重要的作用，解決了一些重要的分析問(wèn)題，展現(xiàn)出良好的發(fā)展前景[21]。

2　BRET 體系中的能量供受體對(duì)及 BRET 衍生的技術(shù)

BRET 體系的供體是熒光素酶或發(fā)光蛋白，受體有熒光蛋白[22]、無(wú)機(jī)納米材料及有機(jī)染料[23]。近年來(lái)，隨著新型熒光素酶和熒光物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和研究，越來(lái)越多的熒光素酶和熒光材料被用于 BRET 體系。

海腎熒光素酶（renilla luciferase，Rluc）是經(jīng)典的 BRET供體，以腔腸素（coelenterazine，CLZ）為底物，發(fā)射峰在480 nm 處的藍(lán)色-綠色可見光范圍。Rluc 是分子量為 36 kD的單體蛋白，其 N-端、C-端均暴露在外，易于標(biāo)記。近年來(lái)，腔腸素的多種衍生物被開發(fā)出來(lái)。其中腔腸素 400a，又稱深藍(lán) C，經(jīng) Rluc 催化發(fā)射出主峰在 395 nm 的光。不同的 CLZ 衍生物底物最大發(fā)射波長(zhǎng)不同，在高通量篩選實(shí)驗(yàn)中有著不同的特點(diǎn)。這使得 Rluc 在 BRET 技術(shù)中得到非常靈活的應(yīng)用，能適應(yīng)不同吸收波長(zhǎng)的受體。

最早發(fā)展的 BRET 是以 Rluc 為供體，CLZ 為底物，增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（enhanced yellow fluorescent protein，EYFP）為受體，可觀察到兩個(gè)最大發(fā)射峰，分別在 480 nm 和 527 nm，這種 BRET 體系被稱為BRET1[22]。近年來(lái)開發(fā)的一些 YFP 突變體，如 YFP venus 也被應(yīng)用到 BRET體系，取得了較好的結(jié)果[24]。

BRET2相比 BRET1最大的優(yōu)勢(shì)就是它的峰分辨率更高，更加靈敏。由于 Rluc 的發(fā)射峰與 YFP 的發(fā)射峰較為接近，重疊較嚴(yán)重，從而影響了實(shí)驗(yàn)的靈敏度，為此開發(fā)的BRET2體系彌補(bǔ)了這個(gè)缺點(diǎn)[25]。野生型 GFP 的突變體EGFP（F64L）最大吸收峰在 400 nm 左右，發(fā)射峰在 510 nm處。因此，Rluc 與 EGFP 構(gòu)成的 BRET2體系，以 CLZ 400a 為底物時(shí)，發(fā)射出 395 nm和 510 nm 的特征峰，光譜分辨率大大提高，信噪比相應(yīng)地得到提高。然而，CLZ400a發(fā)光很弱，比 CLZ 低 100 多倍。因此盡管 BRET2更加靈敏，但信號(hào)強(qiáng)度很弱，在很多實(shí)際應(yīng)用中受到限制。美國(guó)斯坦福大學(xué)的 Gambhir 研究組將 CLZ400a 的類似物引入到 BRET2體系中使 BRET2載體被檢測(cè)的時(shí)間延長(zhǎng)到6 h[26]，且將 BRET2中的 Rluc 供體替換成其突變體 RLuc8 （RlucA55T/C124A/S130A/K136R/A143M/M185V/M253L/S 287L），使 BRET2體系檢測(cè)靈敏度得到顯著改善[27]。RLuc8發(fā)光強(qiáng)度是 Rluc 的 4 倍，能使 BRET 體系的信號(hào)增強(qiáng)大約 5 倍[28]，使用 RLuc8 作為 BRET 供體，EYFP 作為受體的 BRET1體系光輸出增強(qiáng) 25 倍[29]。

盡管現(xiàn)有的 BRET1和 BRET2系統(tǒng)進(jìn)行了如上所述的改進(jìn)，但由于活體組織對(duì)在 600 nm 以下的發(fā)射光有強(qiáng)吸收，當(dāng)應(yīng)用于活體組織時(shí)仍然存在很強(qiáng)的光子衰減現(xiàn)象，這就導(dǎo)致該系統(tǒng)缺乏靈敏度和光譜分辨率低[30]。為滿足小動(dòng)物活體成像的需求，BRET 的發(fā)展趨勢(shì)是選擇合適的供受體，使 BRET 體系發(fā)射 600 nm 以上的紅光或遠(yuǎn)紅光。Gambhir 團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上開發(fā)了一系列新的 BRET 系統(tǒng)，即紅移的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，已成功應(yīng)用于活體動(dòng)物蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的成像[31]。根據(jù)供體與受體以及所選用底物的差異分為 BRET3、BRET3.1、BRET4.1、BRET5、BRET6、BRET6.1等 6 類，供體是 Rluc 的突變體（RLuc8 或 RLuc8.6），受體是紅色熒光蛋白的突變體（mOrange、TagRFP、TurboFP635），底物為 CLZ 或其合成的衍生物（CLZ-v）。當(dāng)供體與受體不同時(shí)，其激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的峰值也不相同。研究結(jié)果表明，其中 BRET3和 BRET6.1的能量轉(zhuǎn)移效率相對(duì)較高。BRET3中 RLuc8 作為 BRET供體，紅色熒光蛋白（DsRed2）的突變體 mOrange 作為BRET 的受體，用 CLZ 或 CLZ 的類似物 Enduren 作為底物。RLuc8-mOrange 的結(jié)合導(dǎo)致受體的發(fā)射處于橙色光譜區(qū)域（564 nm），同時(shí)在光強(qiáng)度方面也提高了數(shù)倍，具有較高的時(shí)間和空間分辨率，通過(guò)與光譜成像結(jié)合，在活的單細(xì)胞以及小動(dòng)物模型的淺表和深部的組織結(jié)構(gòu)中都能夠?qū)RET 信號(hào)進(jìn)行成像。BRET6和 BRET6.1系統(tǒng)都是使用突變體 RLuc8.6 作為 BRET 供體，TurboFP635 作為受體，兩者分別催化底物 CLZ 和 CLZ-v 而產(chǎn)生相同的紅光（635 nm）。由于該融合蛋白優(yōu)良的光譜分辨率和紅移的發(fā)射波長(zhǎng)，因此無(wú)論在活的單細(xì)胞還是小動(dòng)物模型的淺表甚至是深部的組織結(jié)構(gòu)成像等方面都是有發(fā)展?jié)摿Φ?BRET 系統(tǒng)。人們可以根據(jù) BRET 方法各自的優(yōu)缺點(diǎn)選擇合適的BRET。

3　BRET 在蛋白酶活性檢測(cè)中的應(yīng)用

蛋白酶是生物體內(nèi)一類重要的大分子，其功能的正常發(fā)揮維持著生命體正常的生理活動(dòng)。許多病毒蛋白酶、細(xì)菌毒素等活性的發(fā)揮對(duì)正常的機(jī)體造成傷害，是重要的藥物靶標(biāo)[32-35]。因此，分析監(jiān)測(cè)蛋白酶活性，對(duì)于探究生命體生理活動(dòng)機(jī)制和研發(fā)相關(guān)蛋白酶抑制劑等研究具有重要指導(dǎo)意義。BRET 嚴(yán)格依賴距離的特性為構(gòu)建蛋白酶?jìng)鞲衅魈峁┝死碚摰目尚行?。Helen Dacres 研究組在 2008 年研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)用 BRET2實(shí)時(shí)檢測(cè)凝血酶濃度靈敏性比運(yùn)用 FRET 高50 倍，這也直接說(shuō)明 BRET2比 FRET 更適合用來(lái)檢測(cè)蛋白酶活性[36]。典型的設(shè)計(jì)（圖1）是在供受體間連接一段易被蛋白酶特異切割的短肽，保持供受體距離足夠近而發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，活性蛋白酶特異地識(shí)別并剪切 BRET 融合體系的連接肽，供受體不再受約束而彼此分開，BRET 作用減弱或消失。通過(guò)觀察 BRET 能量轉(zhuǎn)移的變化就能測(cè)定活性蛋白酶的活性和表達(dá)量。下面以實(shí)驗(yàn)所運(yùn)用 BRET 技術(shù)為分類標(biāo)準(zhǔn)綜述該技術(shù)在蛋白酶檢測(cè)中的應(yīng)用（表1）。

圖1　BRET 蛋白酶?jìng)鞲衅鞯湫驮O(shè)計(jì)示意圖[37]

3.1CRET（Chemiluminescence resonance energy transfer）Waud 等[38]首次將 BRET 用于蛋白酶的活性檢測(cè)，將水母素作為能量的供體，GFP 或 EGFP 作為能量的受體，在酶學(xué)水平檢測(cè)了 α-凝血酶的活性，在細(xì)胞水平檢測(cè)了半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的活性。該文中能量供體選用水母素而非 BRET 系統(tǒng)中常用的海腎熒光素酶，并將此BRET 系統(tǒng)命名為 CRET。

表1　BRET 在蛋白酶活性檢測(cè)中的應(yīng)用

3.2BRET1

Dacres 研究組分別構(gòu)建了凝血酶和 caspase-3 的BRETl（Rluc/YFP）和 BRET2（Rluc/GFP2）傳感器，體外檢測(cè)了凝血酶和 caspase-3。對(duì)于凝血酶的檢測(cè)限達(dá)到了pmol/L 級(jí)，方法簡(jiǎn)單且靈敏度高[39]。通過(guò)同種蛋白酶的兩種 BRET 傳感器的檢測(cè)結(jié)果比較，BRET2的靈敏度是BRET1體系的 2.9 倍，檢測(cè)限低 2.5 倍。證實(shí)了 BRET2體系比 BRETl更加靈敏，這也正是 BRET2應(yīng)用更為廣泛的原因。

3.3BRET2

Hu 等[40]應(yīng)用密碼子人源化的 Rluc（hRluc）和 GFP2（hGFP2）構(gòu)建的 BRET2體系檢測(cè) HIV-1 蛋白酶活性及其抑制劑的生物活性。構(gòu)建原理是在 hRluc 和 hGFP2中間插入含有蛋白酶特異切割位點(diǎn)的肽段 p2/p7。在含有 HIV-1蛋白酶基因及缺失該基因的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)這種融合蛋白時(shí)，含有 HIV-1 蛋白酶基因的細(xì)胞中 BRET2信號(hào)降低，而缺失該基因的細(xì)胞中 BRET 信號(hào)保持穩(wěn)定。向含有 HIV-1 蛋白酶基因的細(xì)胞加入 HIV-1 蛋白酶抑制劑 saquinavir 或amprenavir，或者改變蛋白酶切割位點(diǎn)序列都能抑制蛋白酶的活性而使 BRET 現(xiàn)象保持穩(wěn)定。這種蛋白酶 BRET2生物傳感器測(cè)定法可適于高通量篩選新的 HIV-1 蛋白酶抑制劑，同時(shí)它也可用于篩選針對(duì)其他病毒蛋白酶的抗病毒化合物。

Oka 等[37]應(yīng)用 BRET2系統(tǒng)在細(xì)胞水平檢測(cè)貓杯狀病毒（feline calicivirus，F(xiàn)CV）蛋白酶活性。該病毒常被用作不可培養(yǎng)的杯狀病毒的研究模型。實(shí)驗(yàn)中熒光強(qiáng)度隨病毒的滴度而變化，該方法可以作為篩選 FCV 蛋白酶抑制劑的模型。

2012 年，Dacres 等[41]改進(jìn)了凝血酶 BRET2傳感器，使用 Rluc 的兩個(gè)突變體 Rluc-2 和 Rluc-8 作為 BRET2的供體，構(gòu)建了新的凝血酶 BRET2（Rluc2/GFP2和RLuc8/GFP2）傳感器，進(jìn)一步提高了凝血酶檢測(cè)的限度。

3.4QD/BRET 系統(tǒng)

量子點(diǎn)（quantum dot，QD）是近年來(lái)研究很熱的新型納米熒光材料，直徑在 1 ～ 100 nm，具有量子產(chǎn)率高，穩(wěn)定性好，吸收光譜寬，Stokes 位移大，發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物分析領(lǐng)域[51-55]，在作為BRET 受體方面也有研究報(bào)道。Rao 研究組 2006 年利用 RLuc8 與表面帶有活性羧基基團(tuán)的 QD655 通過(guò)氨基-羧基形成酯鍵共價(jià)偶聯(lián)，構(gòu)建了一種發(fā)射光紅移的 BRET 探針，具有光譜分辨率高，發(fā)射紅色光的優(yōu)點(diǎn)，成功進(jìn)行了較深組織和活體的示蹤[56-57]。使用紫外或藍(lán)色光區(qū)的激發(fā)光就能激發(fā) QDs，發(fā)射光遍及藍(lán)色到紅色光區(qū)。因此，QD 作為 BRET 受體具有巨大的應(yīng)用潛力。QD 作為受體最大的限制因素是它不能與 Rluc 等熒光素酶在基因水平上進(jìn)行偶聯(lián)，在體內(nèi)應(yīng)用方面很受限制。2007 年 Rao 研究組報(bào)道了 RLuc8/QD 體系應(yīng)用于基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的分析[42]。RLuc8 的一端融合了一段帶有 MMP-2特異識(shí)別序列 GGPLGVRG 的 6xHis 標(biāo)簽，表面帶有羧基的 QD655（發(fā)射光為 655 nm）能通過(guò) Ni2+與 RLuc8 蛋白分子偶聯(lián)。用一定濃度的 MMP-2 處理帶有該標(biāo)簽的RLuc8 時(shí)，連接肽被切割，RLuc8 分子與 His 標(biāo)簽分離，與 His 標(biāo)簽結(jié)合的 QD655 無(wú)法靠近 RLuc8，不能發(fā)生BRET 作用；而未經(jīng) MMP-2 處理，帶有 His 標(biāo)簽的RLuc8 在 Ni2+的作用下與 QD 偶聯(lián)，發(fā)生 BRET 作用。通過(guò) BRET 比值的計(jì)算就能測(cè)得 MMP-2 的濃度。由于該工作是在蛋白酶活反應(yīng)之后再與受體 QD655 通過(guò)His-Ni2+-COOH 之間的配位鍵連接，結(jié)合力不夠強(qiáng)，背景較高。此后，2008 年他們?cè)俅胃倪M(jìn)了該體系，使用內(nèi)含肽來(lái)共價(jià)連接 Rluc 與 QD[43-44]。未反應(yīng)的 Rluc 能夠很容易地從體系中除去，降低了背景。這種 Rluc/QD 體系不僅檢測(cè)了緩沖液中的蛋白酶 MMP-2，還成功檢測(cè)了小鼠血清中的 MMP-2。通過(guò)使用不同發(fā)射光的 QD 還可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多種蛋白酶。例如，選擇 QD655 和QD705 分別構(gòu)建Rluc/QD 體系，每種體系含有一種蛋白酶特異的酶切位點(diǎn)。可使用包含兩種蛋白酶特異識(shí)別位點(diǎn)的 BRET 體系混合物，同時(shí)檢測(cè)了兩種蛋白酶。這個(gè)方法對(duì)于 BRET 體系在多重檢測(cè)中的應(yīng)用做了嘗試。2010 年他們利用納米金顆粒（gold nanoparticle，AuNPs）能夠淬滅熒光分子的這一熒光性質(zhì)，設(shè)計(jì)了一種新型的 MMP-2 檢測(cè)傳感器 RLuc8/Au NPs體系[45]。中科院張先恩研究組利用富勒烯的兩個(gè)衍生物與人源化的 Gaussia 熒光素酶（hGluc）偶聯(lián)，用于分析α-凝血酶的活性，檢測(cè)限達(dá)到 14 pmol/L[46]。

Chen 等[47]構(gòu)建了一種新的 pRluc/AuNPs 凝血酶無(wú)創(chuàng)檢測(cè)傳感器，并在添加尿液的溶液中檢測(cè)了凝血酶，傳感器檢測(cè)凝血酶的響應(yīng)時(shí)間為 10 min 左右，檢測(cè)限為 80 pmol/L。

3.5溶液環(huán)境改進(jìn)的 BRET 系統(tǒng)

由于 BBRT 中供體、基底及受體的敏感性，BRET 效率對(duì)溶液環(huán)境極其敏感。但目前關(guān)于溶液的各種組分是如何影響 BRET 的效率，又是如何影響檢測(cè)蛋白酶的活性分析，一直以來(lái)都沒有系統(tǒng)的研究報(bào)道。Li 等[48]利用 hGluc 作為供體，EYFP 作為受體，系統(tǒng)研究了溶液環(huán)境對(duì) BRET 效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶液環(huán)境包括緩沖溶液的組成、pH、二價(jià)離子等均能顯著影響 BRET 的效率。基于以上結(jié)果，他們優(yōu)化得到一種靈敏高、低成本的基于 BRET 技術(shù)的蛋白酶檢測(cè)新體系，能使 BRET 效率提高到最好，從而極大地提高了 BRET 傳感器檢測(cè)腸激酶的性能，能將蛋白酶的檢測(cè)靈敏度提高 10 倍及檢出限提高 7 倍。這個(gè)系統(tǒng)能用于提高其他 BRET 傳感器對(duì)蛋白酶檢測(cè)的性能，特別是對(duì)于一些活性受環(huán)境影響較大的蛋白酶。Li 等[49]還構(gòu)建了一種新的hGluc-tdTomat BRRT 系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有非常好的光譜分辨率，△λ 達(dá) 110 nm，在體外純緩沖液中檢測(cè)腸激酶的檢測(cè)限為 2.1 pmol/L，含有 3% 血清的溶液中檢測(cè)限為 3.3 pmol/L。

2014 年，Wu 等[50]將 BRET2凝血酶?jìng)鞲衅髟俅芜M(jìn)行改進(jìn)，與微流檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)合代替?zhèn)鹘y(tǒng)的靜態(tài)微孔檢測(cè)。新的傳感系統(tǒng)稱作 BRETH（經(jīng)典的 BRET2系統(tǒng)，CLZ 做底物）生物探針，并對(duì)該 BRETH生物探針 BRET 比率的影響因素即檢測(cè)的位置、流速、探針的濃度進(jìn)行了定量分析。該BRETH凝血酶生物探針最低檢測(cè)限是 27 pmol/L，而靜態(tài)的微孔檢測(cè)最低檢測(cè)限為 310 pmol/L。

利用 BRET 技術(shù)分析蛋白酶的活性可用于蛋白酶活性抑制劑和蛋白酶靶標(biāo)的篩選，由于很多與疾病相關(guān)的生理過(guò)程均有蛋白酶的參與，因此蛋白酶抑制劑的開發(fā)是疾病控制與治療的重要發(fā)展方向。結(jié)合上述報(bào)道的應(yīng)用實(shí)例，利用BRET2體系分析 HIV-1 蛋白酶的活性，通過(guò)觀察活性物質(zhì)作用下酶活的變化引起的 BRET 信號(hào)變化，能夠確定其是否具有 HIV-1 蛋白酶的抑制活性。通過(guò)這種方法，鑒定了已報(bào)道的兩種抑制劑，證實(shí)了一種新的抑制劑。此外，Rluc/QD 體系在檢測(cè)蛋白酶 MMP-2 的良好表現(xiàn)使其具有進(jìn)一步篩選 MMP-2 抑制劑的巨大潛力。

4　BRET 技術(shù)的展望

基于生物發(fā)光的 BRET 技術(shù)己經(jīng)被證明是一種有效的、多功能的生物分析工具，適用于研究蛋白-蛋白相互作用、細(xì)胞及活體影像、蛋白酶活性監(jiān)測(cè)、藥物篩選等眾多領(lǐng)域。在研究機(jī)體重要生理過(guò)程，揭秘生命體重要生理事件，闡明其分子機(jī)制，開發(fā)藥物等應(yīng)用中，BRET 技術(shù)作為一種重要的分析工具，發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用，為生物醫(yī)學(xué)的進(jìn)步做出了巨大貢獻(xiàn)。BRET 技術(shù)針對(duì)醫(yī)學(xué)、制藥和環(huán)境的目標(biāo)分析物進(jìn)行的超靈敏檢測(cè)和高通量篩選，順應(yīng)了現(xiàn)代科學(xué)對(duì)分析技術(shù)的發(fā)展和要求。

盡管 BRET 有著背景極低，靈敏度高等顯著的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)有的 BRET 技術(shù)同樣也存在一些缺陷。應(yīng)用最廣泛的BRET 體系所依賴的熒光素酶 Rluc 其量子產(chǎn)率較低，約束了進(jìn)一步發(fā)展高效、高靈敏的 BRET 體系。此外，應(yīng)用較多的 BRET 體系其發(fā)射光位于 600 nm 以下的藍(lán)色到橙色光區(qū)，不利于進(jìn)行細(xì)胞及活體研究。新型的 BRET 體系應(yīng)該具備發(fā)光強(qiáng)度高，酶活穩(wěn)定性高，發(fā)光穩(wěn)定的供體，譜分辨率較高。為適應(yīng)體內(nèi)研究，新型 BRET 體系應(yīng)具備 600 nm以上的紅色發(fā)射光，可基因水平操作。

隨著科學(xué)的日新月異，大量新型熒光素酶和熒光物質(zhì)得到了開發(fā)和應(yīng)用，這些都成為未來(lái) BRET 技術(shù)發(fā)展的技術(shù)儲(chǔ)備。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，分析技術(shù)的不斷完善，BRET 技術(shù)也將不斷得到完善和發(fā)展，必將在科學(xué)研究的廣闊領(lǐng)域里發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

參考文獻(xiàn)

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·綜述·

收稿日期：2015-11-17

通信作者：王偉，Email：wwang@imm.ac.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（30772677、81072562）；“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301002）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.010