向玉勇，殷培峰

（滁州學(xué)院，安徽 滁州 239000）

生物化學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)
——石蒜總生物堿的提取及抑菌活性的教學(xué)設(shè)計(jì)

向玉勇，殷培峰

（滁州學(xué)院，安徽 滁州 239000）

根據(jù)應(yīng)用型人才培養(yǎng)的要求，以石蒜總生物堿的提取及抑菌活性為主題設(shè)計(jì)為生物化學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)，以激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，加強(qiáng)學(xué)生實(shí)踐能力的培養(yǎng)，提高人才培養(yǎng)質(zhì)量。

生物化學(xué)；綜合性實(shí)驗(yàn)；石蒜；總生物堿；抑菌活性

綜合性實(shí)驗(yàn)是指涉及本課程的綜合知識(shí)，或相關(guān)課程多個(gè)知識(shí)點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)來(lái)設(shè)計(jì)和操作實(shí)驗(yàn)，綜合訓(xùn)練學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能的一種復(fù)合型實(shí)驗(yàn)[1,2]。綜合性實(shí)驗(yàn)主要包括教師擬定實(shí)驗(yàn)題目，學(xué)生查閱文獻(xiàn)、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案、獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)操作并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)論文，教師總結(jié)和評(píng)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果等環(huán)節(jié)[3,4]。其目的主要是培養(yǎng)學(xué)生查閱文獻(xiàn)的能力、實(shí)驗(yàn)操作能力、數(shù)據(jù)處理能力、綜合分析能力以及解決實(shí)際問(wèn)題的能力[5，6]。綜合性實(shí)驗(yàn)具有綜合性和探索性的特點(diǎn)，能啟發(fā)學(xué)生思維，激發(fā)學(xué)生創(chuàng)造力，是培養(yǎng)高素質(zhì)應(yīng)用型人才的有力措施[7-,9]。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是生物科學(xué)專業(yè)學(xué)生必修的專業(yè)基礎(chǔ)課之一，在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式影響下，許多地方高校開(kāi)設(shè)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)大多是一些內(nèi)容單一的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程都是老師先講解實(shí)驗(yàn)原理和方法，學(xué)生按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)上的步驟依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，學(xué)生沒(méi)有自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案和獨(dú)立操作的機(jī)會(huì)。結(jié)果是學(xué)生的主動(dòng)性和創(chuàng)造性得不到發(fā)揮，不利于對(duì)知識(shí)整體性和系統(tǒng)化地把握，阻礙了實(shí)踐能力的培養(yǎng)。為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的不足，提高生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量，增強(qiáng)學(xué)生的實(shí)踐能力，設(shè)計(jì)一些完善的綜合性實(shí)驗(yàn)是關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。

石蒜[Lycoris radiate(L.Herit.)Herb]為石蒜科石蒜屬多年生草本植物，別名又稱老鴉蒜、獨(dú)蒜、蟑螂花、龍爪花，在我國(guó)分布于安徽、山東、河南、廣東、廣西、江蘇、浙江、江西等省，多生于山地陰濕處、林緣、路旁或溪谷溝邊、石縫之間[10]。石蒜中含有多種活性成分，其中的生物堿不但具有抗癌、抗菌、抗炎等作用，還能抑制膽堿酯酶和興奮神經(jīng)肌肉，可以用來(lái)治療心血管疾病及老年癡呆癥[11]，具有良好的開(kāi)發(fā)利用前景。針對(duì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的實(shí)際問(wèn)題，筆者進(jìn)行了改革和創(chuàng)新，設(shè)計(jì)了一個(gè)綜合性的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)——石蒜總生物堿的提取及抑菌活性，以激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，使學(xué)生掌握相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作技能，培養(yǎng)他們的科研思路和創(chuàng)新意識(shí)，從而達(dá)到更好的教學(xué)效果。

一、實(shí)驗(yàn)原理

根據(jù)大多數(shù)生物堿或生物堿鹽能溶于乙醇的通性，以乙醇做溶劑，采用熱水回流法可以從植物中提取總生物堿。超聲波輔助乙醇熱水回流可以增加溶劑穿透力，縮短提取時(shí)間，提高生物堿的溶出速度和提取率。本實(shí)驗(yàn)利用超聲波輔助乙醇熱水回流提取石蒜總生物堿，采用抑菌圈法測(cè)定總生物堿對(duì)大腸桿菌Escherichia col i）、枯草芽胞桿菌(Bacil lus subt ilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、巨大芽胞桿菌(Bacil lus magaterium)的抑菌活性，為石蒜的開(kāi)發(fā)利用提供評(píng)價(jià)依據(jù)。

二、實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

（一）實(shí)驗(yàn)材料

石蒜([L.radiate(L.Her it.)Herb])、大腸桿菌(E.col i)、枯草芽孢桿菌(B.subti l is)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、巨大芽孢桿菌(B.magater ium)。

（二）試劑

95%乙醇、石油醚、氯仿、碘—碘化鉀試劑、濃氨水、2%鹽酸

（三）設(shè)備

精密烘箱、生化培養(yǎng)箱、高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、超聲波細(xì)胞破碎儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵、數(shù)顯恒溫水浴鍋、立式壓力蒸汽滅菌鍋、單人單面垂直凈化工作臺(tái)、電子天平。

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（一）石蒜總生物堿的提取

采用超聲波輔助乙醇熱水回流提取法[12]。將石蒜鱗莖洗干凈，經(jīng)烘箱（60℃）烘干后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，制成干粉。稱取干粉30g放于燒瓶中，加入95%乙醇600mL，用超聲波處理15min，80℃熱水回流2h，過(guò)濾后濾渣再重復(fù)提取1次，合并所得的淡黃色濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至膏狀物，再用2%鹽酸溶解，石油醚脫脂，pH值用濃氨水調(diào)至8～9，然后加氯仿萃取數(shù)次，用碘—碘化鉀試劑檢驗(yàn)至無(wú)生物堿反應(yīng)為止。將氯仿蒸去，所得粘稠浸膏經(jīng)45℃烘干，得到白色粉末即為總生物堿。稱重后，用無(wú)菌水配制成0.1g/mL的溶液，放入冰箱中低溫保存，待用。

（二）抑菌實(shí)驗(yàn)

1、菌懸液的制備

在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取少量已活化的待測(cè)菌株于潔凈試管中，加入無(wú)菌水充分混勻，制備成各種菌懸液。

2、抑菌活性測(cè)定

吸取各種菌懸液0.2ml滴加于已經(jīng)制備好的培養(yǎng)基上，用滅菌的涂布玻璃棒將菌懸液涂布均勻。將滅菌的濾紙片（Φ=6mm）分別浸入配制好的生物堿溶液中，取出后在無(wú)菌條件下晾干。再將浸過(guò)生物堿提取液的濾紙片，間隔一定距離貼在含菌平板上（3片/皿），輕壓濾紙片使其與培養(yǎng)基接觸良好，以浸有蒸餾水的濾紙片作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。然后將培養(yǎng)皿倒翻，置于37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用十字交叉法測(cè)定抑菌圈的直徑。

四、驗(yàn)安排

（一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)需將學(xué)生分成5人一個(gè)小組，指導(dǎo)老師提前2周發(fā)布實(shí)驗(yàn)題目，通知給學(xué)生上網(wǎng)查閱文獻(xiàn)資料、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)審閱和修改后予以實(shí)施。

（二）實(shí)驗(yàn)過(guò)程

本實(shí)驗(yàn)可以安排在小學(xué)期中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室全天開(kāi)放，實(shí)驗(yàn)教師和實(shí)驗(yàn)員加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的指導(dǎo)和管理。實(shí)驗(yàn)所需的材料、試劑和設(shè)備的準(zhǔn)備等均由學(xué)生自己動(dòng)手完成，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要對(duì)每一步進(jìn)行詳細(xì)的記錄。實(shí)驗(yàn)教師必須指導(dǎo)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象進(jìn)行分析并提出相應(yīng)的解決辦法。

（三）實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各小組分別匯報(bào)自己的實(shí)驗(yàn)情況，包括實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、遇到的問(wèn)題和解決方法等。然后，按照科技論文的要求撰寫(xiě)研究報(bào)告，應(yīng)包括實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、存在的問(wèn)題分析與討論，以及進(jìn)一步的改進(jìn)措施等方面內(nèi)容，訓(xùn)練學(xué)生的科研技能。最后，教師要從以下幾個(gè)方面客觀公正地評(píng)定每個(gè)小組的實(shí)驗(yàn)成績(jī)，如平時(shí)成績(jī)30分（實(shí)驗(yàn)態(tài)度10分、出勤20分）、實(shí)驗(yàn)技能30分(實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)15分，實(shí)驗(yàn)操作15分)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及創(chuàng)新占40分（解答問(wèn)題10分，探索能力10分，研究報(bào)告20分）。

五、實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)及教學(xué)效果

本實(shí)驗(yàn)利用超聲波輔助乙醇熱水回流提取石蒜總生物堿，采用抑菌圈法測(cè)定總生物堿對(duì)大腸桿菌(E.col i)、枯草芽孢桿菌(B.subtil is)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、巨大芽孢桿菌(B.magaterium)的抑菌活性，涉及總生物堿的提取及純化、減壓濃縮、高壓滅菌、培養(yǎng)基制備、細(xì)菌培養(yǎng)等多個(gè)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。要求學(xué)生不但要有扎實(shí)的生物化學(xué)基礎(chǔ)理論知識(shí),而且還應(yīng)具備烘箱、超聲波細(xì)胞破碎儀、恒溫顯數(shù)水浴鍋、超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、生化培養(yǎng)箱等設(shè)備的操作技能。該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容將生物化學(xué)基礎(chǔ)理論知識(shí)與技能訓(xùn)練相結(jié)合，促使學(xué)生把握基礎(chǔ)理論知識(shí)，訓(xùn)練學(xué)生對(duì)多學(xué)科知識(shí)綜合運(yùn)用的能力。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)展前，老師提出具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮脱芯磕繕?biāo)，學(xué)生獨(dú)立查閱資料，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。讓學(xué)生自主完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，老師輔以適當(dāng)?shù)闹笇?dǎo)，充分體現(xiàn)了學(xué)生的主體地位，能調(diào)動(dòng)學(xué)生上實(shí)驗(yàn)課的積極性，使學(xué)生在有限的時(shí)間內(nèi)掌握更多的理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。通過(guò)對(duì)生物科學(xué)專業(yè)2012、2013、2014級(jí)學(xué)生進(jìn)行該項(xiàng)綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)，極大地激發(fā)了學(xué)生的科研熱情，增強(qiáng)了主觀能動(dòng)性，提高了動(dòng)手能力，全面訓(xùn)練了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能，提高了學(xué)生的實(shí)踐創(chuàng)新能力。

總之，綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)馨焉锘瘜W(xué)的相關(guān)知識(shí)點(diǎn)貫聯(lián)起來(lái)，使實(shí)驗(yàn)內(nèi)容具有系統(tǒng)性，可給學(xué)生一個(gè)連貫的、有機(jī)組合的實(shí)驗(yàn)技能訓(xùn)練，是培養(yǎng)學(xué)生的科研創(chuàng)新能力、激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣、全面提高綜合素質(zhì)的有效實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式。在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開(kāi)設(shè)石蒜總生物堿的提取及抑菌活性這一綜合性實(shí)驗(yàn)，符合培養(yǎng)應(yīng)用型人才的要求，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)教學(xué)可以真正提高人才培養(yǎng)質(zhì)量。

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Q503

A

1671-5993（2016）03-0059-03

2016-05-01

安徽省高等學(xué)校省級(jí)教學(xué)研究項(xiàng)目（2015jyxm360）；滁州學(xué)院教學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（2015jyz006）；滁州學(xué)院專業(yè)綜合改革試點(diǎn)項(xiàng)目（2013zysd02）。

向玉勇（1974—），男，湖南麻城人，博士，副教授，從事生物化學(xué)教學(xué)與研究。