王　璐，劉成雁，王志嘉，任雪冬，尤海丹，熊　爽，吳冬冬，田福林

(遼寧省分析科學(xué)研究院，遼寧　沈陽　110015)

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保健食品中9種鎮(zhèn)靜催眠類藥品的UPLC-MS/MS法檢測及質(zhì)譜裂解特征的研究

王璐，劉成雁*，王志嘉，任雪冬，尤海丹，熊爽，吳冬冬，田福林

(遼寧省分析科學(xué)研究院，遼寧沈陽110015)

摘要：建立了同時測定保健食品中9種鎮(zhèn)靜催眠類化合物(氯美扎酮、三唑侖、阿普唑侖、艾司唑侖、地西泮、硝西泮、奧沙西泮、勞拉西泮、氯氮卓)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法，并研究了其質(zhì)譜裂解規(guī)律。樣品以甲醇為提取溶劑，經(jīng)Zorbax SB-C18(3.5 μm,2.1 mm×150 mm)色譜柱分離，乙腈-水(含0.1%甲酸)為流動相梯度洗脫,流速為0.3 mL/min。采用電噴霧離子源(ESI)，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描方式檢測，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。9種藥物在0.5~50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，定量下限為1.6~9.2 μg·kg-1。低、中、高3個加標(biāo)水平下的平均回收率為78.1%~101.2%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%~9.7%，日間RSD為2.0%~11.2%。該法簡便、快速、準(zhǔn)確可靠，適合于保健食品中非法添加鎮(zhèn)靜催眠類藥品的高通量篩查。而對目標(biāo)化合物碎片離子及質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究，也為其定性鑒別和定量分析提供了參考。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；保健食品；鎮(zhèn)靜催眠類；質(zhì)譜裂解

失眠已成為當(dāng)今社會的一種流行性疾病，安眠藥為人類帶來福音的同時，也給人類的健康帶來了很大的問題[1-2]。但由于這些藥物對失眠癥的治療見效迅速，一些廠家在生產(chǎn)具有催眠作用的保健食品時添加這些西藥成分以提高產(chǎn)品的療效，欺騙消費(fèi)者，長期服用會對消費(fèi)者的身體健康造成嚴(yán)重危害。因此有必要建立快速、準(zhǔn)確檢測保健食品中鎮(zhèn)靜催眠類藥物的分析方法。

目前，國內(nèi)外關(guān)于該類藥品的檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)[3]、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5-7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS/MS)[8-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10-19]。其中TLC和HPLC法的靈敏度低，選擇性和特異性較差；ELISA法的結(jié)果需借助其它方法確證；GC-MS/MS法需要衍生化，處理方法相對復(fù)雜；LC-MS/MS法具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn),成為目前報道較多的方法。相比文獻(xiàn)報道的LC-MS/MS[16-20]方法，本研究在目標(biāo)化合物的選擇上，除了檢測常見的苯二氮卓類藥物外，增加了國內(nèi)外研究很少的氯美扎酮。采用質(zhì)譜法對9種化合物的裂解規(guī)律進(jìn)行了研究，首次推斷了氯美扎酮的裂解方式。對9種化合物進(jìn)行了完整的方法學(xué)確證，重點(diǎn)考察了化合物的基質(zhì)效應(yīng)，并采用基質(zhì)加標(biāo)法定量消除基質(zhì)影響。該法選擇性好、靈敏度高、簡單快速、穩(wěn)定可靠，適用于保健食品中非法添加的鎮(zhèn)靜催眠藥物的定性、定量檢測。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Agilent 1200 UPLC/6410 B MS/MS 液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫科技有限公司)；KQ3200DB型超聲清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；甲酸(HPLC級，美國Tedia公司)；實驗用水為Milli-Q純水系統(tǒng)(Millipore公司)制備的超純水；對照品：三唑侖、阿普唑侖、艾司唑侖、地西泮、硝西泮、奧沙西泮、勞拉西泮、氯氮卓、氯美扎酮均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2樣品處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g(或0.5 mL)樣品于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，過0.20 μm微孔濾膜，待測定。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，配成 1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,臨用時以甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.5,1.0,2.0,5.0,10,20，50 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將空白樣品按“1.2”方法進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)，配制成質(zhì)量濃度分別為0.5,1.0,2.0,5.0,10,20，50 μg/L的混合基質(zhì)加標(biāo)溶液，以各組分的峰面積對其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4測定方法

1.4.1液相色譜條件色譜柱:Zorbax-SB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序：0~1 min,70% A；1~3 min,40%A；3~4 min,50%~40% A； 4~5 min,40%~30% A； 5~6 min,30%~70% A；6~10 min,70% A；流速為0.3 mL/min；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件離子源為電噴霧(ESI)離子源，正離子電離模式；干燥氣(N2)溫度350 ℃，干燥氣流量 9.0 L/min，霧化氣(N2)壓力295.4 kPa,電噴霧電壓4 000 V，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件優(yōu)化及裂解規(guī)律的研究

由于9種化合物均具有仲胺或叔胺堿性基團(tuán)，容易加合H+形成帶正電荷的母離子[M+H]+，因此選用ESI+為離子化模式，確定分子離子峰,同時對干燥氣溫度、霧化氣壓力、干燥氣流量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。分別對母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，選擇2個信噪比較高的特征子離子分別作為定量、定性離子對，9種藥物的質(zhì)譜圖和裂解規(guī)律如圖1所示。

表1　9種鎮(zhèn)靜類藥物的質(zhì)譜條件參數(shù)

* quantitative ion

質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明：氯美扎酮磺?；鶊F(tuán)有兩個O原子，吸電子作用很強(qiáng)，造成C—S鍵不穩(wěn)定，易發(fā)生斷裂。結(jié)合其結(jié)構(gòu)可以推斷氯美扎酮的裂解機(jī)制為：磺?；鶅啥薈—S首先發(fā)生斷裂，得到m/z209的碎片離子。羰基上O原子也具有吸電子能力，造成C—N不穩(wěn)定，推斷氯美扎酮下一步的裂解發(fā)生在羰基上的C—N鍵，得到m/z154的碎片離子。三唑侖、艾司唑侖和阿普唑侖均含有三氮唑侖環(huán)，通過比較母離子與子離子之間的質(zhì)量差，推斷三者首先脫去的碎片離子(28)為N2分子，分別產(chǎn)生m/z315，267，281的碎片離子；阿普唑侖與艾司唑侖的不同之處是C(3)位連有1個甲基，所以下一步裂解分別脫去中性碎片CH3CN(41)、HCN(27),均得到m/z240的碎片離子；三唑侖同樣脫去中性碎片CH3CN(41)，得到m/z274的碎片離子；3個化合物最后脫去Cl原子得到m/z205的碎片離子，形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的三環(huán)共軛體系。奧沙西泮和勞拉西泮首先發(fā)生C—OH鍵斷裂，脫去H2O分子,分別得到m/z269和m/z303的碎片離子。下一步斷裂發(fā)生在羰基碳上，脫去CO分子，得到m/z241和m/z275的碎片離子；地西泮脫去CO分子，得到m/z257的碎片離子；硝西泮脫去中性分子NO2，得到m/z236的碎片離子; 推測其它具體裂解方式如圖1所示。電噴霧電離作為一種軟電離技術(shù)，通常易丟失中性小分子，進(jìn)而生成穩(wěn)定性較高的離子，本研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。

2.2液相色譜條件的優(yōu)化

對比考察了有機(jī)溶劑與不同種類揮發(fā)性緩沖液作為流動相時對待測物分離效果及靈敏度的影響。通過比較發(fā)現(xiàn)，使用甲醇-甲酸體系時，各化合物的保留時間相對較長，而且氯美扎酮的色譜峰形較寬并有明顯的拖尾現(xiàn)象；使用乙腈-甲酸體系時，目標(biāo)化合物的出峰時間較快；使用乙腈-乙酸銨體系時，目標(biāo)化合物的響應(yīng)值比用乙腈-甲酸體系低。綜合以上各因素，確定以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相體系，梯度洗脫。9種化合物的色譜圖見圖2。

2.3方法專屬性

取不含目標(biāo)化合物的口服液、膠囊劑的混合陰性樣品按“1.2”方法操作，上機(jī)測定；將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合液加入空白陰性樣品中，依同法操作，所得色譜圖見圖2。9種目標(biāo)化合物的保留時間為 2.7~10 min，而空白樣品在該時間段未出峰。結(jié)果表明：空白陰性樣品不干擾9種目標(biāo)化合物的測定，可以用于基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2.4基質(zhì)效應(yīng)的影響

目前，關(guān)于保健食品中睡眠類藥物的測定研究已有文獻(xiàn)報道[16-19],但對該類化合物基質(zhì)效應(yīng)的考察相對較少。本實驗采用提取后添加法[20]評價基質(zhì)效應(yīng)：基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積對濃度所作曲線的斜率/無基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積對濃度所作曲線的斜率-1)×100%。其中，ME>0表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME<0表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME=0表示在曲線范圍濃度內(nèi)基質(zhì)對響應(yīng)強(qiáng)度無影響。在0.5~50 μg/L濃度范圍內(nèi)，9種分析物的ME(%)值為-36.4%~22.5%(表2)，氯美扎酮的基質(zhì)抑制效應(yīng)較大，其它化合物也存在不同程度的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)作用。為了補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，采用基質(zhì)加標(biāo)法定量消除基質(zhì)影響，以滿足檢測要求。

2.5線性范圍與定量下限

取空白基質(zhì)配制質(zhì)量濃度分別為 0.5,1.0,2.0,5.0,10,20,50 μg/L的9種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各組分的峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X,μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表3)。結(jié)果顯示：各化合物在0.5~50 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2) 均大于0.99。9種化合物的檢出限均能達(dá)0.5 μg/L，以信噪比為10估算9種目標(biāo)物的定量下限為1.6~9.2 μg/kg。

表2　9種化合物在口服液和膠囊樣品中的基質(zhì)效應(yīng)

a：Sm is the slope of the calibration plot with calibration solutions in solvent(Sm為無基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積對濃度所作曲線的斜率)； b：Ss is the slope of calibration plot with matrix-matched calibration solutions(Ss為空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積對濃度所作曲線的斜率)

表3　9種化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)與定量下限

2.6加標(biāo)回收率、準(zhǔn)確度與精密度

以不含目標(biāo)化合物的口服液和膠囊制劑作為陰性樣品，分別添加1.0,5.0,20 μg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實驗。每個濃度平行測定6次，連續(xù)測定3 d，各化合物的回收率及日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)如表4所示。9種化合物的平均回收率為 78.1%~101.2%，日內(nèi)RSD為1.4%~9.7%，日間RSD為 2.0%~11.2%，可滿足定量分析要求。

表4　9種化合物在口服液和膠囊樣品中的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.7實際樣品的測定

采用上述方法檢驗了20批具有鎮(zhèn)靜安神催眠功效的保健食品，其中1種樣品檢出阿普唑侖(89.6 μg·kg-1)。

3結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對保健食品中9種鎮(zhèn)靜催眠類藥物進(jìn)行檢測。該法選擇性好、靈敏度高、操作簡便快速、穩(wěn)定可靠，具有很好的實際應(yīng)用價值，已應(yīng)用于日常檢測工作。

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Simultaneous Determination of 9 Kinds of Sedative Hypnotic Drugs in Health Foods Using UPLC-MS/MS and ESI Fragmentation Studies

WANG Lu,LIU Cheng-yan*,WANG Zhi-jia,REN Xue-dong,YOU Hai-dan,XIONG Shuang,WU Dong-dong,TIAN Fu-lin

(Liaoning Academy of Analytical Science,Shenyang110015,China)

Abstract：An ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was developed for the determination of 9 sedative hypnotic drugs(chormezanone,triazolam,alprazolam,estazolam,diazepam,nitrazepam,oxazepam,lorazepam,chlordiazepoxide) in health foods, and the dissociation pathways of nine drugs were studied by electrospray ion mass spectrometry.After extracted with methanol,the analyses were separated on a Zorbax SB-C18(3.5 μm,2.1 mm×150 mm) chromatographic column by gradient elution using a mixture of acetonitrile and 0.1% formic solution as mobile phase at a flow rate of 0.3 mL/min.Detection was performed by electrospray ionization in the positive ion mode under multiple reaction monitoring(MRM) mode,and quantified with matrix standard curve.As a result,the calibration curves for all target compounds were linear in the range of 0.5-50 μg/L with correlation coefficients(r2) larger than 0.99．The limits of quantitation(LOQ,S/N≥10) were in the range of 1.6-9.2 μg·kg-1.The recoveries for all the drugs were 78.1%-101.2%.The intra- and inter-day precisions values at three spiked levels were between 1.4%-9.7%and 2.0%-11.2%,respectively.With strong selectivity,high sensitivity,easy operation and rapid detection,this method could be used to detect 9 kinds of illegally added sedative drugs in health foods.Moreover,the study of mass spectrometric behaviours and ion fragmentation patterns of nine drugs could provide a reference for the qualitative identification and quantitative analysis.

Key words：ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)；functional foods；sedative hypnotic drugs；fragmentation

中圖分類號：O657.63；TQ460.72

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 1004-4957(2016)02-0219-06

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.014

*通訊作者：劉成雁，博士，研究員，研究方向：危險化學(xué)品的快速分析方法和應(yīng)急處理，Tel：024-24823748，E-mail:chengyanliuln@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(21307051)；遼寧省自然科學(xué)基金項目(2013020152)

收稿日期：2015-07-29；修回日期：2015-08-24