蔣懷周 ,許晶晶,董繼揚*

(1.安徽中醫(yī)藥大學　中醫(yī)臨床學院,安徽　合肥　230031;2.廈門大學　電子科學系,福建省等離子體

與磁共振研究重點實驗室,福建　廈門　361005)

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銅負荷大鼠基底節(jié)對肝豆靈代謝響應的1H NMR研究

蔣懷周1,許晶晶2,董繼揚2*

(1.安徽中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院,安徽合肥230031;2.廈門大學電子科學系,福建省等離子體

與磁共振研究重點實驗室,福建廈門361005)

摘要：采用核磁共振氫譜(1H NMR)技術與多元統(tǒng)計分析相結合的方法,對肝豆靈對大鼠基底節(jié)銅損傷的調節(jié)機制進行研究。24只雄性Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組和肝豆靈組,每組8只,以銅負荷法造模。從造模第7周開始,肝豆靈組大鼠以肝豆靈灌胃。數據分析顯示：與正常組比較,模型組的基底節(jié)細胞凋亡指數顯著增高(p<0.01);基底節(jié)組織中的谷氨酰胺、尿苷、蘇氨酸含量升高(p<0.05),甘露醇、腺苷、N-乙酰天冬氨酸、谷氨酸、N-乙酰谷氨酸(NAG)、天冬酰胺、乙酸、天冬氨酸、肌醇、三磷酸腺苷(ATP)含量降低(p<0.05);與模型組相比,肝豆靈組的基底節(jié)細胞凋亡指數顯著降低(p<0.01);基底節(jié)組織中的谷氨酰胺、尿苷、乙酸、天冬氨酸含量降低(p<0.05),甘露醇、腺苷、蘇氨酸、N-乙酰天冬氨酸、谷氨酸、N-乙酰谷氨酸、天冬酰胺、肌醇、ATP含量升高(p<0.05)。研究結果表明,肝豆靈可影響銅負荷大鼠基底節(jié)的代謝,對銅損傷具有一定的修復作用,其機制可能是通過調節(jié)氨的解毒和興奮性氨基酸類神經遞質的代謝,干預能量代謝,恢復神經元和神經膠質細胞功能。

關鍵詞：代謝響應;銅負荷;基底節(jié);肝豆靈;核磁共振氫譜技術

銅是人體必需的微量元素,參與諸多酶類和蛋白質的合成,在生理活動中發(fā)揮著重要作用。銅代謝紊亂可導致多種疾病,Wilson病(Wilson disease,WD)即是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙性疾病,過量的銅沉積在該病患者體內,廣泛累及全身組織器官,尤以肝臟和基底節(jié)受損最為嚴重,并引起相應的臨床表現(xiàn)。

WD是為數不多的可有效治療的神經系統(tǒng)遺傳病之一,患者需終身服藥以提高生活質量。西醫(yī)治療該病以金屬絡合劑為主,青霉胺是其首選口服藥物。中醫(yī)注重整體觀念,治療該病亦具有很好的效果。其中,肝豆靈片是安徽省中醫(yī)院治療WD的院內制劑,由臨床應用30余年且療效可靠的肝豆湯為基本方優(yōu)化組合而成。多年的臨床及科研反復驗證,該方不但具有一定的排銅作用,還可改善患者的神經功能[1-2],但其治療的分子機制尚未完全明確。

代謝組學是研究生物體內源性代謝物質及其變化規(guī)律的科學,廣泛應用于生理、病理和藥物機制的研究[3-4]。本研究旨在以核磁共振氫譜(Proton nuclear magnetic resonance,1H NMR)代謝組學技術分析肝豆靈對銅負荷大鼠基底節(jié)的影響,探討肝豆靈對基底節(jié)銅損傷的治療作用途徑。

1實驗部分

1.1實驗材料、試劑與儀器

實驗動物：24只雄性SPF級Wistar大鼠,12周齡,體重(180±20) g,實驗動物許可證號：SCXK(皖)2011-002,由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供并飼養(yǎng)。

藥物和試劑：肝豆靈(批號：皖藥制字Z20050071,安徽省中醫(yī)院院內制劑,規(guī)格：0.3 g/片),由半枝蓮、穿心蓮、大黃、黃芩、黃連、澤瀉、萆薢、金錢草等組成;制備工藝：按處方稱取藥材,以70%乙醇回流提取2次后,加8倍量水,將藥渣再提取1次,濃縮藥液至一定濃度,真空減壓干燥,得干浸膏,加入輔料(淀粉、單糖漿和硬脂酸鎂等)壓片即成;質控標準：高效液相色譜法(HPLC)測定鹽酸小檗堿含量不低于0.5%為合格;乙醚(分析純，上海蘇懿化學試劑有限公司);TUNEL試劑盒(10279600,美國Roche公司);硫酸銅、甲醇、三氯甲烷(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

實驗儀器：EG1160石蠟包埋機(德國Leica公司);RM2235石蠟切片機(德國Leica公司);JM-6 Beckman離心機(美國Beckman公司);OlympusAH-2型顯微鏡(日本Olympus公司);HPIAS-1000病理圖像分析儀(武漢清平影像技術有限責任公司);SCIENTZ-48高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司);D29-6020真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);冷凍干燥機(北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司);Bruker 600 MHz核磁共振譜儀(Bruker-AV600 spectrometer,德國Bruker公司)。

1.2實驗方法

1.2.1造模與藥物干預適應性飼養(yǎng)1周后,大鼠被隨機分為正常組、模型組和肝豆靈組 3 組,每組8只。室溫20~22 ℃,相對濕度40%~60%,光照 12 h、黑暗 12 h。

正常組始終自由攝食飲水。模型組和肝豆靈組在適應性飼養(yǎng)1周后,以銅負荷法[5]造模。具體方法為：連續(xù)12周喂飼含硫酸銅的飼料(1 g/kg)和水(0.185%)。造模第7周開始,肝豆靈組大鼠以肝豆靈0.486(g·kg-1)/d灌胃,正常組和模型組予以等容量生理鹽水灌胃,直至第12周造模結束。

1.2.2樣本采集造模結束,大鼠禁食12 h后,乙醚吸入麻醉,斷頭取腦,依據George Paxious和Charles Watson鼠腦圖譜[6]取大鼠新鮮基底節(jié)區(qū)。將所取組織分為兩份：1份液氮速凍,-80 ℃超低溫冰箱保存,以備NMR檢測;另1份以10%多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋,用于細胞凋亡檢測。

1.2.3實驗方法細胞凋亡實驗:實驗步驟按照Roche公司TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。結果判定：對照基底節(jié)細胞核呈藍色,陽性細胞(即凋亡細胞)核呈棕褐色者。400倍光鏡下用單盲法進行觀察、計數,每張片隨機取3個高倍視野,計算細胞凋亡指數(AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%)。實驗結果計量資料以(均數±標準差)表示,若多組均數的比較滿足方差分析,則各組間差異進行單因素方差分析。若不滿足方差分析,則進行秩和檢驗。所有數據均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析,以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

組織提取:取基底節(jié)組織樣品;加入由甲醇(4 mL/g)和蒸餾水(0.85 mL/g)配制的溶液中,低溫勻漿;加入1.4 mL 氯仿,旋渦樣品;加入0.7 mL 蒸餾水,再旋渦;于4 ℃ 10 000 r/min離心樣品10 min;將上清液移至 5 mL 離心管;真空干燥箱中揮干甲醇;剩余溶液移至凍干機中凍干成粉末,保存于-80 ℃冰箱。

氫譜采集：NMR實驗前,解凍粉末樣品至常溫,加入含 0.05%的2,2,3,3-三甲基甲硅烷基丙酸(3-Trimethylsilylpropionic-2，2，3，3-acid，TSP)的重水配制的磷酸鹽緩沖液 550 μL(150 mmol/L K2HPO4和 NaH2PO4,pH 7.4)振蕩混勻;4 ℃ 10 000 r/min離心 10 min,取 500 μL 上清液轉移至 5 mm 核磁管內。以 Bruker 600 MHz譜儀進行核磁采樣,實驗溫度 296 K。使用標準的預飽和脈沖序列 ZGPR(RD-90°-ACQ)采集1H NMR 譜,譜寬為 12 kHz,弛豫延時為 2 s,采樣點數 32 K,累加次數 64 次。

譜數據處理：用MestreNova 9.0軟件打開fid數據,將 fid 數據末尾充零至 64 K 點數,快速傅立葉變換成NMR譜。以 TSP 譜峰為零點對NMR譜進行定標,并進行相位校正和基線校正。采用自編軟件[7]進行譜峰對齊,截除殘余水信號(δ5.23~4.68)和殘余甲醇信號(δ3.40~3.31),對剩余區(qū)域(δ9.5~0.5)進行自適應分段積分[8]。然后對數據進行概率商歸一化(PQN)[9]。最后導入 SIMCA-P 軟件(Version 14.0,Umetrics,Sweden)進行多變量分析。

2結果與討論

2.1一般狀況觀察

動物飼養(yǎng)過程中,正常組大鼠作息活動規(guī)律,皮毛柔順光澤,飲食和二便正常。造模兩周后,模型組和肝豆靈組大鼠精神不振,飲食攝水減少,皮毛光澤度差,小便減少,大便較稀不成形。給藥后,肝豆靈組較模型組大鼠的飲食量逐漸增加,精神狀態(tài)有所改善,小便較前增多,大便稍成形。

2.2細胞凋亡實驗

表1　TUNEL法檢測基底節(jié)細胞凋亡實驗結果

note:compared with the control group,ttest,△p<0.01;compared

with the model group,#p<0.01(與正常組比較,t檢驗的△p<0.01;

與模型組比較,#p<0.01)

對正常組、模型組、肝豆靈組3種大鼠基底節(jié)組織進行細胞凋亡實驗，結果如圖1所示,正常組可見極少數凋亡細胞(圖1A),模型組可見大量棕褐色凋亡細胞(圖1B),較正常組凋亡指數增多(p<0.01);肝豆靈組的凋亡細胞數相對于模型組減少,凋亡指數降低(p<0.01)(圖1C)。對正常對照組、模型組和肝豆靈組基底節(jié)細胞凋亡指數進行統(tǒng)計，結果如表1 所示。可見，與正常對照組相比，模型組和肝豆靈組的細胞凋亡指數均顯著升高(p<0.01);但與模型組相比，肝豆靈組的細胞凋亡指數顯著降低(p<0.01)，說明肝豆靈對銅負荷大鼠基底節(jié)細胞凋亡具有一定的抑制作用。

圖1　基底節(jié)細胞凋亡圖片(TUNEL,×400)

2.31H NMR代謝輪廓分析

圖2為大鼠基底節(jié)組織的典型1H NMR譜,其中低場部分的信號強度較低,因此放大8倍顯示。從圖中可以看出，3組大鼠基底節(jié)組織1H NMR 譜圖存在一定差異。根據HMDB數據庫(http://www.hmdb.ca)和文獻報道[10-11]對強度較高的譜峰進行代謝物歸屬,得出一些主要的代謝物,包括肌苷(InO)、單磷酸腺苷(AMP)、肌醇(m-l)、乙醇胺(EA)、谷氨酰胺(Gln)、葡萄糖(Glu)、二磷酸腺苷(ADP)、N-乙酰天冬氨酸(NAA)、酪氨酸(Tyr);延胡索酸(Fum)、腺苷/肌苷(Ads/Ino)、天冬氨酸(Asp)、牛磺酸(Tau)、磷酸膽堿(PC)、煙堿(NA)、甲酸(For)、腺嘌呤核甙(Ade)、苯丙氨酸(Phe)、乳酸(Lac)、甘油磷酸膽堿(GPC)、乙酸(Ace)、γ-氨基丁酸(GABA)、尿苷(Urd)、尿苷二磷酸葡萄糖(UDG)、甘露醇(Mat)、3-甲基黃嘌呤(MX)、肌酸(Cr)、天冬酰胺(Asn)、尿嘧啶(Urc)、丙氨酸(Ala),詳細信息如圖2所示。

圖2　基底節(jié)組織的典型1H NMR譜

為了探索正常組、模型組和肝豆靈組3組樣本之間的代謝差異,對預處理后的圖譜數據做主成分分析(PCA),結果如圖3A所示。各組樣本在PCA得分圖中比較分散,且有一定的重疊。由于PCA是以方差最大為原則,這說明3組樣本NMR譜的個體差異大于組間差異。為了突出各組樣本的組間差異,對數據進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA),結果如圖3B 所示。3組樣本在PLS-DA得分圖中可以明顯區(qū)分,其中R2Y=89.15%,Q2=72.2%。說明3組之間具有顯著差異。

進一步分別對模型組和正常組、模型組和肝豆靈組進行PLS-DA分析,結果如圖3C、D所示,兩個模型的預測能力Q2分別提高到83.24%和94.20%。對這兩個模型進行200次的置換實驗,將部分樣本的類別信息打亂,計算相應模型的R2Y和Q2,以此評價各組之間差異的顯著性,以及PLS-DA建模方法對組間差異的表達能力,結果如圖4所示。由圖4可見,部分樣本類別信息打亂后,相應模型的性能(R2Y和Q2)均下降。說明模型組與正常組,以及模型組與肝豆靈組的差異顯著,而且PLS-DA模型可以很好地表征它們之間的差異。

綜合各代謝物譜峰在PLS-DA模型的VIP值、回歸系數值和t檢驗結果,發(fā)現(xiàn)12種對組間差異貢獻較大的代謝物,將這些代謝物的特征峰積分面積在3組樣本中的中值、25%分位點、75%分位點、最小值、最大值和離群值等統(tǒng)計信息用箱圖表示(如圖5，縱坐標為譜峰積分面積大小)。相對于正常組,模型組樣品中的谷氨酰胺、尿苷、蘇氨酸含量升高(p<0.05),甘露醇、腺苷、N-乙酰天冬氨酸(NAA)、谷氨酸、N-乙酰谷氨酸(NAG)、天冬酰胺、乙酸、天冬氨酸、肌醇、三磷酸腺苷(ATP)的含量降低(p<0.05);相對于模型組,肝豆靈組的谷氨酰胺、尿苷、乙酸、天冬氨酸含量降低(p<0.05),甘露醇、腺苷、蘇氨酸、NAA、谷氨酸、N-乙酰谷氨酸、天冬酰胺、肌醇、ATP的含量升高(p<0.05)。

圖5　3組大鼠差異代謝物

2.4討論

基底節(jié)是位于大腦白質深部的灰質團塊,包括豆狀核(殼核和蒼白球)、尾狀核、杏仁體和屏狀核,代謝非常旺盛,對毒性損傷極為敏感。銅沉積于WD患者腦部,主要累及基底節(jié),可通過氧化應激-凋亡級聯(lián)反應引起細胞凋亡[12]。近年研究發(fā)現(xiàn),凋亡普遍發(fā)生于神經變性疾病,在神經細胞變性死亡中可能起著重要作用。在銅誘導神經細胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)[13],肝豆靈的基礎方肝豆湯可通過抑制促凋亡因子Caspase-3及Caspase-9的表達，上調抑凋亡蛋白XIAP的表達,有效干預神經細胞凋亡,保護神經細胞活性。本實驗所采用的Tunel細胞凋亡檢測試劑盒,是通過檢測細胞凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況,定位正在凋亡的細胞,通過組間對比凋亡指數,能反映模型組細胞凋亡情況和藥物干預結果。如表1所示,經TUNEL染色后,模型組大鼠基底節(jié)細胞凋亡指數較正常組高,肝豆靈組的凋亡指數較模型組低,說明銅對模型組大鼠基底節(jié)細胞造成了損傷,肝豆靈可抑制銅負荷大鼠基底節(jié)細胞凋亡。為了進一步認識肝豆靈的干預機制,實驗對3組大鼠小分子代謝物進行分析。

模型組大鼠的ATP和谷氨酸含量降低,谷氨酰胺含量增高,可能與大鼠的氨的代謝紊亂有關。氨是有毒物質,腦細胞對其非常敏感,經血腦屏障入腦后,在大腦的去毒過程中,氨由ATP供能,與α-酮戊二酸結合成谷氨酸,谷氨酸在谷氨酰胺合成酶催化下與氨生成谷氨酰胺。肝臟是機體清除氨的主要場所,亦是銅沉積造成損傷的主要器官。銅負荷飲食造成大鼠體內銅過量,引起肝損傷[14],導致血氨增高,使上述反應過度消耗能量和谷氨酸,干擾腦的能量代謝,并生成大量的谷氨酰胺。臨床上,谷氨酰胺的升高可見于肝損傷較重的WD患者,此類患者若不及時治療,隨著病情的發(fā)展,最終可因血氨過高引起肝性腦病表現(xiàn)[9]。相較于模型組大鼠，肝豆靈組大鼠的上述代謝物含量有所恢復,說明肝豆靈可能通過對肝臟排銅,降低血氨含量,恢復能量代謝,干預氨對腦細胞的損傷。

神經遞質是神經元之間進行信息傳遞的神經活性物質,其穩(wěn)定對于維持和協(xié)調神經系統(tǒng)功能非常重要。谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、NAA、乙酸是腦內氨基酸類神經遞質及其代謝產物,其間可通過代謝相互轉化、合成。其中,谷氨酸和天冬氨酸是腦內最重要的興奮性氨基酸,在中樞突觸可塑性改變、應激反應和興奮性突觸傳遞中起重要作用。以上氨基酸含量在模型組大鼠中發(fā)生了變化,說明銅對基底節(jié)的損傷可引起氨基酸類神經遞質,尤其是興奮性氨基酸及其代謝失調。肝豆靈干預后,上述部分氨基酸含量向對照范圍回歸,提示肝豆靈可能通過調節(jié)興奮性氨基酸類神經遞質及其代謝,幫助恢復基底節(jié)神經功能。

NAA是神經元標志物[15],由乙酰輔酶A和天冬氨酸作為底物在神經元線粒體合成,其合成涉及能量代謝。NAA含量減少可見于神經元損傷或能量代謝失調,常用于神經系統(tǒng)變性疾病的研究[16]。以質子磁共振波譜(Proton magnetic resonance spectroscopy,1H MRS)對WD進行研究,發(fā)現(xiàn)患者基底節(jié)NAA水平降低,且降低程度與臨床神經系統(tǒng)癥狀嚴重程度相關[17]。治療后,NAA含量可隨患者神經癥狀的改善與惡化,發(fā)生相應變化。因此有研究者認為經后期反復驗證后,NAA或可望作為WD神經損傷程度和治療效果的一個指標[18]。本實驗模型組大鼠的NAA含量降低,與臨床研究相符。腺苷及其衍生物ATP參與能量代謝,經肝豆靈干預后,腺苷、ATP、NAA含量升高,說明肝豆靈干預銅負荷神經損傷的途徑之一,可能與恢復能量代謝有關。

星形膠質細胞位于神經元和毛細血管內皮細胞之間,是銅穿過血腦屏障后,首先接觸到的腦細胞。高銅環(huán)境下,星形膠質細胞可吸收大量的銅以保護神經元不受損傷,對銅在腦中的代謝和穩(wěn)定具有重要意義[19]。肌醇是星形膠質細胞的標志物[20],參與調節(jié)細胞滲透壓。許多文獻報道以MRS測WD患者腦肌醇含量,但結果并不一致[17,21]。多數結果支持患者肝損傷時,肌醇含量降低[16],且其含量可隨患者肝臟的改善而回升[18]。對于WD肌醇降低的原因,有研究認為可能與肝損傷導致腦內氨增多,引起星形膠質細胞腫脹有關[22]：如前所述,腦內氨增多時,消耗谷氨酸,生成大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺主要合成于星形膠質細胞,是細胞內滲透劑,含量過多可導致細胞腫脹,引起肌醇含量減少。本實驗模型組大鼠經肝豆靈干預后,基底節(jié)肌醇、谷氨酸、谷氨酰胺含量有所恢復,可能意味著藥物干預后,隨著對氨的解毒,星形膠質細胞腫脹有所緩解。星形膠質細胞對神經元起支持、修復和保護作用,兩者在功能和結構上聯(lián)系密切,其功能恢復有助于神經元功能的恢復。

3結論

本文以NMR代謝組學技術對肝豆靈片干預銅負荷大鼠基底節(jié)損傷進行研究,發(fā)現(xiàn)肝豆靈片可能通過對氨的解毒,調節(jié)興奮性氨基酸類神經遞質代謝,干預能量代謝,恢復神經元和星形膠質細胞功能,以發(fā)揮其治療作用。以上結果與肝豆靈片可改善WD患者神經功能等臨床研究結論[1-2]相符,或可初步解釋此臨床治療機制,為進一步闡釋WD銅對基底節(jié)的損傷途徑和藥物作用機制提供依據。

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JIANG Huai-zhou1,XU Jing-jing2,DONG Ji-yang2*

(1.College of Traditional Chinese Medicine Clinic,Anhui University of Chinese Medicine,Hefei230031,China;2.Department of Electronic Science,Fujian Provincial Key Laboratory of Plasma and Magnetic Resonance,Xiamen University,Xiamen361005,China)

Abstract：1H NMR spectroscopy combined with multivariate statistical method was introduced in this paper to explore the regulation effect of Gandouling on basal ganglia injury in copper-laden rats.24 male Wistar rats were randomly divided into control group,model group and Gandouling group,with 8 rats in each group.The rat model was established by copper-laden method.From the 7th week of modeling,Gandouling group was given Gandouling formula via gavage.Compared with the control group,the index of apoptosis cells in basal ganglia of model group increased significantly(p<0.01),and glutamine,uridine and threonine in basal ganglia were increased(p<0.05)while mannitol,adenosine,N-acetylaspartate,glutamate,N-acetylglutamine asparagine,acetate,aspartate,myo-inositol and ATP were decreased(p<0.05).Compared with the model group,the index of apoptosis cells in basal ganglia of Gandouling group was significantly decreased(p<0.01),and glutamine,uridine,acetate and aspartate were reduced(p<0.05)while mannitol,adenosine,threonine,N-acetylaspartate,glutamate,N-acetylglutamine,asparagine,myo-inositol and ATP were elevated(p<0.05).The results showed that Gandouling could influence the metabolism of basal ganglia in copper-laden rats,which has a certain therapeutic effect on damage caused by copper.The mechanism may be restoration of the functions of neurons and glial cells,through adjusting the detoxification of ammonia and metabolism of excitatory amino acid neurotransmitter and interfering the energy metabolism.

Key words：metabolic response;copper-laden;basal ganglia;Gandouling;1H NMR

中圖分類號：O482.532;O614.121

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)02-0156-08

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.005

*通訊作者：董繼揚,博士,教授，研究方向:醫(yī)學代謝組學,Tel:0592-2185696;E-mail:jydong@xmu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(81202691,81201143,81371639);福建省自然科學基金(2015Y0032)

收稿日期：2015-08-30；修回日期：2015-09-25