康 文，孫永濤

HIV腦內(nèi)存儲庫
——功能性治愈的另一障礙

康 文，孫永濤

減小HIV感染者體內(nèi)病毒儲存庫的規(guī)模是實現(xiàn)HIV功能性治愈的基礎(chǔ)?！癝hock and kill”（趕盡殺絕）策略首先激活靜息的病毒儲存庫，進而通過強化的聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療或聯(lián)合治療性免疫以清除這些病毒儲存庫。HIV可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的血管旁巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和星狀細胞形成潛伏感染，這些腦內(nèi)病毒儲存庫也須要被清除。然而，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是隔離于外周其他部位的獨立的HIV藥理學(xué)避難所。不但如此，腦內(nèi)潛伏感染的細胞也與體內(nèi)主要的病毒儲存庫記憶性T細胞不同。由于大腦的獨特環(huán)境，使得清除或減少這些腦內(nèi)病毒儲存庫十分困難。本文將就目前對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒儲存庫的認識加以介紹，對清除腦內(nèi)儲存庫所面臨的困難進行討論，并對清除病毒儲存庫的潛在方法進行總結(jié)，為實現(xiàn)HIV功能性治愈提供一定的思路與方法。

人免疫缺陷病毒；功能性治愈；腦內(nèi)存儲庫；抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療；潛伏感染激活劑；治療性免疫

盡管聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（combined antiretroviral therapy, cART）可以長效地抑制體內(nèi)HIV，重建機體的免疫功能，極大地延長了HIV感染者的壽命。但是，HIV感染者須要終生接受cART，由此帶來諸多新的問題，如病毒耐藥，患者衰老引起的非AIDS相關(guān)疾?。ǚ茿IDS性腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)認知功能紊亂等）的發(fā)生率增加等，給個人和社會公共衛(wèi)生體系增加了沉重的負擔(dān)[1]。因此，學(xué)者們一直都在尋找HIV根除或功能性治愈的方法。2012年國際艾滋病協(xié)會（International AIDS Society, IAS）發(fā)起了“邁向HIV治愈”的行動，隨后發(fā)生的“密西西比嬰兒”“波士頓病人”復(fù)發(fā)等事件打擊了人們的信心，但更加鞭策全世界的科學(xué)家們進一步地了解HIV的生物學(xué)特征、結(jié)構(gòu)學(xué)特征和動力學(xué)特征，在此基礎(chǔ)上找出它的致命弱點，進行針對性開發(fā)靶向療法，為邁向HIV治愈打下堅實基礎(chǔ)。2016年，IAS再次向全球科學(xué)家發(fā)起了“邁向HIV治愈2016”戰(zhàn)略[2]，其中關(guān)于如何耗竭潛伏感染的細胞儲存庫仍然是研究的重要環(huán)節(jié)之一。

目前已知cART不能徹底清除HIV，絕大部分cART藥物僅對復(fù)制中的病毒有效，一旦停藥HIV RNA會很快反彈。HIV以前病毒的形式持久地潛伏在如中央記憶型T細胞、造血干細胞、樹突狀細胞和單核-巨噬細胞源性細胞等一些長壽細胞中，形成病毒儲存庫。而這些細胞的組織分布各異，包括血液、骨髓、大腦、消化道相關(guān)淋巴組織、生殖道等[3]，徹底清除各個組織中的前病毒極為困難。

血腦屏障和腦內(nèi)特殊類型的細胞構(gòu)成了大腦獨立于外周組織、器官的特殊環(huán)境。一方面外界藥物難以透過血腦屏障；另一方面腦內(nèi)形成免疫豁免，HIV可在腦中低水平復(fù)制并獨立進化[4]。HIV腦內(nèi)儲存庫成為HIV耐藥和復(fù)發(fā)的源頭之一。本文將對HIV腦內(nèi)儲存庫的認識現(xiàn)狀進行回顧，并對如何耗竭這些病毒儲存庫加以探討。同時，在激活病毒儲存庫時，須要關(guān)注由此可能帶來的不良反應(yīng)，如加重HIV相關(guān)神經(jīng)認知功能紊亂。

1 HIV腦內(nèi)儲存庫

HIV儲存庫是一群受HIV感染的長壽細胞，包括靜息CD4+T細胞、骨髓干細胞、巨噬細胞、星狀細胞等，靜息CD4+T細胞是其主要代表[1]。HIV以具有復(fù)制能力的HIV DNA形式整合入受感染的細胞染色體并潛伏其中[5]。HIV在感染的早期可通過被感染的單核細胞以“特洛伊木馬”的方式入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這些被感染的單核細胞穿越血腦屏障后分化成熟為腦內(nèi)定居的巨噬細胞，通過其分泌的趨化因子軸系，繼續(xù)吸引更多的單核細胞入腦。這些細胞通過細胞間直接接觸進一步感染腦內(nèi)定居的血管旁巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞和星狀細胞。這三種細胞均是長壽細胞，半壽期為數(shù)月甚至數(shù)年。這些細胞均有較高的被感染率，如作為腦內(nèi)最主要細胞類型——星狀細胞，其受感染率可高達19％。這些細胞HIV潛伏感染形成的原因復(fù)雜，表觀遺傳調(diào)控等機制參與其中[6-7]。

由于倫理學(xué)和檢測技術(shù)的限制，無法對活體進行腦組織取材，不可能直接評價人的大腦內(nèi)受感染的細胞產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒的效能。然而一些證據(jù)間接證明中樞神經(jīng)系統(tǒng)可作為HIV的儲存庫。通過對長期接受cART并獲得病毒學(xué)應(yīng)答的感染者的尸檢發(fā)現(xiàn)，其腦內(nèi)可以檢測到HIV DNA[6]。在穩(wěn)定接受cART的HIV感染者中，約10％～23％在外周血中檢測不到HIV，但在腦脊液中仍可檢到，這一現(xiàn)象被稱為腦脊液病毒逃逸[8-9]，并且常伴有神經(jīng)學(xué)損傷。研究發(fā)現(xiàn)，長期接受cART的患者，其腦脊液中新喋呤以及可溶性CD14、IL-6、IL-8、CCL2等單核細胞免疫激活的標志物也會升高[10-11]。這些炎癥反應(yīng)說明腦內(nèi)受感染的細胞仍然存在低水平的HIV復(fù)制[10]。神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)檢查也間接證明接受cART的患者腦內(nèi)存在慢性炎癥[12]。另外，通過新的高靈敏度技術(shù)，如單拷貝檢測，使得那些原本在外周血和腦脊液中已檢測不到HIV RNA的長期接受cART的患者和精英控制者，其腦脊液中再度檢測到HIV RNA[13]。為模擬接受cART的HIV感染者的情況，目前已建立了恒河猴、大鼠、人源化小鼠等多種動物模型，證明其腦內(nèi)存在HIV RNA和HIV蛋白。這些證據(jù)均表明大腦可以作為HIV儲存庫。

由于血腦屏障的存在，使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成隔絕于外周其他組織器官的物理微環(huán)境，血腦屏障的完整性直接影響了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。同時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)還具有獨特的免疫微環(huán)境，發(fā)揮主要作用的是由血管旁巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞參與的固有免疫應(yīng)答，其次才是適應(yīng)性免疫應(yīng)答，二者共同構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫監(jiān)視[14]。正是以上兩個特征，決定了中樞神經(jīng)系統(tǒng)是實現(xiàn)HIV功能性治愈的一大障礙。

首先，大部分抗病毒藥物很難透過血腦屏障，對HIV來說形成了天然藥物屏障，由此增加了病毒耐藥突變的發(fā)生風(fēng)險[15]；其次，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的病毒較少與外周發(fā)生遺傳信息交換，而且HIV毒株嗜性也與外周的不盡相同，外周主要是嗜CD4+T細胞的毒株，而腦內(nèi)則主要是嗜單核/巨噬細胞的毒株[16]。現(xiàn)有的抗病毒藥物作用機制主要是針對T細胞內(nèi)的病毒，而對腦內(nèi)的病毒作用效果明顯不如前者。通過對HIV-1 env基因和啟動子測序研究證實腦內(nèi)存在HIV的突變體[17]。啟動子區(qū)的突變對腦內(nèi)HIV潛伏感染的形成和維持至關(guān)重要。這不但提示腦內(nèi)潛伏感染與外周CD4+T細胞中潛伏感染的形成機制不同，也影響到潛伏感染激活劑（latency-reversing agents, LRA）對腦內(nèi)病毒儲存庫的激活效果[1,18]；再次，清除腦內(nèi)病毒儲存庫的另一問題是發(fā)現(xiàn)那些被低估的HIV腦脊液逃逸現(xiàn)象。如前所述，在一部分精英控制者的腦脊液中原本用常規(guī)方法檢測不到病毒核酸，但用高靈敏度的新方法仍可檢測到[13]，這要求我們在研究清除腦內(nèi)病毒儲存庫時一定要采用高靈敏的方法去檢測腦脊液中的HIV RNA；最后，在使用cART聯(lián)合LRA策略進行清除病毒儲存庫時，由于cART不能徹底控制腦內(nèi)的被激活的病毒，還有可能誘導(dǎo)病毒耐藥的發(fā)生。

總之，由于大腦特殊的微環(huán)境，腦內(nèi)病毒儲存庫可產(chǎn)生耐藥毒株并不斷補充到體循環(huán)中，因此我們強調(diào)設(shè)法徹底清除腦內(nèi)儲存庫至關(guān)重要。同時，對接受cART治療的患者應(yīng)采用高靈敏度的方法定期檢測腦脊液中HIV RNA，以更好的評估腦內(nèi)病毒含量及新療法的效果[19]。

2 清除HIV腦內(nèi)儲存庫所面臨的困難

“Shock and kill”（趕盡殺絕）策略是目前HIV功能性治愈研究的主要策略。該策略首先使用LRA或聯(lián)合其他方法設(shè)法激活HIV儲存庫中的前病毒DNA復(fù)制，把前病毒從靜息細胞中驅(qū)趕出來；再通過聯(lián)合強化cART方案和免疫療法將新產(chǎn)生的HIV RNA殺滅，逐漸縮小甚至耗竭病毒儲存庫[20]。如果儲存庫被耗竭或足夠小，且機體的免疫系統(tǒng)足以控制HIV，即可實現(xiàn)功能性治愈。先前的研究已證實，使用LRA或聯(lián)合其他方法可以顯著的激活靜息CD4+T細胞中潛伏的HIV DNA[21]。一些方法已經(jīng)進入到臨床試驗階段[22]。但是，這些方法的有效性不僅要在靜息CD4+T細胞進行評估，更要在包括腦內(nèi)儲存庫在內(nèi)的機體其他部位的儲存庫中加以評價。然而，這一策略對腦內(nèi)儲存庫的效果可能不盡人意。

要想將潛伏感染的HIV從不同細胞儲存庫中趕出來，首先要了解HIV在不同細胞中形成潛伏感染的機制。然而這些形成機制并不相同。例如，在CD4+T細胞中，LSD1通過其自身酶活性參與HIV轉(zhuǎn)錄激活；但在小膠質(zhì)細胞中，LSD1卻通過募集多種因子錨定在啟動子區(qū)進而抑制HIV轉(zhuǎn)錄，為潛伏感染的建立發(fā)揮重要作用[23]。LSD1在不同細胞中對HIV潛伏感染的雙向調(diào)節(jié)作用說明HIV潛伏感染的形成機制復(fù)雜，因此須要有針對性地對不同的病毒儲存庫研發(fā)特異性的藥物。

另一方面，如前所述，HIV腦內(nèi)儲存庫的特點也增加了通過“趕盡殺絕”策略實現(xiàn)功能性治愈的難度。第一，中樞神經(jīng)系統(tǒng)被血腦屏障隔離，限制了藥物的通透性，因此限制了使用cART以清除再激活的HIV RNA的可能。第二，腦內(nèi)的HIV潛伏感染的細胞類型主要是星狀細胞和腦內(nèi)定居的巨噬細胞，而現(xiàn)有藥物極少能激活單核/巨噬細胞中的前病毒[24]，cART對星狀細胞中HIV復(fù)制的作用不明確，甚至可能有神經(jīng)毒性[25]。第三，中樞神經(jīng)系統(tǒng)被認為是免疫豁免部位，因此，在腦內(nèi)設(shè)法通過激活細胞毒性T細胞來清除腦內(nèi)病毒儲存庫的方法很困難，甚至對神經(jīng)細胞有害。第四，現(xiàn)有的激活方法不能阻斷病毒轉(zhuǎn)錄，通過LRA以激活腦內(nèi)病毒儲存庫的方法可能導(dǎo)致諸如Tat和gp120等神經(jīng)毒性蛋白的合成增加，而這些病毒蛋白是引發(fā)HIV相關(guān)神經(jīng)認知功能紊亂的主要因素，同時，伴隨病毒的再激活，隨之而來的是巨噬細胞及小膠質(zhì)細胞的活化，這進一步加重了神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。

3 如何克服這些困難

想要將腦內(nèi)的HIV儲存庫徹底清除極為困難，可能的方法是模擬精英控制者，盡可能地減小病毒儲存庫的規(guī)模?，F(xiàn)已證實，極早期啟動cART可以有效地限制病毒儲存庫的規(guī)模。而對于那些早已失去極早期治療機會的感染者，應(yīng)尋求其他途徑。在腦內(nèi)實現(xiàn)功能性治愈的途徑主要有以下4點。

3.1 研發(fā)針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞類型的LRA “趕盡殺絕”策略中核心是開發(fā)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)細胞有效的LRA。現(xiàn)有的LRA基本上都是針對激活CD4+T細胞，而腦內(nèi)儲存庫的形成機制與CD4+T細胞中的不同[26]。由此造成LRA對中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞的激活效果不一。先前研究曾在U1單核細胞系及原代星狀細胞和巨噬細胞中檢測了不同組蛋白去乙?；敢种苿┑募せ钚Ч鸞18,26-27]。初步研究結(jié)果表明，包括帕比司他和JQ1在內(nèi)的許多LRA在治療劑量時相對無毒并能有效的激活HIV。而另一些LAR，如雙硫侖和伏立諾他，其治療劑量對CD4+T細胞激活有效，但對中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞無效[18，26]。蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）激活劑bryostatin-1是一種非常有潛力的LRA，它既能透過血腦屏障，又能激活腦內(nèi)HIV的兩個主要靶細胞（小膠質(zhì)細胞和星狀細胞）內(nèi)PKC通路[21,28]。Bryostatin-1治療阿爾茲海默病的臨床前期試驗及治療腫瘤的臨床試驗?zāi)壳罢谶M行[29]。研究人員也測試了多種LRA聯(lián)合治療的協(xié)同效果[21]。使用小劑量的多種LRA聯(lián)合治療可能降低由單一藥物大劑量治療所帶來的不良反應(yīng)[30]。一項隊列研究通過對腦脊液的炎性標志物如新蝶呤、C反應(yīng)蛋白和IP-10的檢測表明，帕比司他無明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)，有潛力作為腦內(nèi)HIV細胞儲存庫轉(zhuǎn)錄激活劑[31]。

3.2 開發(fā)靶向于HIV轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的藥物 如前所述，一旦腦內(nèi)的HIV被激活，可導(dǎo)致病毒的神經(jīng)毒性蛋白Tat、gp120等合成增加，可加重神經(jīng)損傷。現(xiàn)階段尚無針對HIV轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的cART 藥物[32]。開發(fā)能靶向于HIV轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的方案至關(guān)重要[32-33]。具體說來，抑制HIV轉(zhuǎn)錄的方案針對兩個主要靶點：NF-κB和病毒轉(zhuǎn)錄因子Tat。NF-κB環(huán)節(jié)是炎癥反應(yīng)發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，因此以NF-κB為靶點的化合物、siRNA等不但能抑制HIV轉(zhuǎn)錄，還可能減輕腦內(nèi)的慢性炎癥反應(yīng)[34-35]。Tat是HIV轉(zhuǎn)錄的反式激活因子，不但可激活HIV轉(zhuǎn)錄，還具有直接和間接的神經(jīng)毒性，促進HIV相關(guān)神經(jīng)認知功能紊亂的發(fā)生和發(fā)展。因此靶向于Tat的治療措施也可能發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)一些海洋生物和植物提取物等天然物質(zhì)及其他合成分子可能具有抗Tat的作用[36]。例如，雙脫氧皮質(zhì)抑素A是一種從海綿中提取出的天然生物堿，被認為具有抗Tat的作用，可以抑制HIV的轉(zhuǎn)錄[37]。另一種從雷公藤中分離提取的雷公藤甲素發(fā)現(xiàn)也具有拮抗Tat的作用，其可通過增加Tat的蛋白酶體降解的方式抑制HIV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[38]?？筎at的單鏈抗體：Fc融合蛋白可直接中和Tat，發(fā)揮抑制HIV復(fù)制和神經(jīng)保護的作用[39]。DING蛋白（DING proteins, pDINGs）是一種廣泛存在于細菌、植物和動物細胞中具有高度一致性的DINGGG-序列的30～40 KDa蛋白家族。研究發(fā)現(xiàn)pDINGs也具有抑制HIV轉(zhuǎn)錄的作用，磷酸化的pDINGs 是一種神經(jīng)保護因子，可降低HIV導(dǎo)致的神經(jīng)炎性反應(yīng)[40]。我們相信隨著對這些分子化合物作用機制的深入研究，并通過新的信息工程技術(shù)、高通量篩選技術(shù)、計算機輔助設(shè)計、組合化學(xué)等新技術(shù)進行篩選、設(shè)計，將進一步提高新藥的開發(fā)能力。

3.3 提高藥物向中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腦細胞內(nèi)的遞送效能 另一個須要重視的問題是如何透過血腦屏障將藥物遞送至腦內(nèi)，并且能靶向于腦內(nèi)的病毒宿主細胞巨噬細胞和星狀細胞。增加腦內(nèi)藥物滲透，必須設(shè)法提高藥物的生物利用度和組織分布。其中重要的方法是研發(fā)藥物控釋載體，如脂質(zhì)體、分枝狀聚合物和微膠粒等，通過載體控釋技術(shù)來遞送藥物至中樞神經(jīng)系統(tǒng)并加以釋放。納米藥物聚合物具有更加出色的組織分布能力，為將來清除各種組織中的HIV儲存庫帶來了希望[41-42]。這些方法不但增加了腦內(nèi)藥物的滲透能力，也增加了藥物在星狀細胞、小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞中的分布。針對巨噬細胞內(nèi)的HIV，PI3K/Akt阻斷劑、碳水化合物結(jié)合劑、siRNAs等方法也須進一步研究[43-44]。

3.4 研發(fā)免疫療法 目前研究發(fā)現(xiàn)，通過LRA激活HIV儲存庫的方式并不能直接減小病毒儲存庫，仍須通過宿主的免疫活化來清除被激活的儲存庫，然而宿主的免疫激活不足以完成這一目標[45]。因此須要研發(fā)新的免疫治療策略來輔助減小病毒儲存庫[46]。CTL的活化有助于清除HIV感染的靜息CD4+T細胞。早先的動物研究也表明CTL在清除腦內(nèi)HIV感染的巨噬細胞中發(fā)揮重要作用。另外，CD8+T細胞應(yīng)答也對控制腦內(nèi)弓形體感染至關(guān)重要[47]。然而，過度的CTL活化卻可加重腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。如何適度控制CTL的免疫激活，使其既能達到免疫清除目的又盡量避免增加腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，是免疫治療策略的難點和挑戰(zhàn)[48]。另一種免疫治療策略是嘗試聯(lián)合抗HIV廣譜中和抗體，通過抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用實現(xiàn)病毒儲存庫的清除。目前一些在人源化小鼠中進行的研究結(jié)果表明這一途徑可能有較好的潛力[49]。補體激活調(diào)節(jié)因子CD59的拮抗劑可通過增強中和抗體和非中和抗體的抗體依賴性補體介導(dǎo)的溶細胞作用清除HIV潛伏感染的細胞[50]。

綜上所述，實現(xiàn)HIV功能性治愈的前提是最大限度的減小包括腦內(nèi)儲存庫在內(nèi)的各種形式的HIV儲存庫。縮小或清除腦內(nèi)儲存庫的基礎(chǔ)策略仍然是基于LRA聯(lián)合cART的“趕盡殺絕”策略，通過LRA激活靜息儲存庫中的前病毒并聯(lián)合cART加以清除，這一過程需要更加有效的免疫治療策略加以輔助。然而由于大腦的獨特性，使得腦內(nèi)的藥理環(huán)境、免疫環(huán)境和病毒潛伏感染的細胞類型與外周截然不同。因此須要針對腦內(nèi)的特殊細胞類型選擇靶向性的LRA和cART藥物。靶向于HIV轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的分子藥物也是未來新藥研究的方向，這對阻止因潛伏感染HIV前病毒激活所帶來的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的不良反應(yīng)至關(guān)重要。納米技術(shù)的研發(fā)將有助于增強藥物的腦內(nèi)遞送和在腦內(nèi)細胞的釋放。

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（2016-11-15 收稿 2016-12-25 修回）

（責(zé)任編委 張玲霞 本文編輯 閆晶晶）

The neglected brain reservoirs: a barrier to an HIV cure

KANG Wen, SUN Yong-tao*
Department of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an, Shaanxi 710038, China

Reducing the size of virus reservoirs is fundamental for HIV positive patients to achieve an HIV functional cure. The〝shock and kill〞strategy enables the reactivation of latent reservoirs, which will be followed by an intensive combined antiretroviral therapy (cART) or therapeutic immunization to clear the reservoirs. HIV can latently infected cells such as perivascular macrophages, microglial cells, and astrocytes in the central nervous system (CNS), and this brain reservoirs need to be eliminated. However, the CNS is a pharmacological sanctuary isolated from other parts of the body. In addition, latently infected cells in the brain are rather different from the main memory T-cells in the virus reservoirs. So it might be difficult to eliminate or reduce brain reservoirs since the CNS has these unique characteristics. In order to provide some ideas and methods for the realization of functional cure of HIV, this review will give an introduction on the existing understanding of viral reservoirs in the CNS, discuss several limitations to the eradication of brain reservoirs, and conclude the potential therapeutic implications of purging brain reservoirs.

HIV; functional cure; brain reservoir; antiretroviral therapy; latency-reversing agents; therapeutic immunization

R512.91

A

1007-8134(2016)06-0324-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.06.002

國家“十二五”科技重大專項（2014ZX10001002）；國家自然科學(xué)基金（8150050123）

710038 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科（康文、孫永濤）

孫永濤，E-mail: yongtaos@hotmail.com

*Corresponding author, E-mail: yongtaos@hotmail.com