余丹萍，李取生，王立立*，徐智敏，3，郭世鴻，3，胡　妮，陳惠君（1.暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣州市環(huán)境暴露與健康重點實驗室，廣州510632；2.廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)材料中心，廣州510632；3.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣州510632）

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缺Fe/Zn及鹽脅迫下莧菜對Cd及礦質(zhì)元素的吸收與IRT1表達(dá)的關(guān)系

余丹萍1，2，李取生1，2，王立立1，2*，徐智敏1，2，3，郭世鴻1，2，3，胡妮1，2，陳惠君1，2
（1.暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣州市環(huán)境暴露與健康重點實驗室，廣州510632；2.廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)材料中心，廣州510632；3.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣州510632）

摘要：選用Cd低累積品種白梗尖葉莧菜（B）和高累積品種花紅莧菜（H）2個莧菜品種，采用水培法分別研究了在缺Fe、缺Zn和鹽脅迫3種處理條件下2個莧菜品種對礦質(zhì)元素以及Cd的累積特征，并通過測定2個品種不同處理根部IRT1（鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的表達(dá)量，建立了缺Fe/Zn及鹽脅迫下莧菜對Cd及礦質(zhì)元素的吸收與IRT1表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果表明，3個處理組中2個莧菜品種生物量均顯著低于對照組，缺Fe以及缺Zn處理顯著促進(jìn)了2個莧菜品種對Cd以及礦質(zhì)元素的累積，而鹽脅迫顯著抑制了莧菜對Cd的累積，同時促進(jìn)了其對礦質(zhì)元素的累積（P＜0.05）。不同處理下，Zn、Fe相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)基因IRT1的表達(dá)差異顯著，IRT1表達(dá)量的增加可以促進(jìn)植物對Cd、Fe、Zn、Mn、Mg等元素的吸收（P＜0.05）。

關(guān)鍵詞：莧菜；礦物質(zhì)；鹽脅迫；IRT1

余丹萍，李取生，王立立，等.缺Fe/Zn及鹽脅迫下莧菜對Cd及礦質(zhì)元素的吸收與IRT1表達(dá)的關(guān)系[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2016, 35（2）：234-239. YU Dan-ping, LI Qu-sheng, WANG Li-li, et al. Cadmium and mineral element accumulation and IRT1 gene expression of Amaranth hybidus L. under iron/ zinc deficiencies or salt stress[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2016, 35（2）：234-239.

近年來，我國土壤重金屬污染形勢十分嚴(yán)峻，近1/5的耕地受到重金屬Cd污染，不僅造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且威脅著人們的健康[1]，而部分污染土壤鹽漬化[2]及其中Fe、Zn元素的生物有效性低[3-4]都會影響植物對Cd的吸收，對我國農(nóng)作物質(zhì)量安全構(gòu)成了進(jìn)一步威脅。有研究表明，F(xiàn)e、Zn均能與Cd產(chǎn)生交互作用影響植物對Cd的吸收累積[5]，鹽分離子不僅可以活化土壤中的Cd，也會改變植物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)Cd的能力[6-7]，因此復(fù)合脅迫的條件下植物對Cd吸收累積的機(jī)制是亟待研究的課題。

植物通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來調(diào)節(jié)其對金屬離子的吸收和體內(nèi)分配以維持細(xì)胞內(nèi)金屬離子的平衡[8-9]。目前，已報道金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中研究最多的是ZIP家族（ZRT/ IRT-like proteins），其中ZIP1、ZIP2、ZIP3、ZNT1、IRT1等已經(jīng)從植物中分離并鑒定[10]。IRT1為鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，水稻OsIRT1蛋白能夠轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+、Fe3+、Cd2+，擬南芥AtIRT1是根部Fe2+高親和性吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[11-12]。Cd為植物非必需元素，因而沒有高選擇性的蛋白通道，酵母試驗表明AtIRT1具有廣泛的底物特異性，為Cd進(jìn)入植物體內(nèi)提供了通道[13]。IRT1可高效轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+、Mn2+、Cd2+、Zn2+離子，相關(guān)研究表明鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1可高效轉(zhuǎn)運(yùn)Cd[14]。因此，從分子生物學(xué)角度探究缺Fe/Zn及鹽分脅迫等處理條件下，IRT1的表達(dá)量與Cd含量的關(guān)系，對揭示各種營養(yǎng)元素與Cd之間的交互作用機(jī)理具有重要意義。

莧菜在中國南方種植廣泛，以其豐富的食用價值倍受廣大菜農(nóng)的青睞。但莧菜容易受到Cd污染[15]，因此本研究選用莧菜作為實驗材料，從分子生物學(xué)角度探索缺Fe/Zn及鹽漬化條件下植物對Cd吸收累積的機(jī)制，以期對復(fù)合脅迫土壤的安全應(yīng)用及植物對Cd蓄積機(jī)制的完善提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料方法

1.1試驗材料

根據(jù)前期的篩選結(jié)果[16]，選取Cd低累積品種白梗尖葉莧菜（B）（廣州長合種子有限公司）和Cd高累積品種花紅莧菜（H）（廣州太和廣聯(lián)種苗行）2個廣州市常見莧菜品種，供試種子購自廣州市種子市場。

白沙：購自河源市英川有限責(zé)任公司。其理化性質(zhì)：總Cd、Zn、Mg、Fe、Mn、Na含量分別為1.038 μg· kg-1和41.12、894.3、43.25、2.125、302.0 mg·kg-1。

1.2試驗設(shè)計

將育苗板用洗凈滅菌的白沙鋪滿后置于塑料盆中，供試種子用30%雙氧水浸泡10 min后用清水沖洗數(shù)次并播種于育苗板中，進(jìn)行沙培育苗。種子發(fā)芽前澆灌適量的蒸餾水以保證種子能夠正常發(fā)芽，發(fā)芽后葉面噴灑100%霍格蘭營養(yǎng)液，在塑料盆中加入適量的蒸餾水。3 d后開始在塑料盆中澆灌100%霍格蘭營養(yǎng)液，3周后選取長勢均勻的莧菜幼苗移于水培盆進(jìn)行水培試驗。水培盆中加入100%的霍格蘭營養(yǎng)液，3 d更換一次營養(yǎng)液，經(jīng)過6 d的全營養(yǎng)液穩(wěn)定培養(yǎng)后進(jìn)行處理，共設(shè)4個處理。全液：全營養(yǎng)液+Cd；缺Fe：全營養(yǎng)液缺Fe（營養(yǎng)液中不添加Fe元素）+Cd；缺Zn：全營養(yǎng)液缺Zn（營養(yǎng)液中不添加Zn元素）+Cd；加鹽：全營養(yǎng)液鹽脅迫（添加含量為0.3%的NaCl）+Cd。其中全液為對照組，其余3組為實驗組，Cd以Cd（NO3）2·4H2O的形式加入，Cd濃度設(shè)置為0.25 μmol·L-1。每個處理3個重復(fù)，3 d換一次營養(yǎng)液，6 d后收獲植物。

1.3樣品預(yù)處理與測定方法

將收獲的植物樣品用蒸餾水洗凈，將莖葉和根部剪開，取部分根尖的鮮樣速凍后置于-80℃冰箱保存，莖葉和根部分別用濾紙包好放在烘箱中60℃烘干至恒重。稱取烘干的植物樣0.1～0.4 g于消解管中，加入10 mL硝酸微波消解（CEM corporation，MARS5），消解后將樣品定容到25 mL并用中速濾紙過濾，用于測定Cd、Fe、Zn、Na、Mn、Mg的含量。Cd的測定使用石墨爐原子吸收分光光度計（日本島津公司，AA-7000），其余金屬使用等離子發(fā)射光譜儀（美國PE公司，OPTIMA2000DV）測定。用Trizol試劑提取植物根部總RNA并通過凝膠電泳檢驗RNA的完整性，用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一條鏈，通過實時熒光定量PCR儀（BioRad，CFX96）測定IRT1的表達(dá)量。引物根據(jù)莧菜IRT1基因序列利用Oligo 7設(shè)計并由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 11.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)方差分析以及顯著性差異分析，顯著性差異分析選用鄧肯統(tǒng)計方法。

2　結(jié)果與分析

2.1缺Fe/Zn和鹽脅迫對莧菜生物量的影響

缺Fe/Zn和鹽脅迫處理下，莧菜生物量的變化如圖1所示。缺Fe、缺Zn及鹽脅迫處理下2個莧菜品種生物量均明顯低于對照組，缺Fe處理下生物量下降最為明顯，在缺Fe處理下2個品種總生物量分別下降85.43%（B）和55.89%（H）；鹽脅迫處理對植物生物量影響最小，2個品種總生物量分別下降29.83% （B）和17.21%（H）。由此可知3個處理中缺Fe對植物的生物量影響最大。B品種在3個處理組中生物量較對照組的下降率都比H品種高，缺Fe/Zn和鹽脅迫對B品種生物量的影響作用都比H品種大。

圖1　莧菜的平均鮮重Figure 1 Average fresh weight of amaranth

2.2缺Fe/Zn和鹽脅迫對莧菜礦質(zhì)元素累積的影響

由圖2可知，缺Fe、缺Zn處理下2個莧菜品種莖葉和根部的Cd含量均顯著高于對照組，而鹽脅迫處理莖葉的Cd含量顯著低于對照組。2個品種在缺Fe處理中，莖葉和根部Cd含量相對于對照組增幅均比其他處理組大，莖葉分別增加195%（B）和24% （H），而根部分別增加36%（B）和281%（H）（P＜0.05）；在缺Zn處理中，莖葉相對于對照組分別增加58% （B）和25%（H），而根部分別增加19%（B）和72%（H）；在鹽脅迫中莖葉相對于對照組分別增加16% （B）和15%（H），而根部分別減少40%（B）和增加36% （H）。在相同處理組中，B品種莖葉Cd含量相對于對照組的增幅都較H品種高，但是根部卻呈現(xiàn)相反的趨勢。

圖2　莧菜根部和莖葉中的Cd鮮重含量Figure 2 Cadmium content in roots and stems of amaranth

由表1可知，在缺Fe處理中，2個品種莖葉Zn、Mg、Fe、Mn的含量都顯著高于對照，且增加幅度較其他處理組大；缺Zn處理中Fe、Mg兩元素的含量顯著高于對照組，而Zn元素含量顯著低于對照組；鹽脅迫處理中Zn、Mg、Fe、Mn含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。H品種在4個處理中各礦質(zhì)元素的含量均高于B品種。在鹽脅迫處理中，H品種根Na含量顯著高于B品種，但是B品種莖葉Na含量顯著高于H品種（P＜0.05），并且兩品種莖葉Na的鮮重含量較對照組分別增加44.20倍（B）和16.86倍（H），根部Na的鮮重含量較對照組分別增加11.52倍（B）和20.93倍（H）。B品種莖葉Na元素的鮮重含量較對照組的增幅大于H品種，而根部表現(xiàn)出相反的趨勢。

2.3缺Fe/Zn和鹽脅迫對莧菜金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響

IRT1能夠轉(zhuǎn)運(yùn)包括Fe和Zn在內(nèi)的眾多金屬離子。根據(jù)圖3可知，3個處理組根部IRT1的表達(dá)量都比對照組高。對照組中B品種IRT1的表達(dá)量低于H品種，但是缺Fe、缺Zn處理中B品種根部IRT1的表達(dá)量顯著增加，并且高于H品種（P＜0.05）。H品種缺Fe、缺Zn處理中根部IRT1的表達(dá)量與對照組差異不顯著，而鹽脅迫處理中根部IRT1的表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖3　莧菜根部IRT1的表達(dá)量Figure 3 Expression of IRT1 in roots of amaranth

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在缺Fe/Zn條件下2個莧菜品種的生物量都較對照組明顯減少。由于Fe和Zn元素都是植物生長所必需的元素，并與植物的光合作用有關(guān)，它們的缺乏會影響植物的正常生長，且有研究表明Cd對植物的光合作用有一定的阻礙作用，因此，在Cd存在條件下，缺Fe/Zn會導(dǎo)致植物生物量的降低[17-19]。實驗過程中缺Fe處理新葉變黃，這可能是由于植物對Fe的需求量較其他必需元素大，故在缺Fe處理中因缺少Fe元素而阻礙了葉綠素的合成，新葉葉片變黃，光合速率降低[20-21]。缺Zn處理中，植物生物量減少的幅度明顯小于缺Fe。雖然大量研究表明Zn元素的缺失也會影響植物正常的光合作用，阻礙植物的正常生長[22]，但是因為植物對Zn元素的需求量小，并且實驗中植物僅缺Zn 6 d，時間較短并未表現(xiàn)出明顯的病癥，所以生物量降低幅度不大。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下2個莧菜品種的生物量較對照組都有所降低。趙可夫[23]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會對植物造成滲透脅迫和離子脅迫，其中滲透脅迫造成植物吸水困難，而離子脅迫對植物代謝功能產(chǎn)生毒害，從而影響植物的正常生長，導(dǎo)致生物量降低。因此，在Cd與缺Fe、Cd與缺Zn、Cd與鹽脅迫對植物的雙重毒害作用下，3個處理組的植株生長受到不同程度的抑制，生物量都比對照組明顯減少。

表1　兩個莧菜品種莖葉、根部礦質(zhì)元素的鮮重含量Table 1 Content of mineral elements in stems and roots of amaranth

通過對兩個莧菜品種莖葉和根部Cd含量的測定，發(fā)現(xiàn)在缺Fe、缺Zn處理中植物莖葉和根部Cd含量較對照組顯著增加。有研究表明Cd與Fe、Zn的吸收都存在拮抗作用，Cd可以通過Fe和Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)通道進(jìn)入植物體內(nèi)[14，24-25]，因此在缺Fe、缺Zn處理中Fe元素和Zn元素的缺失促使大量的Cd進(jìn)入植物體內(nèi)，使植物莖葉大量累積Cd。而研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫處理中兩個品種莖葉Cd含量都較對照組有所降低。大量研究表明鹽分離子可以通過增加土壤中Cd的移動性和生物可利用性來促進(jìn)植物對重金屬的累積[26]，然而在水培條件下NaCl中的Cl-可以與Cd2+形成CdCl2-nn，植物對Cd2+的吸收效率比CdCl2-nn高，因此在鹽脅迫中植物地上部Cd含量較對照組要低[6]。在鹽脅迫處理中，由于處于高鹽度的環(huán)境中，植物通過大量吸收環(huán)境中的水分來降低體內(nèi)的鹽分濃度，植物體內(nèi)水分可能進(jìn)一步增加了金屬的可移動性，從而促進(jìn)了金屬元素從根部向莖葉的轉(zhuǎn)移，因此在鹽脅迫處理中莖葉中Fe、Mg、Zn以及Mn等金屬元素的含量絕大多數(shù)較對照組要高。本研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫處理中B品種莖葉Na、Cd的鮮重含量較對照組的增幅大于H品種，而根部表現(xiàn)出相反的趨勢。相關(guān)研究表明植物把過量的鹽分離子隔離在對其生命活動影響小的部位，從而減少鹽分的毒害作用[27-28]。H品種將鹽分和Cd截留在根部，減少向莖葉的轉(zhuǎn)移從而減少鹽分對其生長的毒害，因此H品種比B品種耐鹽性更強(qiáng)。兩個莧菜品種根部礦質(zhì)元素的含量在不同處理組之間變化較為復(fù)雜，則是由于根部不僅是重金屬吸收的部位也是重金屬轉(zhuǎn)移的部位，不同品種之間的重金屬累積能力也存在諸多差異。

IRT1為Fe離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，在缺Fe條件下主要在根部外皮層表達(dá)，將Fe和其他金屬從根外轉(zhuǎn)運(yùn)至表皮細(xì)胞內(nèi)[30]。本研究對照組中H品種IRT1的表達(dá)量高于B品種，是由于Cd通過IRT1進(jìn)入了植物體內(nèi)。有研究表明IRT1可能是莧菜吸收Cd的一個關(guān)鍵基因[31-32]。在本研究缺Fe、缺Zn處理中，2個莧菜品種根部IRT1的表達(dá)量都有所增加，并且這2個處理組中莖葉、根部Cd含量都顯著增加。Lee等[13]發(fā)現(xiàn)缺Fe脅迫能夠誘導(dǎo)擬南芥根部IRT1的轉(zhuǎn)錄。故筆者認(rèn)為缺Fe、缺Zn誘導(dǎo)了IRT1的表達(dá)。Nakanishi等[11]發(fā)現(xiàn)IRT1的選擇性低，可以轉(zhuǎn)運(yùn)眾多二價金屬離子，IRT1的大量表達(dá)也會引起植物對于其他金屬元素的吸收增加，故本研究中缺Fe、缺Zn處理Fe、Zn、Mg、Mn元素的含量顯著增加。鹽脅迫處理中，莖葉與根部Na元素的含量急劇上升，其他的礦質(zhì)元素含量顯著增加但是幅度不大，而兩個品種根部IRT1的表達(dá)量較對照組都顯著增加（P＜0.05）。由此推論Na元素可能通過IRT1所控制的蛋白通道進(jìn)入植物體，雖然大量Na離子的存在促進(jìn)了植物IRT1的大量表達(dá)，但是Na離子占據(jù)了通道，因而礦質(zhì)元素含量增幅不明顯，Cd含量顯著減少。

對照組中，H品種IRT1表達(dá)量高于B品種，在缺Fe、缺Zn處理組中，B品種IRT1表達(dá)量顯著增加，其莖葉Cd累積量也較對照組顯著增加，而H品種IRT1表達(dá)量增加不顯著（P＞0.05）。因此可以推斷，IRT1的表達(dá)過量可以增加植物對Cd的吸收累積，但I(xiàn)RT1并非植物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)Cd的唯一關(guān)鍵基因。陳艷芳等[33]證明HMA4也是植物轉(zhuǎn)運(yùn)Cd的一個重要基因。在缺Fe、缺Zn處理組B品種IRT1大量表達(dá)，H品種中表達(dá)量增加幅度不大，因而缺Fe、缺Zn能夠在更大程度上刺激Cd低累積品種IRT1的表達(dá)。

4　結(jié)論

（1）Cd低累積品種莧菜（B）對缺Fe/Zn及鹽脅迫的耐性較差，在缺Fe環(huán)境中種植會極大地增加作物的健康風(fēng)險，且在受污染土壤中其生物量較少，不適宜污染地區(qū)農(nóng)業(yè)種植。Cd高累積品種莧菜（H）的生物量受到復(fù)合污染的影響較小，并表現(xiàn)出了較高的耐鹽性，可以在鹽漬化土壤中種植。

（2）缺Fe/Zn可以促進(jìn)Fe轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1的表達(dá)，而IRT1的表達(dá)過量可以增加植物對Cd的吸收累積，因此在關(guān)注土壤Cd污染對農(nóng)作物質(zhì)量安全影響時，不僅要關(guān)注污染土壤中Cd的含量，也應(yīng)該關(guān)注土壤中礦質(zhì)元素的含量。

（3）鹽分環(huán)境中大量Na元素占據(jù)IRT1，抑制了植物對Cd的吸收，但是在鹽漬土壤中植物對Cd的吸收是一個復(fù)雜的過程，還需要進(jìn)一步的研究。

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Cadmium and mineral element accumulation and IRT1 gene expression of Amaranth hybidus L. under iron/ zinc deficiencies or salt stress

YU Dan-ping1,2, LI Qu-sheng1,2, WANG Li-li1,2*, XU Zhi-min1,2,3, GUO Shi-hong1,2,3, HU Ni1,2, CHEN Hui-jun1,2
（1.School of Environment, Jinan University, Key Laboratory of Environmental Exposure and Health of Guangzhou City，Guangzhou 510632, China; 2.Guangdong provincial research center of environmental pollution control and remediation material, Guangzhou 510632, China；3.College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China）

Abstract：Previous research has showed that iron-regulated transporter 1（IRT1）gene plays an important role in the accumulation and transfer of metals in plants. Here a low Cd-accumulating cultivar Baigenjianye（B）and a high Cd-accumulating cultivar Huahong（H）were used to investigate the characteristics of mineral element and Cd accumulation by and IRT1 expression level in roots of Amaranth hybidus L. under iron（Fe）or zinc（Zn）deficiencies or salt stress. Quantitative PCR was used to determine the expression level of IRT1. Biomass of two cultivars obviously decreased in the treatments, with the greatest reduction observed in Fe deficiency. The accumulation of Cd and mineral elements significantly（P＜0.05）increased under Fe and Zn deficiency treatments. However, salt stress showed a significant（P＜0.05）inhibiting effect on Cd accumulation but a significant（P＜0.05）promotion on the accumulation of mineral elements. The concentrations of Cd, Fe, Zn and Mg, and the expression of gene IRT1 in root protoplasts were obviously higher in high Cd- accumulating cultivar Huahong（H）than those in low Cd-accumulating cultivar Baigenjianye（B）. Furthermore, elevated expression levels of IRT1 promoted the concentrations of Cd, Fe, Zn and Mg in stems and leaves. Therefore, while Cd concentration in crops is concerned, the content of minerals in the soil should be paid attention to at the same time.

Keywords：amaranth; minerals; salt stress; IRT1

*通信作者：王立立E-mail：towanglili@163.com

作者簡介：余丹萍（1989—），女，湖北孝感人，碩士研究生，主要研究方向為環(huán)境修復(fù)技術(shù)與應(yīng)用。E-mail：1285950415@qq.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（41371321）；廣東省產(chǎn)學(xué)研項目（2013B0906001）

收稿日期：2015-10-16

中圖分類號：X503.23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）02-0234-06

doi:10.11654/jaes.2016.02.004