劉海龍，王玉軍，宣　亮，周東美，宋吟玲（1.蘇州科技學院環(huán)境科學與工程學院，蘇州15009；.中國科學院南京土壤研究所土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，南京10008）

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土壤基本理化性質(zhì)對外源鎘蚯蚓慢性毒性的影響

劉海龍1，2，王玉軍2*，宣亮2，周東美2，宋吟玲1*
（1.蘇州科技學院環(huán)境科學與工程學院，蘇州215009；2.中國科學院南京土壤研究所土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，南京210008）

摘要：為了給污染土壤生態(tài)風險評價和構(gòu)建土壤生態(tài)篩選基準提供基礎參考數(shù)據(jù)，參考經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）頒布的蚯蚓慢性毒性試驗方法，研究了鎘在我國18種典型土壤中對赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）的慢性毒性。結(jié)果表明，鎘在不同類型土壤中對蚯蚓產(chǎn)繭量最大無影響濃度NOEC變化范圍為10～100 mg·kg-1，半數(shù)有效抑制濃度EC50變化范圍為66.5～263.5 mg·kg-1。土壤基本性質(zhì)顯著影響著鎘的生物毒性，通過對EC50與土壤的主要理化性質(zhì)逐步多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)土壤pH值和有機質(zhì)含量與EC50呈顯著正相關(guān)關(guān)系，黏粒與EC50呈顯著負相關(guān)關(guān)系，三種因子共同控制了EC50預測回歸模型變異的89.1%。同時分析不同類型土壤中蚯蚓體內(nèi)鎘積累量變化可知，土壤pH越高，有機質(zhì)含量越高，土壤中鎘生物有效性就越低。

關(guān)鍵詞：鎘；土壤；赤子愛勝蚓；慢性毒性

劉海龍，王玉軍，宣亮，等.土壤基本理化性質(zhì)對外源鎘蚯蚓慢性毒性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2016, 35（2）：225-233.

土壤重金屬污染是近年來國內(nèi)外普遍關(guān)注的環(huán)境問題，2014年環(huán)境保護部和國土資源部共同頒布了《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》[1]。公報指出，全國土壤污染嚴重，點位超標率為16.1%，農(nóng)田土壤狀況尤其糟糕，其點位超標率高達19.4%。在所有污染物當中，重金屬污染最為嚴重，占比82.8%，其中鎘排在第一位，我國土壤鎘點位超標率達7.0%；耕地土壤中主要污染物排在第一位的也是鎘，我國土壤鎘污染越來越受到大家的重視。鎘進入土壤后，會在土壤中積累，并可以通過食物鏈在動植物體內(nèi)傳遞，鎘在生物體內(nèi)長期積累會對生物體造成極大的危害[2-5]，因此開展土壤鎘污染研究已迫在眉睫。

歐美許多國家先后頒布了針對鎘污染土壤的質(zhì)量標準，我國也于1996年制定土壤鎘污染三級標準，用于生態(tài)風險評估[6-9]。然而由于不同種類土壤的理化性質(zhì)不同，重金屬鎘的毒性有很大差別[10-12]。因此，及時開展基于不同類型土壤中鎘生態(tài)毒理的研究，了解其毒性差異及作用機理，對于鎘的生態(tài)篩選值制定及風險評估均有重要意義。

我國土壤種類眾多，不同土壤之間性質(zhì)相差很大，如土壤pH變化范圍大致為4.0～9.0，有機質(zhì)含量也有很大差異，其含量范圍大致為3.0～132 g·kg-1[13]。目前，基于我國不同土壤類型的污染物生態(tài)毒理數(shù)據(jù)還相對匱乏，已獲得的可用于生態(tài)效應評價的數(shù)據(jù)多針對國外土壤和物種，對我國土壤和生物的適用性有待評估。因此，需要及時開展生態(tài)毒理試驗，以便補充在環(huán)境標準修訂過程中所缺失的毒理數(shù)據(jù)[14]。目前我國土壤鎘污染生態(tài)毒理研究主要集中在單一田間土壤或者人工土壤的急性實驗研究[15-17]。相比急性毒性試驗的致死效應，慢性毒性試驗對生物體繁殖的影響更能反映出土壤中重金屬的實際毒性[18-19]，因為重金屬進入土壤中，本身毒性穩(wěn)定需要一個過程，而急性試驗時間太短，不能準確反映出重金屬的實際毒性。

作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，蚯蚓可以通過食物鏈吸收土壤中重金屬[20]并在體內(nèi)大量積累，對生長和生殖產(chǎn)生影響，進而致死，因此蚯蚓已經(jīng)成為監(jiān)測土壤重金屬污染的重要指示生物[21-22]。本研究選用我國18種典型土壤，測定鎘在不同土壤中對赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）的慢性毒性，揭示土壤理化性質(zhì)對鎘毒性和生物有效性的重要影響，研究結(jié)果可為土壤鎘污染生態(tài)風險評估提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料和方法

1.1試劑和材料

試驗所用Cd（Cl）2·2.5H2O為國產(chǎn)分析純試劑。

試驗用蚓為赤子愛勝蚓，購自江蘇句容蚯蚓養(yǎng)殖基地，是ISO和OECD推薦使用蚓種，對污染物中度敏感。蚯蚓買回后放于人工培養(yǎng)箱中，在（20±2）℃于供試土壤中培養(yǎng)馴化兩周，適當添加牛糞作為食物。實驗選用行為活潑、體色鮮亮、體重300～600 mg、生長期2～3個月、個體相對均勻的成熟蚯蚓。

18種供試土樣采集覆蓋我國華東、西南、華南、華中、華北、東北六大地理分區(qū)，為0～20 cm耕層土壤，具體采樣點分布和相應的土壤類型見圖1。樣品采回后風干、研磨，過5 mm篩備用。土壤Cd背景濃度和土壤主要理化性質(zhì)（pH、有機質(zhì)、粘粒、陽離子交換量CEC、持水量）測定結(jié)果見表1，具體分析方法參照《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》[23]。

圖1　試驗土壤的類型和采集地點Figure 1 Soil types and sampling sites

1.2蚯蚓慢性毒性試驗

蚯蚓慢性毒性試驗參考OECD（OECD Guideline 222）[24]。試驗之前蚯蚓需在玻璃皿中清腸24 h，然后用去離子水洗凈，取10條稱重，以保證加進去的蚯蚓質(zhì)量基本一致。鎘濃度設置參考急性毒性試驗的數(shù)據(jù)，其最高濃度不超過急性試驗最低致死濃度，每個土壤對應設置6個濃度，每個濃度設置4個平行。稱取一定量的Cd（Cl）2·2.5H2O于50 mL抗凝管中配成水溶液，加入到含有500 g供試土壤的1 L塑料盆中，充分混勻，調(diào)節(jié)土壤水分含量為最大含水量的60%（定期稱量容器來監(jiān)測土壤的含水量，必要時添加適量水分，以保持一定的濕度），平衡一周后用于試驗，土壤中鎘的含量范圍是0～1000 mg·kg-1。每盆加10條蚯蚓，待蚯蚓爬進去以后，添加5 g牛糞于土壤表面，然后用保鮮膜封住盆口以防止蚯蚓爬出，并在保鮮膜上用醫(yī)用小鑷子扎幾個小孔用以通氣。溫度設置為（20±1）℃，濕度控制在75%左右，光照強度設在400～800 lx。每周添加一次牛糞，每盆添加5 g。4周后將成蚓取出。用濕篩法將土壤中的蚓繭挑出和計數(shù)（上面2.0 mm和下面1.0 mm過兩層篩），通過統(tǒng)計土壤中存在的蚓繭數(shù)來評估鎘對蚯蚓繁殖的影響[25]。在P=0.05的顯著水平上采用Dunnett's檢驗方法對處理組和對照組的繁殖輸出進行多重比較，以確定最大無影響濃度NOEC[26]，同時分析鎘對蚯蚓產(chǎn)繭量的抑制率，以確定半數(shù)有效抑制濃度EC50。

表1　試驗土壤的主要理化性質(zhì)Table 1 Main physico-chemical properties of tested soils

1.3蚯蚓體內(nèi)鎘含量測定

暴露后的蚯蚓用去離子水洗凈，清腸24 h，再次用去離子水洗凈，用濾紙吸干表面水分，放于-70℃冰箱中冷凍，然后用凍干機凍干，稱量蚯蚓干重。取整條蚯蚓放于100 mL三角瓶中，加入15 mL濃硝酸并分3次加入2 mL雙氧水，加上小漏斗，放置過夜；150℃消煮2 h，在此期間加入一定量雙氧水，升高溫度到200℃左右消煮，直至瓶中只剩少量澄清溶液為止。稍冷后加入5 mL 2 mol·L-1的鹽酸定容至25 mL容量瓶中，用原子吸收分光光度計測定（F-AAS；Hitachi Z-2000，Japan）。同時測定龍蝦標準物質(zhì)（TORT-2，Notional Research Council Canada）中重金屬鎘的含量，回收率可以達到95%以上。

2　結(jié)果與分析

2.1土壤中鎘對蚯蚓繁殖的影響

整個實驗過程中，實驗組和對照組均沒有出現(xiàn)成蚓死亡現(xiàn)象。以產(chǎn)繭量作為參數(shù)可以看到，隨著土壤鎘濃度增加，蚓繭數(shù)逐漸降低（圖2）。鎘在不同土壤中對蚯蚓產(chǎn)繭量的NOEC并不相同（表2），以在鷹潭紅壤中為最低（10 mg·kg-1），在保定潮土中最高（100 mg·kg-1）。鎘在18種土壤中對赤子愛勝蚓產(chǎn)繭量的EC50差異也比較大（表2），在鷹潭紅壤中為66.52 mg·kg-1，而在保定潮土中為263.48 mg·kg-1，兩者之間相差約200.00 mg·kg-1。可以利用鎘對蚯蚓產(chǎn)繭量EC50來判斷鎘對蚯蚓的慢性毒性大小，其結(jié)果為：鷹潭紅壤＞樂山紫色土＞盱眙黃棕壤＞長沙水稻土＞韶關(guān)赤紅壤＞肇慶磚紅壤＞都江堰水稻土＞泉州水稻土＞河池紅壤＞宜昌水稻土＞沈陽棕壤＞濰坊褐土＞崇左磚紅壤＞合肥水稻土＞寧波水稻土＞貴陽黃壤＞湘鄉(xiāng)水稻土＞保定潮土。

2.2土壤主要理化性質(zhì)與鎘慢性毒性之間的關(guān)系

圖2　 28 d時鎘對赤子愛勝蚓產(chǎn)繭量的影響Figure 2 Effect of cadmium on cocoon production of Eisenia fetida after 28 d exposure

通過EC50與土壤主要的理化性質(zhì)逐步多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)pH值（P＜0.001）、有機質(zhì)含量（P=0.006）、黏粒含量（P= 0.015）顯著影響鎘對蚯蚓的慢性毒性，其中pH值是最主要影響因素。以pH值、有機質(zhì)含量、黏粒含量為因子，得出一個包含土壤理化性質(zhì)的回歸方程，此方程可以解釋EC50回歸模型變異的89.1%（表3）。同時，對EC50的實測值和預測值作圖（圖3，1：1完全匹配），發(fā)現(xiàn)R2可以達到0.874 8。這表明，構(gòu)建的預測模型能夠準確預測不同土壤中鎘對蚯蚓的慢性毒性。

續(xù)圖2 28 d時鎘對赤子愛勝蚓產(chǎn)繭量的影響Continued figure 2 Effect of cadmium on cocoon production of Eisenia fetidaafter 28 d exposure

表2　暴露28 d時鎘對赤子愛勝蚓產(chǎn)繭量的EC50、NOEC（mg·kg-1）Table 2 EC50and NOEC of cadmium for cocoon production of Eiseniafetida after 28 d exposure（mg·kg-1）

表3　土壤主要理化性質(zhì)與鎘對蚯蚓產(chǎn)繭量EC50（mg·kg-1）之間的簡單和多元回歸方程Table 3 Simple and multiple linear regressions between EC50（mg·kg-1）of cadmium for cocoon production of Eisenia fetida and soil properties

2.3土壤中蚯蚓體內(nèi)鎘積累量變化

從上述18種土壤中選出鷹潭紅壤、韶關(guān)赤紅壤、沈陽棕壤、保定潮土4種土壤，分析28 d蚯蚓體內(nèi)鎘積累量。如圖4可見，蚯蚓體內(nèi)鎘積累量隨著土壤中的鎘濃度增加而增加，且體內(nèi)鎘含量與4種土壤添加鎘的濃度均顯著正相關(guān)（P＜0.05），R2分別為0.979、0.988、0.991、0.993。同時比較這4種土壤添加同樣濃度外源鎘時蚯蚓體內(nèi)鎘含量，發(fā)現(xiàn)鷹潭紅壤＞韶關(guān)赤紅壤＞沈陽棕壤＞保定潮土（圖5）。土壤pH和有機質(zhì)顯著影響Cd的生物有效性，土壤pH越高，有機質(zhì)含量越高，其生物有效性就越低。這與我們前面研究18種土壤中鎘對蚯蚓慢性毒性大小是一致的。蚯蚓體內(nèi)鎘積累量越高，對機體產(chǎn)生的毒性越大，蚯蚓的繁殖能力也就越低。

圖3　鎘對蚯蚓產(chǎn)繭量的實測EC50與預測EC50之間的關(guān)系Figure 3 Correlation between measured and predicted EC50ofcadmium for cocoon production of Eiseniafetida

3　討論

關(guān)于不同類型土壤中重金屬鎘的毒性差異已有一些報道。宋文恩等[27]研究了鎘在8種不同性質(zhì)的土壤中對T167水稻的生長毒性，發(fā)現(xiàn)鎘在不同類型土壤中抑制根伸長的EC10范圍為1.40～5.25 mg·kg-1，最大相差275.0%，EC50為17.83～46.93 mg·kg-1，最大相差163.2%。余淑娟等[28]研究了8種不同性質(zhì)的土壤中添加外源鎘對番茄根系的毒害效應，發(fā)現(xiàn)鎘抑制根伸長的EC20為0.26～11.61 mg·kg-1。本研究結(jié)果與先前的研究結(jié)果是一致的，18種土壤中鎘對蚯蚓產(chǎn)繭量產(chǎn)生抑制作用的EC50為66.5～263.5 mg·kg-1（表2）。

先前有學者發(fā)現(xiàn)，土壤pH、陽離子交換量、有機質(zhì)含量是影響土壤鎘毒性的主要因素[27]。余淑娟等[28]認為，土壤pH是影響番茄根長的主要土壤性質(zhì)，土壤有機質(zhì)含量是影響番茄根系生物量的主要土壤性質(zhì)，這一觀點在研究不同土壤中鎘的有效態(tài)含量時得到了進一步證實[29]。Rafiq等[30]認為土壤pH是影響鎘毒性和生物有效性的主要因子。本研究結(jié)果表明，pH值、有機質(zhì)含量和粘粒含量是影響鎘對蚯蚓慢性毒性的主要因素。

比較4種土壤中蚯蚓的體內(nèi)鎘積累量發(fā)現(xiàn)，蚯蚓體內(nèi)鎘積累量隨著土壤中鎘濃度的增加而增加，且體內(nèi)鎘含量與4種土壤添加鎘的濃度均顯著正相關(guān)（P＜0.05），但是當土壤中鎘濃度較高時，蚯蚓體內(nèi)鎘積累量降緩。這可能是蚯蚓暴露于高濃度的污染物中，其自身活性降低，進而減少了對污染土壤的攝入，這與先前的研究結(jié)果也是一致的。賀萌萌[31]研究北京潮土中蚯蚓對鎘的吸收和富集發(fā)現(xiàn)，隨著土壤中鎘濃度的升高，蚯蚓體內(nèi)鎘的含量先上升后趨于穩(wěn)定或者略有降低。本研究比較這4種土壤添加同樣濃度外源鎘時蚯蚓體內(nèi)含量發(fā)現(xiàn)：鷹潭紅壤＞都江堰水稻土＞崇左磚紅壤＞保定潮土（圖5）。蚯蚓體內(nèi)鎘積累量越高，對機體產(chǎn)生的毒性越大，蚯蚓的繁殖能力也就越低。

圖4　土壤鎘濃度與蚯蚓體內(nèi)鎘濃度的回歸關(guān)系Figure 4 Regressions between cadmium concentration in soils and in Eisenia fetida

圖5　同樣濃度外源鎘時4種土壤中蚯蚓體內(nèi)鎘積累量Figure 5 Accumulation of Cd by Eisenia fetida exposed to four soils for 28 d

土壤老化會對重金屬毒性產(chǎn)生很大的影響，這一點已經(jīng)得到普遍的證實。先前，劉彬等[32]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)180 d老化后土壤中重金屬鎘對水稻生長毒性相對14 d老化處理顯著降低[32]。本研究土壤中外源添加鎘以后只平衡一周用于試驗，對于平衡不同時間（1、14 d、一個月乃至更長的時間）鎘對蚯蚓的生殖毒性差異，有待于進一步研究。

4　結(jié)論

土壤pH值、有機質(zhì)含量和黏粒含量是影響鎘對蚯蚓慢性毒性的主要因素，三者的變化解釋了蚯蚓產(chǎn)繭半抑制濃度EC50回歸模型變異的89.1%。土壤pH和有機質(zhì)含量等因素也顯著影響鎘的生物吸收，土壤pH越高，有機質(zhì)含量越高其生物有效性就越低。

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Effects of soil physico-chemical properties on chronic toxicity of cadmium to earthworm Eisenia fetida

LIU Hai-long1,2, WANG Yu-jun2*, XUAN Liang2, ZHOU Dong-mei2, SONG Yin-ling1*
（1.School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China; 2.Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation，Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008，China）

Abstract：The effects of soil physico-chemical properties on the chronic toxicity of cadmium（Cd）to earthworm were investigated in 18 soils spiked with Cd by employing the methods of Organization for Economic Co-operation and Development（OECD）. Results showed that Cd toxicity to E. fetida differed in different soils. No observed effect concentrations（NOEC）of Cd varied from 10 to 100 mg·kg-1. The Cd concentration for 50% of maximal inhibition effect（EC50）of cocoon production ranged from 66.5 to 263.5 mg·kg-1. Significant positive correlations were observed between soil pH, organic matter content and cadmium EC50, while significant negative correlation was present between clay content and cadmium EC50. These three factors accounted for 89.1% of variance for cadmium EC50. The bioavailability of Cd was lower in soil with higher pH and more soil organic matter, which was in accordance with the results of the inhibition of cocoon production experiments. The Cd ecotoxicity data generated in the current study may provide useful reference information for the environmental risk assessment of Cd contaminated soils and the development of soil screening values.

Keywords：cadmium; soils; Eisenia fetida; chronic toxicity

*通信作者：王玉軍E-mail：yjwang@issas.ac.cn

作者簡介：劉海龍（1988—），男，碩士研究生，主要從事重金屬的土壤毒理學研究。E-mail：liuhailong179350@sina.com

基金項目：國家環(huán)保部公益性項目（20140941）；國家自然科學基金（41422105）；江蘇省自然科學基金（BK20130050）

收稿日期：2015-09-08

中圖分類號：X503.22

文獻標志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）02-0225-09

doi:10.11654/jaes.2016.02.003