詹亞斌，馬立安

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

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生物修復(fù)石油污染土壤研究進(jìn)展

詹亞斌，馬立安

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

石油作為一種重要的能源，在被大量開采、運輸和使用的同時，帶來了嚴(yán)重的污染。利用微生物修復(fù)與降解石油烴類污染物成為當(dāng)前治理石油污染最為理想的有效方法。介紹了營養(yǎng)成分、接種量、pH、石油含量、溫度、培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)等對降解過程的影響以及微生物在修復(fù)石油污染土壤中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

石油污染；石油降解菌；微生物修復(fù)

石油作為現(xiàn)代工業(yè)的命脈，已被全世界廣泛使用。石油在開采、運輸、加工、儲存過程中不可避免地會發(fā)生石油泄露事故，造成土壤及水體的嚴(yán)重污染[1]。石油進(jìn)入土壤之后，會破壞土壤結(jié)構(gòu)，影響土壤通透性，改變土壤理化性質(zhì)。石油若是進(jìn)入到地下水，就會污染地下水源，影響生活、生產(chǎn)用水，從而危害人類的健康。同時，石油中的可溶性成分溶解到水中會形成持久性污染，增加了修復(fù)的難度[2,3]。石油污染情況日益嚴(yán)重，世界各國的科研工作者都十分重視石油污染土壤的修復(fù)技術(shù)研究，各國紛紛制定土壤修復(fù)計劃[4]。

生物修復(fù)(主要指微生物修復(fù))是一種新興清潔技術(shù)，與物理、化學(xué)修復(fù)污染土壤技術(shù)相比，它具有成本低、不破壞生長所需要的土壤環(huán)境、操作簡單、處理效果好、無二次污染等特點，越來越引起人們的關(guān)注。早在1989年，美國阿拉斯加海域受到大面積石油污染后，首次大規(guī)模應(yīng)用生物修復(fù)技術(shù)，這是生物修復(fù)技術(shù)發(fā)展的里程碑[5]。國內(nèi)的研究起步較晚，到20世紀(jì)90年代，才有油區(qū)開展石油污染土壤修復(fù)技術(shù)研究[6]。

生物修復(fù)技術(shù)是在生物降解的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，可以通過環(huán)境因素的最優(yōu)化而加速自然生物降解速率。生物修復(fù)技術(shù)被劃分為原位生物修復(fù)(投菌法、生物培養(yǎng)法、生物通氣法及地耕處理等)[7]和異位生物修復(fù)(預(yù)制床法、厭氧處理法、堆肥法及生物反應(yīng)器等)[8]2種。原位生物修復(fù)費用較低，但較難控制。Misshra等[9]采用投加微生物加營養(yǎng)物質(zhì)的原位生物修復(fù)技術(shù)對4000m2的石油污染土壤進(jìn)行修復(fù)，結(jié)果證明是可行的。陳立等[10]采用原位生物修復(fù)技術(shù)修復(fù)陜北石油開采區(qū)的石油污染土壤，證明該修復(fù)技術(shù)在陜北黃土區(qū)石油污染土壤修復(fù)的有效性。原位生物修復(fù)方法難以滿足要求時，異位生物修復(fù)技術(shù)就成為一個重要的選擇。將污染土壤移離原地放入池子，投加菌種、營養(yǎng)物，還可以調(diào)節(jié)pH或者加入碎秸稈、麩皮增加污染物中的空隙，這樣有利于微生物對污染物的降解。張紅巖等[11]利用自行設(shè)計生物堆肥設(shè)備對廢棄油基鉆井泥漿進(jìn)行為期90d的生物堆肥試驗。研究發(fā)現(xiàn)“廢棄油基鉆井泥漿+鋸末+營養(yǎng)物+微生物”堆肥方案的處理效果最佳，石油類降解率高達(dá)87.0%。

1 石油降解菌的篩選與分離

土壤中存在著大量的能夠利用有機物的微生物，主要有細(xì)菌、真菌、放線菌等，它們具有氧化分解有機物的能力。在許多條件下，降解菌馴化時間長、生長速度慢、代謝活性不高，并且很不穩(wěn)定，因此篩選一些穩(wěn)定高效降解污染物的菌種，是生物修復(fù)的必然要求。

石油組成成分十分復(fù)雜，目前已分析出大約 600 種烴類，還有數(shù)千種組分無法辨認(rèn)[12]，單一微生物不可能完全完成石油的降解過程，必須通過多種不同功能的微生物共同作用，構(gòu)建復(fù)合菌群，才能盡可能地實現(xiàn)石油污染物的完全降解。不同菌株之間往往存在協(xié)同與拮抗作用，在構(gòu)建復(fù)合菌群時，必須考慮菌株之間的相互關(guān)系。將降解不同組分的菌株復(fù)配在一起，提高菌群對石油降解的效率。李寶明等[13]從勝利油田井、煉油廠附近以及煉油廠排污口采集石油污染土壤，篩選得到236株能在以石油作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長的石油降解菌株，在構(gòu)建菌群時發(fā)現(xiàn)，用4株單菌構(gòu)建的菌群降解效果最好，5d內(nèi)石油降解率可以達(dá)到55.5%，比單一菌株在相同條件下降解率提高了15.5%。

2 影響微生物降解石油的因素

總石油烴(TPH)的微生物降解是一個極其復(fù)雜的過程，其降解效率不僅僅取決于微生物的群落和組成，還與TPH存在的數(shù)量和狀態(tài)、周圍環(huán)境等眾多因素有關(guān)。在篩選過程中，有許多因素會影響微生物對石油的降解率。其中主要包括營養(yǎng)成分、接種量、pH、溫度、石油含量、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速等。土壤的結(jié)構(gòu)、母質(zhì)、含水率也對微生物的降解率有很大的影響，可以適當(dāng)?shù)靥砑訝I養(yǎng)物質(zhì)，例如添加桔梗木屑擴大土壤孔隙度，添加適量水分保障微生物快速生長繁殖，以便達(dá)到好的降解效果[10]。

2.1 營養(yǎng)成分

石油污染土壤中有機碳含量很高，氮磷含量很少。為了達(dá)到較好的修復(fù)效果，在向石油污染土壤添加氮(N)、磷(P)等營養(yǎng)物時，必須首先確定營養(yǎng)鹽的形式、濃度以及適當(dāng)?shù)谋壤＿x擇合適的培養(yǎng)基配方，有利于降解菌篩選、分離和馴化工作的開展。

無機鹽構(gòu)成細(xì)胞和酶的組成成分、酶的激活劑以及維持適宜的滲透壓，鹽分主要通過影響降解微生物的代謝活性來影響石油降解效率。李燕妮[14]在試驗中發(fā)現(xiàn)高濃度鹽分含量對微生物降解石油有很大的抑制作用，即隨著鹽分含量的增加，微生物對石油的降解性能逐漸下降。

同一油田中篩選的石油降解菌，其耐鹽度也是有所差異的。張帆[15]篩選了5株菌，在研究中發(fā)現(xiàn)1株菌的最適鹽濃度為0，3株菌的最適鹽濃度為0.5%，還有一株菌的最適鹽濃度為1%。在高于或者低于最佳鹽度時，各菌株的生物量和降解率都明顯降低。

有些石油污染土壤含鹽量較高，為此，必須篩選高效耐鹽石油降解菌。吳濤[16]從黃河三角洲鹽漬化石油污染土壤中分離出2株高效耐鹽石油降解菌，經(jīng)鑒定為惡臭假單胞菌和沙雷氏菌，耐鹽范圍分別為0.5%～6.0%和0.5%～7.0%。

不同的微生物其最適氮源是不一樣的。張帆[15]篩選了5株菌，在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)捶謩e為KNO3、NaNO3和NH4Cl時，菌株的石油降解率都不相同。也有微生物能適應(yīng)多種氮源，馬強[17]篩選了2株菌能夠利用NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3等氮源，降解效率都在70%以上。篩選所得的石油烴降解菌能夠利用K2HPO4和KH2PO4為磷源，降解效果比單獨應(yīng)用K2HPO4或KH2PO4要好一些，主要可能是由于K2HPO4/KH2PO4(1∶1)體系對降解過程中選擇性培養(yǎng)液的pH能起到很好的緩沖作用，從而為降解菌提供了一個穩(wěn)定的降解環(huán)境。

2.2 接種量

接種量主要通過影響微生物的調(diào)整期來影響生物對石油的降解率。接種量小時，微生物調(diào)整周期長，降解速率慢；接種量大時，微生物調(diào)整周期較短，降解速率快；但是接種量也不宜太大，李燕妮[14]發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種量低于或高于7%，菌群對石油的降解作用均不同程度地降低。其原因主要是，當(dāng)接種量較低時，由于微生物不能快速而又充分的利用搖瓶中的碳源，表現(xiàn)為石油降解率的降低，且當(dāng)接種量較大，由于微生物數(shù)量較大，對營養(yǎng)物質(zhì)的需求增大，使得搖瓶中的營養(yǎng)物質(zhì)相對供應(yīng)不足，不能使微生物的數(shù)量進(jìn)一步增長，從而使得石油降解率降低。

有些微生物的石油降解率決定因素并不是接種量，謝云[18]在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種1%～10%的菌量，都具有很好的降解率。從經(jīng)濟方面考慮，將最佳接種量定為1%。

2.3 pH

pH是影響生物降解石油烴的重要因素，不同的菌株有各自適宜的pH，pH還能夠影響微生物的生物活性，pH過高或者過低都不利于微生物對石油污染物的降解，因此確定菌株降解原油時的最適pH是非常重要的?？梢韵蛲寥乐刑砑舆m量的酸堿緩沖液調(diào)控土壤的pH，由此達(dá)到微生物高效降解石油的目的。

大多數(shù)石油降解菌適合在pH為7.0的環(huán)境中生存，張帆[15]、馬強[17]、徐馮楠[19]在研究中發(fā)現(xiàn)pH為7時，菌株的生物量最大，降解率也最高。一些菌株適合在中性偏酸的環(huán)境中生存，謝云[18]篩選得到2株菌，降解率在pH 6～7之間達(dá)到最高為60%以上。部分菌適合在偏堿性的環(huán)境中生存，阮志勇[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH為8時，反應(yīng)體系中微生物的活菌量達(dá)到一個較高值，此時石油的去除率也達(dá)到最高值。李燕妮[14]也篩選了1株適宜生存在中性偏堿性pH為9的環(huán)境中的石油降解菌，石油降解率最高為39.98%。

2.4 石油含量

石油濃度對微生物降解有很大的影響，低濃度石油通常不會對普通微生物產(chǎn)生毒害，還可以刺激嗜油微生物的生長。石油濃度過高會抑制微生物活性，對微生物有毒害作用[10]。

徐馮楠[19]研究發(fā)現(xiàn)石油的降解率與初始濃度成反比的關(guān)系。高濃度石油會影響營養(yǎng)和氧的傳遞，從而影響微生物的活性。研究中發(fā)現(xiàn)，石油濃度越大，油滴殘留的越多。這可能是石油組分中某些微生物對揮發(fā)性的烴類抗毒性作用小，這些揮發(fā)性烴類是優(yōu)良的類脂質(zhì)溶劑，它們能破壞細(xì)胞膜與細(xì)胞壁的類脂質(zhì)，從而抑制了微生物的降解。另外，當(dāng)石油濃度過大時，培養(yǎng)液中空氣的通透性變差，溶解氧減少，好養(yǎng)菌不能良好地生長，致使降解率下降。

2.5 溫度

溫度通過影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)來影響生物生長、繁殖和新陳代謝。徐馮楠[19]和阮志勇[20]通過測定菌液D600nm值和原油降解率，以確定菌株降解石油最適溫度。結(jié)果顯示，高溫和低溫都不利于菌株生長以及對石油的降解。

我國北方某些油田在開采過程中污染了土壤，此時就需要耐低溫石油降解菌來降解土壤中的石油。趙全[21]從曝氣池污泥中分離、篩選得到在低溫條件下能以石油烴類物質(zhì)為唯一碳源、能源的且具有良好降解性能的耐低溫瓊式不動桿菌。

2.6 培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)

培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)可以間接反映通氣量，不同類型的微生物對氧的需求是不同的。培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)對菌株的生長和石油降解有一定影響，活菌量和石油降解率隨著轉(zhuǎn)速升高而升高，但是到達(dá)一定的轉(zhuǎn)速，活菌量和石油降解率維持不變。

培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)也不是越高越好，謝云[18]在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)較小時，石油烴培養(yǎng)基中的溶解氧含量較少，不能支持細(xì)菌的生長，細(xì)菌生長受到一定的抑制；當(dāng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)高于200r/min時，培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)過快導(dǎo)致菌體細(xì)胞受到損傷，降解菌的降解酶合成和代謝受到抑制，從而影響到降解菌的原油降解率。

3 微生物降解石油污染土壤的研究進(jìn)展

篩選石油降解菌后，將其投入石油污染土壤中去，研究微生物對污染土壤中石油的降解效率。孫先鋒等[22]利用生物刺激和生物強化2種方法進(jìn)行油污土壤生物修復(fù)，將篩選得到的枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌投入到長慶油田污染土壤中，經(jīng)過60d修復(fù)試驗，發(fā)現(xiàn)生物刺激在降解飽和烴、降低土壤中溶液表面張力、增加微生物數(shù)量、提高土壤酶活性方面優(yōu)于生物強化，而生物強化則對于石油烴中難降解的芳香烴有很好的降解效果，兩者各有優(yōu)勢。土著微生物也可以降解石油，但是沒有外加菌劑降解效果好。閆毓霞等[23]利用微生物修復(fù)勝利油田含油污泥，使用外加菌劑比利用土著微生物的石油降解率高6.5%。在降解過程中，應(yīng)根據(jù)菌種特性適當(dāng)添加營養(yǎng)元素。楊茜等[24]將分離篩選的石油降解菌(不動桿菌)接入陜北某油井周圍石油污染土壤，并添加氮磷營養(yǎng)，進(jìn)行為期8周的生物修復(fù)處理，修復(fù)期間每天均勻翻動土壤保持透氣性，石油降解率達(dá)到57.5%。向油污土壤中投加降解菌可以顯著提高土壤細(xì)菌群落的多樣性。細(xì)菌群落多樣性結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，對石油烴的降解效果相對較好。也可以改良土壤的孔隙度，以便微生物能更好地降解污染土壤中的石油。齊建超等[25]將勝利油田表層0～20cm石油污染土壤，自然風(fēng)干，過100目篩備用，經(jīng)過改良，按照4%的比例加入混合菌劑，石油烴降解率可達(dá)到73%，土壤微生物數(shù)量增加，多樣性更為豐富。石油組分復(fù)雜，單一菌種降解效果不是很理想，這時候可以考慮構(gòu)建菌群降解污染土壤中的石油。陳立等[26]從陜北某油田的石油污染土壤篩選石油降解單菌，將其組成菌群。對這些菌群進(jìn)行放大培養(yǎng)，進(jìn)行石油污染土壤修復(fù)試驗研究，2個試驗區(qū)土壤中人為添加石油質(zhì)量分別為1542 mg·kg-1和1886mg·kg-1時，經(jīng)過11～32d的原位修復(fù)，土壤中石油累計降解率可達(dá)69.52%～88.11%，而對照區(qū)土壤中人為添加的石油含量變化不大，去除率在20%左右，研究表明，混合菌群降解石油效率高。

4 展望

石油污染土壤的普遍性、危害性在我國已經(jīng)逐漸引起社會的廣泛關(guān)注。我國對石油依賴度逐漸增高，土壤也面臨著更大的污染風(fēng)險。

針對受石油中輕度污染的農(nóng)業(yè)土壤，需要著力發(fā)展能大面積應(yīng)用的、廉價的、環(huán)境友好的生物修復(fù)技術(shù)和物化穩(wěn)定技術(shù)，實現(xiàn)邊修復(fù)邊生產(chǎn)，以保證生態(tài)環(huán)境安全[27]。篩選出合適的降解菌后，還要提供其適宜的生存環(huán)境，以滿足微生物的生長需求，同時土壤的結(jié)構(gòu)、孔隙度及含水率也對微生物的降解效率有很大的影響。在實際降解過程中，要綜合考慮這些因素。

微生物技術(shù)處理效果好，費用低，最終產(chǎn)物是CO2、H2O等物質(zhì)，不產(chǎn)生二次污染，但作為一種新型技術(shù)在推廣使用時還面臨許多難題。例如：石油類污染物水溶性差，不利于微生物對其降解；微生物生長緩慢，修復(fù)周期長；很難徹底降解石油污染物；污染物濃度過高時對微生物具有很大的毒害作用等。因此，高效、穩(wěn)定、適應(yīng)性強、廣譜性的“土著”菌株的篩選與分離以及混合菌群的構(gòu)建仍是今后研究的重點。

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2016-08-26

詹亞斌 (1991-)，男，碩士生，研究方向為環(huán)境微生物。通信作者：馬立安， malian@yangtzeu.edu.cn。

X53;X172

A

1673-1409(2016)33-0052-05

[引著格式]詹亞斌，馬立安.生物修復(fù)石油污染土壤研究進(jìn)展[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版)，2016，13(33)：52～56.