袁秀云,許申平,宋彩霞,崔　波*,魏　博

(1 鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所,鄭州 450044;2 鄭州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450044;3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450002)

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蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因的克隆及表達(dá)特性分析

袁秀云1,許申平1,宋彩霞2,崔波1*,魏博3

(1 鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所,鄭州 450044;2 鄭州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450044;3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450002)

摘要:利用RT-PCR及RACE技術(shù),克隆到蝴蝶蘭1個(gè)幾丁質(zhì)酶基因PhCHT(GenBank 登錄號(hào)為KT992851),該基因cDNA全長(zhǎng)1 210 bp,包含37 bp的5′-UTR、933 bp開放閱讀框和240 bp 3′-UTR,編碼310個(gè)氨基酸;該蛋白為糖苷水解酶第19家族成員,兼具有溶菌酶活性;生物信息學(xué)分析顯示,該蛋白具N-端信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu),為胞外分泌蛋白;該蛋白與海棗、谷子、油棕和擬南芥的幾丁質(zhì)酶類似蛋白相近,并且在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與甘蔗和陸地棉的Ⅶ類幾丁質(zhì)酶同屬一個(gè)分支。PhCHT基因的表達(dá)分析表明,PhCHT在蝴蝶蘭營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達(dá),根中表達(dá)量最高;13 ℃/8 ℃低溫處理3、6、9和15 d時(shí)該基因的表達(dá)被抑制,4 ℃低溫處理1、2和4 h表達(dá)量升高。研究表明,PhCHT基因能夠響應(yīng)短期的冷脅迫。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進(jìn)化及抗性育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:蝴蝶蘭;幾丁質(zhì)酶;表達(dá)分析;低溫脅迫

幾丁質(zhì)酶(chitinase)是一種降解幾丁質(zhì)的糖苷酶,具有N-端信號(hào)肽、幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)和催化區(qū)等3個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域[1-2]。在植物中,幾丁質(zhì)酶由多基因家族編碼,根據(jù)氨基酸序列的差異及結(jié)構(gòu)域的有無,幾丁質(zhì)酶被分為2個(gè)家族(18家族和19家族)共7類(Class Ⅰ～Ⅶ),Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ屬于19家族,Ⅲ和Ⅴ屬于18家族[3]。在植物中幾丁質(zhì)酶不但參與植物的抗病防御反應(yīng)[4],還能對(duì)環(huán)境中的各種非生物脅迫做出響應(yīng)[5],參與植物發(fā)育[6-7]及機(jī)械損傷[8]、低溫[9-11]、高鹽、干旱[12-13]和重金屬[14-15]等多種非生物脅迫的調(diào)控。因此研究幾丁質(zhì)酶及其功能有助于深入了解植物的抗病及逆境生理調(diào)控機(jī)制,同時(shí)也可以為經(jīng)濟(jì)作物的抗性品種培育提供理論依據(jù)。

幾丁質(zhì)酶在植物中是一種主要的病程相關(guān)蛋白,多年來的研究主要集中在抗病方面[16]。在非生物脅迫中,幾丁質(zhì)酶也參與植物的低溫脅迫生理調(diào)控。研究顯示,黑麥中有2個(gè)冷誘導(dǎo)基因CHT9和CHT46的蛋白分別屬于Class Ⅰ和Ⅱ幾丁質(zhì)酶,具有抗凍活性[9];無芒雀麥中冷誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶基因BiCHT1與黑麥中的CHT9同源,但不受滲透脅迫、脫落酸和乙烯利等脅迫的影響,其在4 ℃具有抗凍活性,在10 ℃具有輕微的抗凍活性[17];狗牙根在冷馴化和脫水過程中,其Class Ⅱ幾丁質(zhì)酶基因被誘導(dǎo)表達(dá)[11];甘蔗的Class Ⅲ[18]、Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ[19]幾丁質(zhì)酶基因能響應(yīng)多種生物脅迫和非生物脅迫,其中包括4 ℃低溫脅迫;除此之外,植物中還存在一些幾丁質(zhì)酶類似蛋白(chitinase-like protein,CHL),也具有幾丁質(zhì)酶的功能[20]。例如,在桑樹[21]、水稻[22]和擬南芥[23]等植物中均克隆出幾丁質(zhì)酶類似基因,研究發(fā)現(xiàn)這些基因在病蟲害防御、環(huán)境脅迫和植物發(fā)育等方面具有重要作用。通過生物工程技術(shù)將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入不同植物,其抗病能力能夠增強(qiáng)[24]。例如,轉(zhuǎn)馬鈴薯幾丁質(zhì)酶茶樹增強(qiáng)了抗皰狀疫病的能力[25];水稻幾丁質(zhì)酶基因在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達(dá)增強(qiáng)了番茄對(duì)枯萎病和早疫病的抗性[26];水稻幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入香蕉增強(qiáng)了香蕉對(duì)黑葉條紋病的抗性[27];在煙草中過表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因,不但具有較高的真菌和細(xì)菌抗性,其對(duì)高鹽和重金屬脅迫的抗性也增強(qiáng)[28]?？梢?通過幾丁質(zhì)酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化提高抗逆能力為作物抗性育種提供了一條新途徑。

盡管目前在很多植物中都克隆到不同的幾丁質(zhì)酶基因,而蘭科植物中幾丁質(zhì)酶基因及其研究還未見報(bào)道。蝴蝶蘭(Phalaenopsisspp.)是蘭科植物中常見的觀賞蘭花,具有很高的觀賞價(jià)值。由于其原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū),正常生長(zhǎng)需要較高的溫度和濕度,低溫脅迫是其生長(zhǎng)的制約因素,研究蝴蝶蘭低溫脅迫下調(diào)控基因的功能有助于理解其低溫脅迫的調(diào)控機(jī)制。本研究以蝴蝶蘭為材料,利用RACE和RT-PCR方法克隆到1個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的全編碼區(qū)序列,利用實(shí)時(shí)熒光定量的方法分析其在蝴蝶蘭不同組織及低溫脅迫下的表達(dá)特性,旨在進(jìn)一步理解該基因在植物中的調(diào)控作用,并為蝴蝶蘭低溫抗逆機(jī)理的研究及今后通過基因工程手段選育抗逆新種質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料與處理

以蝴蝶蘭品種‘滿天紅’為試驗(yàn)材料,首先將生長(zhǎng)大小一致的生根瓶苗放在13 ℃/8 ℃ 的晝夜溫度、12 h/12 h光暗條件的培養(yǎng)箱中,分別于培養(yǎng) 0、3、6、9和15 d時(shí)取第二葉片組織,接著再放回正常溫室條件下(27 ℃/22 ℃晝夜溫度)、12 h/12 h光暗條件下恢復(fù)培養(yǎng),并于1和3 d時(shí)取第二葉片組織;另外將蝴蝶蘭植株放于4 ℃冰箱分別于0、1、2、4、8、12、24和48 h時(shí)取第二片葉組織材料。除此之外,取溫室中盛花期的根、葉、花葶、萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱和子房(授粉發(fā)育后)等組織;每次取樣包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù),所有組織取材后迅速用液氮速凍,于-80 ℃冰箱備用。

1.2方法

1.2.1蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)的克隆葉片組織總RNA用Trizol試劑(Invitrogen)提取,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳判斷其完整性,利用Q5000核酸蛋白分析儀(美國(guó)Quawell)測(cè)定RNA的濃度和純度。

采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa),以4 ℃處理1 h的葉片總RNA為模板合成單鏈cDNA;根據(jù)NCBI登錄的序列設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物CHT-F(5′-CW-CMGACTTCTTCMAGGTKTACCA-3′)和CHT-R(5′-GSTTAKGAAGAAGCAGRTTKGMC-3′),用于擴(kuò)增蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因的中間片段。PCR擴(kuò)增體系為20 μL,含10×buffer 2 μL,cDNA模板1 000～2 000 ng,4種dNTP各150 μmol·L-1,每條引物0.5 μmol·L-1,TaqDNA聚合酶1 U。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性40 s,56 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min?；厥漳康钠?連接到pGEM-T EASY載體上,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株,進(jìn)行克隆和測(cè)序。

根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因的中間片段序列,設(shè)計(jì)1對(duì)3′端特異引物GSP3-1(5′-TAGGTGATGGGCTGAAAGTTGA-3′)和GSP3-2(5′-CGGCCAGGGCTATGTAGATTC-3′),1對(duì)5′端特異引物GPS5-1(5′-TCCAGGTGAGCAAGGATAAAGG-3′)和GPS5-2(5′-AAGAAATGCCGCCACCTCCT-3′),按Clontech公司SMARTTMRACE Amplification kit操作說明進(jìn)行擴(kuò)增,回收擴(kuò)增產(chǎn)物,克隆到pGEM-T EASY載體上,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株,鑒定后進(jìn)行測(cè)序,并與中間片段進(jìn)行拼接。

然后根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物CHI-ORFF(5′-TGTCGAAGAAAATGTGCAGTCG-3′)和CHI-ORRR(5′-GGGTTATGAAGAAGCAGGTTGG-3′)進(jìn)行開放閱讀框(ORF)擴(kuò)增。引物和測(cè)序由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成。

氨基酸同源性分析在NCBI上進(jìn)行;保守結(jié)構(gòu)域及功能域在NCBI 的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫中搜索,并用ScanProsite軟件分析;利用SignalP、TargetP和WoLFPSORT軟件分別進(jìn)行信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);蛋白理論分子量和等電點(diǎn)采用ProtParm軟件分析;采用TMHMM 2.0分析跨膜結(jié)構(gòu);蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用ExPASy網(wǎng)站上的GOR Protein secondary structure prediction分析;使用MEGA軟件的NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)分析各種組織總RNA用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。根據(jù)基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物qCHI-F(5′-TGCAG-TAAGGGATGGGAGTGT-3′)和qCHI-R(5′-AAT-CCGAGCGGCTGATACAC-3′),產(chǎn)物長(zhǎng)度185 bp,以Actin(JN185655)及EF1α(KC153045)為內(nèi)參基因,引物分別為Act-F(5′-GCAGCATGAAGAT-CAAGGTGG-3′)和Act-R(5′-GCCTTAGAAATCCACATCTGTTG-3′),EF1α-F(5′-CCCTTCTTGCTTTCACCCTTG-3′)和EF1α-R(5′-GGATTG-TAACCCACCTTCTTCA-3′)。采用SYBR Premix ExTaqTMⅡ kit(TaKaRa)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 s,56 ℃變性15 s,72 ℃退火15 s(40個(gè)循環(huán))。qRT-PCR反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行,3次重復(fù)。引物特異性分別通過溶解曲線分析并測(cè)序,相對(duì)表達(dá)量按照2-ΔΔCt法計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.1蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)的克隆

以蝴蝶蘭4℃ 處理1 h葉片的cDNA為模板,以簡(jiǎn)并引物CHI-F和CHI-R進(jìn)行中間片段的PCR 擴(kuò)增,得到1個(gè)771 bp保守片段(圖1,A),此片段經(jīng)BlastX分析,包含1個(gè)19家族幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域,表明該片段為幾丁質(zhì)酶片段。根據(jù)該片段序列,采用RACE 技術(shù),利用GSP5-1和GSP5-2引物擴(kuò)增獲得5′端目的片段為385 bp(圖1,B),利用GSP3-1和GSP3-2引物擴(kuò)增獲得3′端目的片段為394 bp(圖1,C)。將中間片段、3′和5′ 端片段序列拼接,然后在開放閱讀框區(qū)域設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行擴(kuò)增,得到了預(yù)期的片段(圖1,D),最終得到該基因全長(zhǎng)cDNA 為1 210 bp。通過ORF查找具有完整的開放閱讀框。其中包含37 bp 5′-UTR、933 bp開放閱讀框和240 bp 3′-UTR(圖2),編碼310 個(gè)氨基酸。其核苷酸序列通過BlastN分析,發(fā)現(xiàn)其與野芭蕉和甜菜的幾丁質(zhì)酶基因分別具有80%和76%一致性。將該基因命名為PhCHT,提交GenBank,登錄號(hào)為KT992851。

2.2蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(conserved domain database,CDD)對(duì)蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因編碼蛋白的保守區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果表明,該蛋白在第59～295氨基酸殘基之間有一個(gè)幾丁質(zhì)酶糖苷酶19家族結(jié)構(gòu)域(cd00325,E值6.55e-103),在此結(jié)構(gòu)域內(nèi)有3個(gè)催化殘基位點(diǎn)和7個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)(圖3),說明該結(jié)構(gòu)域包含催化區(qū);該結(jié)構(gòu)域還是一個(gè)溶菌酶相似超家族基因的保守結(jié)構(gòu)域,推測(cè)該蛋白兼具溶菌酶活性。利用ScanProsite軟件分析,該蛋白不具有幾丁質(zhì)酶結(jié)合區(qū)和19家族幾丁質(zhì)酶特異的序列標(biāo)簽;ProtParm軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白分子量為34.25 kD,等電點(diǎn)為6.44,為酸性蛋白。SignalP的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,該蛋白在N-端的第1～31氨基酸殘基之間有一信號(hào)肽區(qū)域,第31位丙氨酸(Ala,A)和32位賴氨酸(Lys,K)之間為信號(hào)肽切割位點(diǎn),從32位氨基酸以后為成熟蛋白。利用TargetP和WoLFPSORT 2種軟件對(duì)該蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè),TargetP的預(yù)測(cè)顯示該蛋白是分泌途徑蛋白,可能性為94.8%,WoLFPSORT的預(yù)測(cè)顯示該蛋白位于胞外,可能性是82%,推測(cè)該蛋白屬于胞外分泌蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明,在第13～31氨基酸殘基之間有一個(gè)跨膜信號(hào)區(qū)域。表明蝴蝶蘭該幾丁質(zhì)酶為跨膜蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明,該蛋白α螺旋占32.56%,延伸鏈占18.71%,β轉(zhuǎn)角占5.81%,隨機(jī)卷曲占42.90%。

1.保守片段;2.5′-RACE;3.3′-RACE;

將蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因編碼的蛋白進(jìn)行BlastP比對(duì),結(jié)果顯示,該蛋白與多種植物幾丁質(zhì)酶具有65%～86%一致性,其中與海棗、油棕、谷子、擬南芥等幾丁質(zhì)酶類似蛋白具有70%～86%一致性。將這些蛋白與其它各類幾丁質(zhì)酶蛋白一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,包括小麥的Class Ⅰ和Ⅲ、陸地棉的Class Ⅰ和Ⅶ、草莓的Class Ⅱ、擬南芥的Class Ⅳ和Ⅴ、美洲油棕的Class Ⅳ、小蕁麻的Class Ⅵ、甘蔗的Class Ⅶ、水稻的Class Ⅰ和Ⅲ、煙草的Class Ⅴ和可可的Class Ⅱ。結(jié)果表明,各類幾丁質(zhì)酶蛋白差異明顯,19個(gè)物種的幾丁質(zhì)酶蛋白被分為2大分支,Class Ⅲ和Ⅴ為一大分支,屬于18家族幾丁質(zhì)酶,Class Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅵ和Ⅶ為另一大分支,屬于19家族幾丁質(zhì)酶,此大分支又分為2個(gè)亞組,Class Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅵ為一亞組,蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶與擬南芥、海棗、油棕、谷子的幾丁質(zhì)酶類似蛋白和陸地棉、甘蔗的Class Ⅶ為第二亞組,其中蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶蛋白在第二亞組中,與海棗、油棕、谷子和甘蔗等單子葉植物的關(guān)系最近(圖4)。

ATG.起始密碼子;TAA.終止密碼子;陰影.N-端信號(hào)肽

圖3　蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

圖4　蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)模式

以Actin和EF1α兩種內(nèi)參基因?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,該基因在各種組織中均有表達(dá),其中在根中表達(dá)量最高,萼片和唇瓣中次之,在蕊柱中表達(dá)量最低,說明在形態(tài)建成中主要促進(jìn)根的發(fā)育;以Actin和EF1α兩種內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn),PhCHT基因的表達(dá)分析結(jié)果基本一致(圖5)。為了分析幾丁質(zhì)酶基因與不同低溫脅迫的關(guān)系,分析了13 ℃/8 ℃低溫馴化溫度和4 ℃冷脅迫條件下該基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示,在13 ℃/8 ℃晝夜溫度培養(yǎng)3、6、9和15 d時(shí),該基因表達(dá)隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,恢復(fù)正常溫度培養(yǎng)1和3 d時(shí),該基因表達(dá)量沒有回升(圖6,A),此時(shí)觀察到植株通過低溫馴化后能恢復(fù)正常生長(zhǎng),沒有凍傷現(xiàn)象。而在4 ℃低溫脅迫下,該基因表達(dá)與前者不同,在冷脅迫1、2和4 h時(shí),幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量均比處理前高,呈逐漸升高的趨勢(shì),在處理4 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高,隨后其表達(dá)量下降,在8 h表達(dá)量最低,12、24和48 h維持在處理前的表達(dá)水平。分析認(rèn)為,低溫馴化3、6、9和15 d時(shí),PhCHT表達(dá)被抑制,當(dāng)恢復(fù)正常溫度培養(yǎng)時(shí)其表達(dá)在短期內(nèi)沒有恢復(fù);PhCHT對(duì)短期的4 ℃低溫脅迫能夠及時(shí)做出響應(yīng),但是隨著冷脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),其表達(dá)又回到原來的表達(dá)水平(圖6,B);在兩種低溫處理?xiàng)l件下,以Actin和EF1α兩種內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)水平分析也具有相似的結(jié)果。

圖5　PhCHT在不同組織中的表達(dá)

圖6　蝴蝶蘭PhCHT基因在不同低溫條件下的表達(dá)

3討論

本研究從蝴蝶蘭葉片中克隆到1個(gè)幾丁質(zhì)酶基因,其生物信息學(xué)分析表明,該基因?qū)儆?9家族幾丁質(zhì)酶基因,包含一個(gè)催化區(qū),在N-端有一個(gè)信號(hào)肽,具有跨膜結(jié)構(gòu),屬于胞外分泌蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示該基因編碼的蛋白與幾丁質(zhì)酶類似蛋白關(guān)系最近,在進(jìn)化樹上與Class Ⅶ幾丁質(zhì)酶在同一分支上;表達(dá)特性分析結(jié)果表明,該基因在蝴蝶蘭的營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達(dá),但表達(dá)水平有差異;低溫馴化溫度抑制其表達(dá),能夠響應(yīng)短期的冷脅迫。

植物中各類幾丁質(zhì)酶的基因序列、亞細(xì)胞定位及酶活性存在較大差異。Class Ⅰ幾丁質(zhì)酶包含N-端信號(hào)區(qū)、幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)和催化區(qū)3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,有的Class Ⅰ幾丁質(zhì)酶在C端還有一個(gè)液泡定位區(qū)[29],Class Ⅱ幾丁質(zhì)酶有信號(hào)肽和催化區(qū)[30-31],Class Ⅲ幾丁質(zhì)酶與Class Ⅰ和Class Ⅱ沒有同源性[32],Class Ⅳ與Class Ⅰ的結(jié)構(gòu)域相似,但催化區(qū)較短[33-34],Class Ⅴ幾丁質(zhì)酶在氨基酸結(jié)構(gòu)上與Class Ⅰ相似,但其序列與小蕁麻凝結(jié)素蛋白前體序列相似性高,在N-端有2個(gè)凝結(jié)素保守域[35-36],Class Ⅵ與前5類無相似性,有信號(hào)肽,2個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)和催化區(qū),與某些細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶具有較高的相似性[37],Class Ⅶ幾丁質(zhì)酶N-端有信號(hào)區(qū)和催化區(qū),不含幾丁質(zhì)結(jié)合位點(diǎn),其催化區(qū)不含19家族幾丁質(zhì)酶特異的序列標(biāo)簽[38]。還有一些幾丁質(zhì)酶類似蛋白,其序列與18和19家族幾丁質(zhì)酶蛋白同源,但不包含幾丁質(zhì)結(jié)合或者催化活性[20],具有幾丁質(zhì)酶相似的抗病原體活性[21-22]。擬南芥一個(gè)幾丁質(zhì)酶類似蛋白(AtCTL1),具有一個(gè)19家族幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)域,在N-端有一個(gè)信號(hào)肽,屬于分泌途徑的蛋白,定位于細(xì)胞壁,其在種子、莖和花中均有表達(dá),在成熟葉片和根中表達(dá)較低,該基因不被機(jī)械損傷、水楊酸和乙烯等處理誘導(dǎo),其轉(zhuǎn)錄水平在機(jī)械損傷和乙烯處理24 h時(shí)明顯降低[39],推測(cè)擬南芥AtCTL1基因不是脅迫誘導(dǎo)型幾丁質(zhì)酶。在擬南芥中該蛋白的突變引起了根中木質(zhì)素的異源沉淀、細(xì)胞形狀的改變和過剩乙烯的產(chǎn)生[39]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在根系發(fā)育中起重要作用,能夠響應(yīng)土壤環(huán)境的變化影響根系的結(jié)構(gòu)[23,40]。在棉花中有2個(gè)幾丁質(zhì)酶類似蛋白與擬南芥AtCHL1有較高的一致性,它們?cè)诩?xì)胞壁的纖維素合成中發(fā)揮重要作用[41]。本研究的蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因編碼的蛋白與AtCHL1有較高的同源性,二者具有相似的功能結(jié)構(gòu)域,如具有N-端有信號(hào)肽,有19家族幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)域,但沒有幾丁質(zhì)酶特異的序列標(biāo)簽,在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與Class Ⅶ屬于同一分支,由此判斷,該研究中的幾丁質(zhì)酶類似蛋白可能屬于Class Ⅶ幾丁質(zhì)酶。本研究中蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因與擬南芥的AtCHL1具有相似的組織表達(dá)特性,均在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中表達(dá),由此推測(cè),蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因與擬南芥的AtCHL1有相似的功能。

在熱帶和亞熱帶物種中,番荔枝(Annonacherimola)的果皮中具有2個(gè)抗真菌和低溫適應(yīng)的幾丁質(zhì)酶,體外研究表明該蛋白不具有抗凍活性[42]。甘蔗的Class Ⅰ和Ⅶ幾丁質(zhì)酶在4 ℃處理12和24 h時(shí)兩種幾丁質(zhì)酶均表現(xiàn)持續(xù)升高的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[19],而本研究蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因只在4 ℃處理4 h時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰,4 ℃處理8 h以后其表達(dá)下降到處理前的水平,分析原因可能與幾丁質(zhì)酶的種類和物種差異有關(guān)。蝴蝶蘭作為熱帶和亞熱帶物種,適宜的生長(zhǎng)需要溫濕的環(huán)境,低溫會(huì)抑制其生長(zhǎng)和發(fā)育,目前蝴蝶蘭低溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制還不明確,研究報(bào)道也較少。最近的研究表明,蝴蝶蘭在馴化低溫條件下有一個(gè)幾丁質(zhì)酶肽段上調(diào)表達(dá)[43],本研究的幾丁質(zhì)酶編碼的蛋白不包含該肽段,說明二者不是一個(gè)蛋白,同時(shí)也表明蝴蝶蘭另有馴化低溫誘導(dǎo)類型的幾丁質(zhì)酶,這些基因在蝴蝶蘭的生物脅迫和非生物脅迫中如何調(diào)控生理代謝？其作用底物是什么？這些研究結(jié)果將有助于蝴蝶蘭新種質(zhì)品種的改良。因此有關(guān)蝴蝶蘭幾丁質(zhì)酶基因的種類、酶活性及與低溫脅迫的關(guān)系待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1]HONG J K,HWANG B K.Promoter activation of pepper class Ⅱ basic chitinase gene,CAChi2,and enhanced bacterial disease resistance and osmotic stress tolerance in theCAChi2-overexpressingArabidopsis[J].Planta,2006,223(3):433-448.

[2]XU F,FAN C,HE Y.Chitinases inOryzasativassp.japonicaandArabidopsisthaliana[J].J.GenetGenomics,2007,34(2):138-150.

[3]KASPRZEWSKA A.Plant chitinases-regulation and function[J].CellMol.Biol.Lett.,2003,8(3):809-824.

[4]GUAN Y,RAMALINGAM S,NAGEGOWDA D,etal.Brassicajunceachitinase BjCHI1 inhibits growth of fungal phytopathogens and agglutinates gramnegative bacteria[J].J.Exp.Bot.,2008,59(12):3 475-3 484.

[5]TAKENAKA Y,NAKANO S,TAMOI M,etal.Chitinase gene expression in response to environmental stresses inArabidopsisthaliana:chitinase inhibitor allosamidin enhances stress tolerance[J].Biosci.Biotechnol.Biochem.,2009,73(5):1 066-1 071.

[6]KIM H B,AN C S.Differential expression patterns of an acidic chitinase and a basic chitinase in the root nodule ofElaeagnusumbellate[J].Mol.PlantMicrobeInterac,2002,15:209-215.

[7]ROBINSON S P,JACOBS A K,DRY I B.A class Ⅳ chitinase is highly expressed in grape berries during ripening[J].PlantPhysiol.,1997,114(3):771-778.

[8]BRAVO J M,CAMPO S,MURILLO I,etal.Fungus- and wound-induced accumulation of mRNA containing a class Ⅱ chitinase of the pathogenesis-related protein 4 (PR-4) family of maize[J].PlantMol.Biol.,2003,52(4):745-759.

[9]YEH S,MOFFATT B A,GRIFFITH M,etal.Chitinase genes responsive to cold encode antifreeze proteins in wheat cereals[J].PlantPhysiol.,2000,124:1 251-1 263.

[10]STRESSMANN M,KITAO S,GRIFFITH M,etal.Calcium interacts with antifreeze proteins and chitinase from cold-acclimated winter rye[J].PlantPhysiol.,2004,135:364-376.

[11]DE LOS REYES B G,TALIAFERRO C M,ANDERSON M P,etal.Induced expression of the class Ⅱ chitinase gene during cold acclimation and dehydration of bermudagrass (Cynodonsp.)[J].Theoretical&AppliedGenetics,2001,103(2-3):297-306.

[12]HONG J K,HWANG B K.Induction by pathogen,salt and drought of a basic class Ⅱ chitinase mRNA and itsinsitulocalization in pepper (Capsicumannuum)[J].Physiol.Plant,2002,114(4):549-558.

[13]TATEISHI Y,UMEMURA Y,ESAKA M.A basic class Ⅰ chitinase expression in winged bean is up-regulated by osmotic stress[J].Biosci.Biotechnol.Biochem.,2001,65(7):1 663-1 638.

[14]WANG L Y,WANG Y S,ZHANG J P,etal.Molecular cloning of class Ⅲ chitinase gene fromAvicenniamarinaand its expression analysis in response to cadmium and lead stress[J].Ecotoxicology,2015.

[15]WANG L Y,WANG Y S,CHENG H,etal.Cloning of theAegicerascorniculatumclass Ⅰ chitinase gene (AcCHII) and the response ofAcCHIImRNA expression to cadmium stress[J].Ecotoxicology,2015.

[16]SYTWALA S,GüNTHER F,MELZIG M F.Lysozyme-and chitinase activity in latex bearing plants of genusEuphorbia-a contribution to plant defense mechanism[J].PlantPhysiolBiochem.,2015,95:35-40.

[17]NAKAMURA T ISHIKAWA M,NAKATANI H,etal.Characterization of cold-responsive extracellular chitinase in bromegrass cell cultures and its relationship to antifreeze activity[J].PlantPhysiol.,2008,147(1):391-401.

[18]SU Y,XU L,FU Z,etal.ScChi,encoding an acidic class Ⅲ chitinase of sugarcane,confers positive responses to biotic and abiotic stresses in sugarcane[J].Int.J.Mol.Sci.,2014,15(2):2 738-2 760.

[19]SU Y,XU L,WANG S,etal.Identification,phylogeny,and transcript of chitinase family genes in sugarcane[J].Sci.Rep.,2015,5:10 708.

[20]KESARI P,PATIL DN,KUMAR P,etal.Structural and functional evolution of chitinase-like proteins from plants[J].Proteomics,2015,15(10):1 693-1 705.

[21]KITAJIMA S,KAMEI K,TAKETANI S,etal.Two chitinase-like proteins abundantly accumulated in latex of mulberry show insecticidal activity[J].BMCBiochem.,2010,11:6.

[22]WU J,WANG Y,KIM S T,etal.Characterization of a newly identified rice chitinase-like protein (OsCLP) homologous to xylanase inhibitor[J].BMCBiotechnol.,2013:1-4.

[23]HERMANS C,PORCO S,VERBRUGGEN N,etal.Chitinase-like protein CTL1 plays a role in altering root system architecture in response to multiple environmental conditions[J].PlantPhysiol.,2010,152(2):904-917.

[24]CLETUS J,BALASUBRAMANIAN V,VASHISHT D,etal.Transgenic expression of plant chitinases to enhance disease resistance[J].Biotechnol.Lett.,2013,35(11):1 719-1 732.

[25]SINGH HR,DEKA M,DAS S.Enhanced resistance to blister blight in transgenic tea [Camelliasinensis(L.) O.Kuntze] by overexpression of class Ⅰ chitinase gene from potato (Solanumtuberosum)[J].Funct.Integr.Genomics,2015,15(4):461-480.

[26]JABEEN N,CHAUDHARY Z,GULFRAZ M,etal.Expression of rice chitinase gene in genetically engineered tomato confers enhanced resistance to fusarium wilt and early blight[J].PlantPathol.J.,2015,31(3):252-258.

[28]DE LAS MERCEDES DANA M,PINTOR-TORO J A,CUBERO B.Transgenic tobacco plants overexpressing chitinases of fungal origin show enhanced resistance to biotic and abiotic stress agents[J].PlantPhysiol.,2006,142(2):722-730.

[29]ARAKI T,TORIKATA T.Structural classification of plant chitinases:two subclasses in class Ⅰ and class Ⅱ chitinases[J].Biosci.Biotechnol.Biochem.,1995,59(2):336-338.

[30]KHAN A A,DING S S.Molecular cloning,characterization,and expression analysis of two class Ⅱ chitinase genes from the strawberry plant[J].PlantScience,2004,166(3):753-762.

[31]KIKUCHI T,MASUDA K.Class Ⅱ chitinase accumulated in the bark tissue involves with the cold hardiness of shoot stems in highbush blueberry (VacciniumcorymbosumL.)[J].ScientiaHorticulturae,2009,120(2):230-236.

[32]SUN Y L,HONG S K.Effect of chitinase on resistance to fungal pathogens in sea buckthorn,Hippophaerhamnoides,and cloning of Class Ⅰ and Ⅲ chitinase genes[J].BiochemGenet,2012,50(7-8):600-615.

[33]WIWEGER M,FARBOS I,INGOUFF M,etal.Expression of Chia4-Pa chitinase genes during somatic and zygotic embryo development in Norway spruce (Piceaabies):similarities and differences between gymnosperm and angiosperm class Ⅳ chitinases[J].J.Exp.Bot.,2003,54(393):2 691-2 699.

[34]ISHISAKI K,HONDA Y,TANIGUCHI H,etal.Heterogonous expression and characterization of a plant class Ⅳ chitinase from the pitcher of the carnivorous plantNepenthesalata[J].Glycobiology,2012,22(3):345-531.

[35]LI D,ZHANG J,WANG Y,etal.Two chitinase 5 genes fromLocustamigratoria:molecular characteristics and functional differentiation[J].InsectBiochem.Mol.Biol.,2015,58:46-54.

[36]UMEMOTO N,OHNUMA T,URPILAINEN H,ET A L.Role of tryptophan residues in a class V chitinase fromNicotianatabacum[J].Biosci.Biotechnol.Biochem.,2012,76(4):778-784.

[37]MEINS F,FRITIG B,LINTHORST H J M,etal.Plant chitinase genes[J].PlantMolecularBiologyReporter,1994,12(2):S22-S28.

[38]JI L I,LIU J Y.A novel cotton gene encoding a new class of chitinase[J].ActaBotanicaSinica,2003,45(12):1 489-1 496.

[39]ZHONG R,KAYS S J,SCHROEDER B P,etal.Mutation of a chitinase-like gene causes ectopic deposition of lignin,aberrant cell shapes,and overproduction of ethylene[J].PlantCell,2002,14(1):165-179.

[40]HERMANS C,PORCO S,VANDENBUSSCHE F,etal.Dissecting the role ofCHITINASE-LIKE1 in nitrate-dependent changes in root architecture[J].PlantPhysiol.,2011,157(3):1 313-1 326.

[41]ZHANG D,HRMOVA M,WAN C H,etal.Members of a new group of chitinase-like genes are expressed preferentially in cotton cells with secondary walls[J].PlantMol.Biol.,2004,54(3):353-372.

[43]YUAN X Y,LIANG F,JIANG S H,etal.Differential protein expression inPhalaenopsisunder low temperature[J].Appl.Biochem.Biotechnol.,2015,175(1):909-924.

(編輯:宋亞珍)

Bioinformatics and Expression Analysis of a Chitinase Gene fromPhalaenopsisspp.

YUAN Xiuyun1,XU Shenping1,SONG Caixia2,CUI Bo1*,WEI Bo3

(1 Institute of Bioengineering,Zhengzhou Normal University,Zhengzhou 450044,China;2 College of Life Science,Zhengzhou Normal University,Zhengzhou 450044,China;3 College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

Abstract:Using RT-PCR combined with RACE techniques,we cloned the chitinases gene PhCHT (GenBank accession number:KT992851) from Phalaenopsis.The full length cDNA was 1 210 bp,containing a 5′-UTR of 37 bp,a 3′-UTR of 240 bp,and an opening reading frame of 933 bp encoding 310 amino acids;The deduced protein belonged to glycoside hydrolase family 19 and may have lysozyme activity.The bioinformatics analysis indicated that this protein was predicted to be an extracellular secreted protein with a N-terminal signal peptide and a transmembrane structure;It was highly identified with the chitinase-like protein of Phoenix dactylifera,Elaeis guineensis,Setaria italica,and Arabidopsis thaliana.Phylogenetic analysis showed that PhCHT belongs to a clade with other class Ⅶ chtinase genes from Gossypium hirsutum and Saccharum spp.The PhCHT gene was expressed in vegetative and reproductive organs with a higher expression level in root than others.The expression of PhCHT was decreased by a low temperature of 13 ℃/8 ℃ for 3,6,9 and 15 d,and increased by 4 ℃ treatment for 1,2 and 4 h.Our results suggest that the PhCHT plays a crucial role in responding to the short-term cold stress.These results could provide the foundation for further study the phyletic evolution of chitinase genes and the stress resistance breeding of Phalaenopsis.

Key words:Phalaenopsis spp.;chitinase;expression patterns;low temperature stress

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:袁秀云(1970-),女,博士,教授,主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail:yuanxiuyun@163.com*通信作者:崔波,博士,教授,主要從事花卉育種研究。E-mail:laocuibo@163.com

基金項(xiàng)目:河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(092102110128)

收稿日期:2015-11-07;修改稿收到日期:2016-01-02

文章編號(hào):1000-4025(2016)02-0241-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.02.0241