周旭紅,蔣亞蓮,李姝影,蘇 艷,莫錫君,桂 敏
(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所,云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心,昆明 650205)
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冬季低溫條件下香石竹小孢子敗育的細(xì)胞學(xué)研究
周旭紅,蔣亞蓮,李姝影,蘇艷,莫錫君,桂敏*
(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所,云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心,昆明 650205)
摘要:利用壓片法及石蠟切片法觀察冬季低溫下香石竹小孢子發(fā)育過程,以明確低溫導(dǎo)致香石竹小孢子敗育的因素,為雜交育種奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明:(1)冬季低溫下香石竹只有部分小孢子發(fā)育正常,經(jīng)過小孢子母細(xì)胞、減數(shù)分裂和四分體等時(shí)期,最后發(fā)育成花粉。(2)石蠟切片法觀察到冬季低溫下香石竹1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾中有61 %的花粉母細(xì)胞發(fā)生敗育,1.7~1.8 cm長(zhǎng)花蕾中有71%的花粉母細(xì)胞發(fā)生敗育。(3)部分已經(jīng)進(jìn)入四分體時(shí)期的小孢子胼胝質(zhì)未能及時(shí)溶解,妨礙了小孢子釋放而導(dǎo)致敗育。研究認(rèn)為,花粉母細(xì)胞和四分體的發(fā)育異常是冬季低溫下香石竹小孢子敗育的主要原因。
關(guān)鍵詞:低溫;香石竹;花粉;敗育
香石竹(DianthuscaryophyllusL.)是云南及全球主栽的鮮切花之一。目前,絕大多數(shù)香石竹品種依賴國(guó)外進(jìn)口,缺乏擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種是制約中國(guó)花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素,培育占有一定市場(chǎng)份額的新品種是亟待解決的主要問題。
香石竹雜交一般在每年的4~10月份進(jìn)行(北方的雜交時(shí)間更短),到了冬季氣溫下降不適合進(jìn)行雜交育種。當(dāng)氣溫在10~17 ℃時(shí),絕大多數(shù)香石竹無雄蕊或雄蕊發(fā)育不全,花粉敗育[1]。傅小鵬等[2]研究石竹雄性不育系小孢子敗育的原因,發(fā)現(xiàn)不育系敗育現(xiàn)象在造孢細(xì)胞增殖期、小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期以及四分體至單核期都有發(fā)生,不育花粉外形空癟,不規(guī)則,無生活力。絨氈層的異常發(fā)育是導(dǎo)致小孢子敗育的主要原因。而香石竹冬季低溫花粉敗育的原因很少有人報(bào)道,本研究采用壓片法及石蠟切片觀察冬季香石竹小孢子發(fā)育過程,探討小孢子敗育的原因,可為闡明其不育機(jī)理提供細(xì)胞學(xué)資料,為合理利用種質(zhì)資源、利用雜交優(yōu)勢(shì)進(jìn)行新品種選育提供理論依據(jù)。
1材料和方法
1.1材料
供試材料為香石竹品種‘Promesa’,取自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所寶峰基地。
1.2方法
1.2.1花粉活力測(cè)定采用醋酸洋紅染色測(cè)定法。分別于2013年3月、6月、9月和12月取3朵香石竹花的花藥放入干燥皿中過夜干燥,將花藥置于載玻片上,擠壓后去除雜質(zhì),加2~3滴1%醋酸洋紅溶液,蓋上蓋玻片,在顯微鏡下觀察。統(tǒng)計(jì)花粉的活力及花粉直徑,SPSS 18.0軟件計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
花粉生活力=(著色花粉數(shù)/觀察花粉數(shù))×100%
1.2.2壓片法觀察小孢子發(fā)育2013年12月選取生長(zhǎng)發(fā)育正常的植株,取香石竹不同長(zhǎng)度的花蕾,重復(fù)3~4朵花,長(zhǎng)度分別為0.9~1.0、1.1~1.2、1.3~1.4、1.5~1.6、1.7~1.8、1.9~2.0、2.1~2.2和2.3~2.6 cm的花蕾,用FPA固定液(福爾馬林∶丙酸∶70%酒精=1∶1∶18)固定,用清水漂洗3次,60 ℃ 1 mol/L HCl酸解10 min,清水漂洗3次,卡寶品紅染色30 min后壓片,在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程。統(tǒng)計(jì)不同長(zhǎng)度的花蕾四分體時(shí)期一分體、二分體、三分體和四分體的個(gè)數(shù),采用SPSS 18.0軟件作圖。
1.2.3石蠟切片法觀察小孢子發(fā)育2013年12月用FPA固定液固定不同長(zhǎng)度的花蕾,重復(fù)3~4朵花。將固定的花蕾,用清水洗凈2次后,滴上蘇木素染液,染色12 h。將染液洗凈,用70%乙醇洗2次,每次10 min,用70%乙醇浸泡材料12 h。再經(jīng)過逐級(jí)脫水,透明,浸蠟及包埋等步驟,最后切片,切片厚度8~12 μm,Nikon E800顯微鏡觀察和拍攝。統(tǒng)計(jì)不同長(zhǎng)度的花蕾,小孢子處于不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞的百分率,采用SPSS 18.0軟件作圖。
2結(jié)果與分析
2.1不同季節(jié)花粉的活力
由表1可以看出,不同季節(jié)香石竹‘Promesa’的花粉活力差異顯著,其中在3月和12月的花粉活力(22.23%和21.60%)顯著低于6月和9月(70.82%和71.41%),而且6月和9月為高溫季節(jié),溫度分別為22.84 ℃和21.17 ℃;3月和12月屬低溫季節(jié),溫度分別為14.12 ℃和14.48 ℃。說明溫度可能是影響香石竹花粉活力的因素之一。
2.2壓片法觀察冬季香石竹小孢子發(fā)育過程
冬季香石竹‘Promesa’花蕾長(zhǎng)0.9~1.2 cm時(shí),小孢子發(fā)育處于花粉母細(xì)胞時(shí)期,小孢子母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)濃厚、液泡小、細(xì)胞核大(圖版Ⅰ,A、B);隨之小孢子母細(xì)胞之間形成胼胝質(zhì)壁,逐漸增大,進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期(花蕾長(zhǎng)1.3~1.4 cm;圖版Ⅰ,C);當(dāng)花蕾1.5~1.6 cm時(shí),小孢子減數(shù)分裂形成的四分體由胼胝質(zhì)包圍(圖版Ⅰ,D),并出現(xiàn)異常的二分體(圖版Ⅰ,E)和三分體(圖版Ⅰ,F),有部分仍處于減數(shù)分裂階段(圖版Ⅰ,G);1.7~1.8 cm長(zhǎng)花蕾,部分小孢子處于四分體時(shí)期(圖版Ⅰ,H);花蕾發(fā)育到1.9~2.0 cm時(shí),少數(shù)發(fā)育為單核期小孢子,但仍有部分小孢子處于四分體時(shí)期,(圖版Ⅰ,I~J);當(dāng)花蕾長(zhǎng)2.1~2.6 cm時(shí),小孢子發(fā)育為成熟的花粉(圖版Ⅰ,K~L)。
表1 不同季節(jié)香石竹‘Promesa’花粉活力
注:同列不同字母表示差異顯著(P≤0.05)。
Note:Different letters in the same column indicate significant differences(P≤0.05).
由圖1可以看出,3月(春季),香石竹‘Promesa’四分體時(shí)期出現(xiàn)在1.3~1.8 cm長(zhǎng)的花蕾中,花蕾長(zhǎng)1.3~1.6 cm時(shí),以四分體居多,其它分體只占少量的比例;花蕾長(zhǎng)1.7~1.8 cm時(shí),四分體和二分體所占比例較大。到6月(夏季),香石竹‘Promesa’四分體時(shí)期出現(xiàn)在1.3~1.6 cm長(zhǎng)的花蕾中,且主要是四分體細(xì)胞。9月(秋季)1.5~1.6 cm長(zhǎng)的花蕾為小孢子四分體時(shí)期,絕大部分是四分體細(xì)胞。到了12月(冬季),1.5~2.0 cm長(zhǎng)的花蕾觀察到四分體,1.5~1.6 cm長(zhǎng)的花蕾絕大部分是四分體細(xì)胞,1.7~2.0 cm長(zhǎng)的花蕾四分體和其它分體都占有一定的比例。由此可見,高溫季節(jié)(6月和9月),花蕾長(zhǎng)1.7 cm時(shí),四分體時(shí)期已結(jié)束;而低溫季節(jié)(3月和12月),在花蕾長(zhǎng)1.7~1.8 cm或1.7~2.0 cm時(shí)還有部分花粉母細(xì)胞處于四分體時(shí)期,可能的原因是低溫引起四分體時(shí)期胼胝質(zhì)不能及時(shí)解體,小孢子未能釋放出來。
A.3月;B.6月;C.9月;D.12月
2.3石蠟切片法觀察冬季香石竹小孢子發(fā)育過程
冬季香石竹‘Promesa’花蕾長(zhǎng)0.9~1.2 cm時(shí)處于花粉母細(xì)胞時(shí)期,細(xì)胞核大且細(xì)胞質(zhì)濃,此時(shí)花藥壁由外向內(nèi)分化為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層,絨氈層細(xì)胞排列整齊具一至多核,細(xì)胞質(zhì)濃厚(圖版Ⅱ,A、B);1.3~1.4 cm長(zhǎng)花蕾94%的小孢子處于花粉母細(xì)胞(圖版Ⅱ,C)和6%的小孢子進(jìn)行減數(shù)分裂(圖版Ⅱ,D;圖2);1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾中,22%小孢子處于花粉母細(xì)胞時(shí)期(圖版Ⅱ,E),61%花粉母細(xì)胞發(fā)生敗育(圖版Ⅱ,F),13%小孢子仍處于減數(shù)分裂時(shí)期(圖版Ⅱ,G),只有4%小孢子母細(xì)胞完成正常的減數(shù)分裂,分裂完成時(shí)在 4個(gè)核間產(chǎn)生細(xì)胞壁,并分隔成由胼胝質(zhì)所包圍的 4 個(gè)細(xì)胞,形成正四面體形的小孢子四分體,4個(gè)小孢子處于共同的胼胝質(zhì)中(圖版Ⅱ,H;圖2);1.7~1.8 cm長(zhǎng)花蕾中71%花粉母細(xì)胞發(fā)生敗育(圖版Ⅱ,I),29%處于四分體時(shí)期(圖版Ⅱ,J;圖2);62%的1.9~2.0 cm長(zhǎng)花蕾形成花粉,隨著胼胝質(zhì)壁溶解,四分體分開形成單核小孢子,并在原小孢子初生壁的基礎(chǔ)上形成真正的外壁。起初形成的單核小孢子細(xì)胞質(zhì)濃,核大并居中,它們聚集在藥室的中央,絨氈層開始降解(圖版Ⅱ,K),另有38%小孢子還處于四分體階段,胼胝質(zhì)壁并未溶解(圖版Ⅱ,L);2.1~2.6 cm長(zhǎng),小孢子細(xì)胞質(zhì)中小孢子壁的增厚,殘余的絨氈層細(xì)胞則逐漸脫離花藥壁,作為營(yíng)養(yǎng)被發(fā)育中的小孢子所吸收,花粉粒逐漸發(fā)育成熟(圖版Ⅱ,M~O)。由圖2可見,0.9~1.4 cm長(zhǎng)花蕾中,絕大多數(shù)減數(shù)分裂細(xì)胞處于花粉母細(xì)胞時(shí)期,1.5~1.8 cm長(zhǎng)花蕾中,花粉母細(xì)胞時(shí)期開始敗育,少數(shù)花粉母細(xì)胞進(jìn)入四分體時(shí)期,1.9~2.6 cm長(zhǎng)花蕾中,四分體開始解體,形成單核小孢子,并逐漸發(fā)育成熟。冬季低溫可能影響減數(shù)分裂時(shí)期花粉母細(xì)胞的發(fā)育。
圖2 冬季不同大小香石竹花蕾中不同時(shí)期
3討論
雄性不育材料類型不同,花粉敗育的時(shí)期和原因也不盡相同。辣椒不育系8A敗育時(shí)期發(fā)生在四分體時(shí)期,進(jìn)入四分體時(shí)期,絨氈層細(xì)胞徑向異常膨大高度液泡化并入侵藥室,擠壓形成不規(guī)則的四分體,皺縮凹陷,有的小孢子四分體還出現(xiàn)粘連現(xiàn)象,不能產(chǎn)生正常小孢子[3]。甘藍(lán)型油菜不育系105A的花藥敗育是由于一部分花藥發(fā)育受阻于造孢細(xì)胞時(shí)期,另一部分花藥發(fā)育受阻于單核晚期[4]。張文超等[5]發(fā)現(xiàn),胼胝質(zhì)的異常合成與分布是毛白楊花粉敗育的原因之一。石竹花粉敗育現(xiàn)象在造孢細(xì)胞增殖至小孢子母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂以及釋放小孢子形成的各個(gè)階段都有發(fā)生[2]。
本研究發(fā)現(xiàn)冬季香石竹品種‘Promesa’花粉活力低,石蠟切片觀察到1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾中,61%花粉母細(xì)胞發(fā)生敗育,1.7~1.8 cm長(zhǎng)花蕾中有71%花粉母細(xì)胞發(fā)生敗育,小孢子花粉母細(xì)胞的敗育集中在1.5~1.8 cm長(zhǎng)花蕾中,花粉母細(xì)胞發(fā)生敗育是冬季香石竹品種‘Promesa’花粉敗育的主要原因。此外,3月和12月四分體時(shí)期分別出現(xiàn)在長(zhǎng)為1.3~1.8 cm和1.5~2.0 cm的花蕾,而6月和9月四分體時(shí)期分別出現(xiàn)在長(zhǎng)為1.3~1.6 cm和1.5~1.6 cm的花蕾中。由此可見,高溫季節(jié)四分體時(shí)期時(shí)間較短,而低溫季節(jié)四分體時(shí)期時(shí)間較長(zhǎng),四分體時(shí)期胼胝質(zhì)未能及時(shí)解體,從而導(dǎo)致小孢子不能釋放出來。綜上,低溫可能導(dǎo)致花粉母細(xì)胞發(fā)生敗育以及胼胝質(zhì)不能及時(shí)溶解,進(jìn)而致使小孢子的敗育,這還需更進(jìn)一步證實(shí)。
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Explanation of plates:
Piate ⅠDevelopmental stages of the carnation anther in different length of buds by squash observation in winter
Fig.A.Microspore mother cell in 0.9-1.0 cm bud;Fig.B.Microspore mother cell in 1.1-1.2 cm bud;Fig.C.Meiotic cell in 1.3-1.4 cm cm bud;Fig.D.Tetrad in 1.5-1.6 cm bud;Fig.E.Dyad in 1.5-1.6 cm bud;Fig.F.Triad in 1.5-1.6 cm bud;Fig.G.Meiotic cell in 1.5-1.6 cm cm bud;Fig.H.Tetrads in 1.7-1.8 cm bud;Fig.I.Tetrad and uninuclear microspore in 1.9-2.0 cm bud;Fig.J.Tetrad in 1.9-2.0 cm bud;Fig.K.Mature pollen in 2.1-2.2 cm bud;Fig.L.Mature pollen in 2.3-2.6 cm bud.
Piate ⅡDevelopmental stages of the carnation anther in different length of buds by section observation in winter
Fig.A.Microspore mother cell in 0.9-1.0 cm of bud;Fig.B.Microspore mother cell in 1.1-1.2 cm of bud;Fig.C.Microspore mother cell in 1.3-1.4 cm of bud;Fig.D.Meiotic cell in 1.3-1.4 cm of bud;Fig.E.Microspore mother cell in 1.5-1.6 cm of bud;Fig.F.Abortion in microspore mother cell of 1.5-1.6 cm bud;Fig.G.Meiotic cell in 1.5-1.6 cm of bud;Fig.H.Tetrad in 1.5-1.6 cm of bud;Fig.I.Abortion in microspore mother cell of 1.7-1.8 cm bud;Fig.J.Tetrad in 1.7-1.8 cm of bud;Fig.K.Microspore in 1.9-2.0 cm of bud;Fig.L.Tetrad in 1.9-2.0 cm of bud;Fig.M.Mature pollen in 2.1-2.2 cm of bud;Fig.N.Mature pollen in 2.1-2.2 cm of bud;Fig.O.Mature pollen in 2.3-2.6 cm of bud.
圖版 Ⅰ冬季香石竹不同長(zhǎng)度花蕾小孢子的發(fā)育特征(壓片法)
A.0.9~1.0 cm長(zhǎng)花蕾花粉母細(xì)胞時(shí)期;B.1.1~1.2 cm長(zhǎng)花蕾花粉母細(xì)胞時(shí)期;C.1.3~1.4 cm長(zhǎng)花蕾減數(shù)分裂時(shí)期;D.1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾四分體細(xì)胞;E.1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾二分體細(xì)胞;F.1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾三分體細(xì)胞;G.1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾減數(shù)分裂時(shí)期;H.1.7~1.8 cm長(zhǎng)花蕾四分體細(xì)胞;I.1.9~2.0 cm長(zhǎng)花蕾四分體時(shí)期和單核期細(xì)胞;J.1.9~2.0 cm長(zhǎng)花蕾四分體時(shí)期;K.2.1~2.2 cm長(zhǎng)花蕾成熟的花粉粒;L.2.3~2.6 cm長(zhǎng)花蕾成熟的花粉粒。
圖版 Ⅱ冬季香石竹不同長(zhǎng)度花蕾小孢子的發(fā)育特征(石蠟切片法)
A.0.9~1.0 cm長(zhǎng)花蕾花粉母細(xì)胞時(shí)期;B.1.1~1.2 cm長(zhǎng)花蕾花粉母細(xì)胞時(shí)期;C.1.3~1.4 cm長(zhǎng)花蕾花粉母細(xì)胞;D.1.3~1.4 cm長(zhǎng)花蕾減數(shù)分裂時(shí)期;E.1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾花粉母細(xì)胞;F.1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾花粉母細(xì)胞發(fā)生敗育;G.1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾減數(shù)分裂細(xì)胞;H.1.5~1.6 cm長(zhǎng)花蕾四分體時(shí)期;I.1.7~1.8 cm長(zhǎng)花蕾花粉母細(xì)胞發(fā)生敗育;J.1.7~1.8 cm長(zhǎng)花蕾四分體細(xì)胞;K.1.9~2.0 cm長(zhǎng)花蕾形成花粉;L.1.9~2.0 cm長(zhǎng)花蕾四分體細(xì)胞;M.2.1~2.2 cm長(zhǎng)花蕾成熟的花粉粒;N.2.1~2.2 cm長(zhǎng)花蕾成熟的花粉粒;O.2.3~2.6 cm長(zhǎng)花蕾成熟的花粉粒。
(編輯:潘新社)
Cytological Research on Microspore Abortion ofDianthuscaryophyllusunder Low Temperature Environment in Winter
ZHOU Xuhong,JIANG Yalian,LI Shuying,SU Yan,MO Xijun,GUI Min*
(Flower Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Science,Key Laboratory of Flower Breeding of Yunnan Province,National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture,Kunming 650205,China)
Abstract:The mechanism of pollen abortion of Dianthus caryophyllus was studied under low temperature environment in winter for further research hybrid breeding.Microsporogenesis process of male sterile was histologically examined using squash technique and paraffin embedded method.The results demonstrated:(1)only few mature pollen grains in winter was followed through the initiation of the microsporocyte formation,meiosis and the tetrad developmental period,finally formed pollen.(2)61% pollen mother cells aborted in 1.5-1.6 cm of buds and 71% pollen mother cells aborted in 1.7-1.8 cm of buds.(3)Furthermore,the portion of callose of tetrad could not dissolve resulting in microspores unreleased into the chamber.In brief,abnormal pollen mother cell and tetrad are the main cause of microspore in low temperature of winter.
Key words:low temperature;carnation;pollen;abortion
中圖分類號(hào):Q944.58
文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
作者簡(jiǎn)介:周旭紅(1978-),女,碩士,副研究員,主要從事花卉遺傳育種研究工作。E-mail:zhouxuhong7801@126.com*通信作者:桂敏,研究員,主要從事花卉遺傳育種研究工作。 E-mail:gming-114@163.com
基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31460530,31260491);國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心(2012FU125X10);云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2014FA044);院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2014CZYY019);云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)項(xiàng)目
收稿日期:2015-08-19;修改稿收到日期:2015-11-01
文章編號(hào):1000-4025(2016)01-0037-06
doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0037