孔德欽，劉江正，于衛(wèi)華，張　 濤，龍　 子，王　 欣，張曉迪，柏　 樺*，海春旭*（第四軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學系毒理學教研室，陜西　 西安　 710032）

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百草枯誘導AML12細胞凋亡過程中線粒體活性氧的作用

孔德欽，劉江正，于衛(wèi)華，張 濤，龍 子，王 欣，張曉迪，柏 樺*，海春旭*
（第四軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學系毒理學教研室，陜西 西安 710032）

【摘要】目的： 探討百草枯誘導小鼠肝細胞系AML12細胞凋亡過程中線粒體活性氧的作用。方法：AML12細胞分別給予0、25、50、100、200、300 μmol/L的百草枯處理。采用四甲基噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力；AnnexinV/PI雙染法結合流式細胞術檢測細胞凋亡率；DCFH-DA熒光探針經流式細胞儀測定細胞內活性氧水平；MitoSOX熒光探針檢測線粒體活性氧變化；激光共聚焦測定JC-1探針熒光強度以檢測線粒體膜電位變化。結果：與對照組比較，25~300 μmol/L的百草枯處理后可以誘導AML12細胞活力下降，且具有劑量效應關系(r=-0.94，P<0.01)；300 μmol/L的百草枯作用24 h可明顯誘導AML12細胞發(fā)生凋亡(P<0.05)；25~300 μmol/L 百草枯處理24 h后細胞內活性氧依次增加(P<0.05)，25~100 μmol/L百草枯作用24 h時線粒體活性氧增加且呈劑量效應關系(r=0.98，P<0.05)，而200 和300 μmol/L的百草枯作用24 h時線粒體活性氧水平降低(P<0.05)。細胞活力下降與細胞內活性氧升高呈負相關(r=-0.90， P<0.05)；晚期凋亡細胞的比例與細胞內活性氧呈正相關(r=0.96，P<0.01)；JC-1檢測線粒體膜電位結果顯示，與對照組相比，300 μmol/L的百草枯處理24 h時線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。結論：百草枯誘導AML12細胞凋亡過程主要由細胞整體水平的活性氧介導，提示線粒體活性氧并未直接參與百草枯誘導的肝損傷過程。

【關鍵詞】百草枯；活性氧；線粒體活性氧；線粒體膜電位；凋亡

作者信息： 孔德欽，Tel：029-84774882-804；E-mail：1084789645@qq.com。*通信作者，海春旭，E-mail：cx-hai@fmmu.edu.cn；柏 樺，E-mail：hua_bai@126.com

Involvement of mitochondrial reactive oxygen species on paraquat-induced apoptosis in AML12 cells

KONG Deqin，LIU Jiangzheng，YU Weihua，ZHANG Tao，LONG Zi，WANG Xin，ZHANG Xiaodi，BAI Hua*，HAI Chunxu*
(Department of Toxicology, School of Preventive Medicine, the Forth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate the role of mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) on the apoptosis of a mouse liver cell line-AML12 cells after their exposure to paraquat. METHODS：AML12 cells were treated with paraquat at concentrations of 0，25，50，100，200 and 300 μmol/L for 24 h，and cell viability was measured by MTT assay. Apoptosis was assessed by flow cytometry using Annexin V-FITC apoptosis detection kit. DCFH-DA fluorescent probe and MitoSOX were used to determine the level of ROS in whole cell and in mitochondria by flow cytometry，respectively. Mitochondrial membrane potential was evaluated by confocal microscope using JC-1 probe.

RESULTS：Paraquat from 25 to 300 μmol/L induced dose-dependent decrease of AML12 cells viability. Apoptosis was significantly induced by paraquat at 300 μmol/L for 24 h. Treatment with 25-100 μmol/L paraquat raised the level of mitochondrial reactive oxygen species. However，200 and 300 μmol/L paraquat decreased the level of mtROS. The increase of ROS level was closely related to the decrease of AML12 cells viability (r=-0.90，P<0.05)，and the ROS level was positively correlated with the proportion of the late apoptotic cells (r=0.96，P<0.01). Additionally，300 μmol/L paraquat markedly reduced mitochondrial membrane potential. CONCLUSION：Paraquat could induce apoptosis of AML12 cells via the induction o f w hole c ell R OS w hich s uggest t hat m tROS m ay n ot b e d irectly i nvolved i n p araquat-induced liver i njury.

【KEY WORDS】paraquat；reactive oxygen species；mitochondrial reactive oxygen species；mitochondrial membrane potential；apoptosis

百草枯(paraquat，PQ)，化學名稱為1-1-二甲基-4-4-聯吡啶陽離子鹽，是一種快速有效的滅生性除草劑，在世界范圍內被廣泛使用。但百草枯對人體毒性極大，口服中毒死亡率可達90%以上，目前尚無特效解毒藥。據美國中毒控制中心統計，2008年因百草枯中毒死亡人數居農藥中毒死亡人數之首[1]。百草枯進入人體后可通過產生過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導氧化應激[2]，進而導致多臟器功能損害，其中肝臟是百草枯中毒的重要靶器官之一[3]。百草枯中毒可引起嚴重肝損傷、肝功能衰竭。目前急性百草枯誘導肝損傷的中毒機制尚不十分清楚。

線粒體作為細胞損傷反應最為敏感的細胞器之一，除了為細胞提供能量外，在細胞凋亡、分化、腫瘤形成、免疫反應啟動、缺氧感應、鈣代謝調節(jié)等生理病理活動中也均發(fā)揮重要作用[4]。近年的研究發(fā)現百草枯誘導的細胞整體水平ROS的增加主要來源于線粒體[5-7]，但百草枯誘導細胞凋亡過程中線粒體活性氧(mtROS)的作用仍不明確，本實驗以小鼠肝細胞系AML12細胞為靶細胞，使用24 h 的百草枯干預模型[8-9]，初步探討百草枯誘導AML12細胞凋亡過程中mtROS的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

AML12細胞系由第四軍醫(yī)大學毒理學教研室細胞庫提供；四甲基噻唑藍(methyl thiazol tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)和2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′，7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)均購自Sigma公司；Annexin V /PI雙染凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司；JC-1染料購自南京建成生物工程研究所；MitoSOX購自Invitrogen公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司；新生牛血清(newborn bovine serum，NBS)購自四季青公司；PBS、0.25%胰蛋白酶購自上海吉諾醫(yī)藥生物技術有限公司。

1.2 主要儀器

醫(yī)用型潔凈工作臺(SW-CJ，蘇州安泰空氣技術有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo for 3111/371，USA)；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)；全波段酶標儀(infinite M200 PRO，Austria)；激光共聚焦顯微鏡 (Olympus fluo FV10i，Japan)；流式細胞儀(BD Accuri C6，USA)；全自動高速冷凍離心機(Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) AML12細胞是小鼠來源的正常肝細胞系，使用含10% NBS的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、CO2體積分數為5%及飽和濕度條件下培養(yǎng)。在細胞處于對數生長期時，用0.25%的胰蛋白酶消化，以含10% NBS的DMEM高糖培養(yǎng)基吹打均勻，稀釋成單細胞懸液，計數后接種于相應的細胞培養(yǎng)板進行各項指標的檢測。

1.3.2 MTT法檢測AML12細胞的活力 將AML12細胞以3×104/mL的濃度接種于96孔板，每孔100 μL，使用含10% N BS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，分別加入終濃度為0、25、50、100、200、300 μmol/L的PQ， 每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后吸棄PQ，按每孔200 μL加入0.5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，吸棄上清液，再加入150 μL的DMSO，上全波段酶標儀振蕩60 s，然后在490 nm處檢測各孔的吸光度D(490)值，以各PQ處理組與對照組的D(490)比值計算細胞活力的相對水平。

1.3.3 AnnexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡 將細胞以1×105/mL的濃度接種于6孔板，每孔1 mL，使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，分別加入2 mL 終濃度為0、25、50、100、200、300 μmol/L的PQ，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細胞，PBS(pH7.2~7.4)洗2次，按AnnexinV/PI試劑盒說明書的步驟每個樣品分別加入500 μL結合緩沖液、5 μL Annexin V和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況(EX 488 nm，EM 530 nm)。

1.3.4 DCFH-DA染色法檢測細胞內ROS 將細胞以1×105/mL的濃度接種于6孔板，每孔1 m L，過夜后，分別加入2 mL終濃度為0、25、50、100、200、300 μmol/L 的PQ，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細胞，加入DCFHDA染料(終濃度10 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min。離心后棄上清，PBS洗2次，離心收集細胞。加1 m L P BS使 細胞重懸，上流式細胞儀檢測(EX 488 nm，EM 530 nm)。數據獲取和分析均采用CFlowPlus軟件。

1.3.5 mtROS的檢測 MitoSOX是一種線粒體靶向的新型熒光染料，可以迅速進入活細胞中的線粒體。進入線粒體后，可被線粒體內的超氧陰離子自由基氧化，氧化之后可與核酸結合發(fā)出紅色的熒光。因此，通過檢測紅色熒光的強弱可反映線粒體內ROS的水平[10]。紅色熒光越強，提示mtROS水平越高；熒光越弱，提示mtROS水平越低。將細胞以3×104/mL的濃度接種6個激光共聚焦專用細胞培養(yǎng)皿，每皿1 mL，過夜后，分別加入1 mL終濃度為0、25、50、100、200、300 μmol/L的PQ，24 h后加入終濃度為5 μmol/L 的MitoSOX，37 ℃避光孵育30 min，棄去染色液，用PBS 洗2次，加1 mL PBS后上共聚焦顯微鏡進行觀察(EX 510 nm，EM 580 nm)，并用Image-Pro Plus 6軟件進行熒光強度的分析和處理。

1.3.6 線粒體膜電位的檢測 JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，△Ψm)的理想熒光探針。正常的膜電位水平可以使JC-1聚集在線粒體的基質中形成聚合物，并發(fā)出紅色熒光；而在異常情況下各種因素導致線粒體膜電位下降或喪失時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，只能以單體的形式存在于胞漿中，并產生綠色熒光。常用紅綠熒光強度的相對比例來衡量和評估線粒體去極化的程度。紅綠熒光強度比例越大，線粒體膜電位越高，紅綠熒光比例越小，膜電位越低。將細胞以3× 104/mL的濃度接種6個激光共聚焦小皿，每皿1 mL，過夜后，分別加入1 mL終濃度為0、25、50、100、200、300 μmol/L的PQ，24 h后按照JC-1試劑盒操作要求進行染色，上共聚焦顯微鏡觀察紅綠熒光強弱(EX 510 nm，EM 580 nm)，并用Image-Pro Plus 6軟件進行熒光強度的分析和處理。

1.4 統計學方法-采用SPSS 13.0統計軟件進行統計處理，數據以x ±s表示，組間數據的比較用t檢驗，兩組間的相關性分析用Pearson相關系數檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 不同濃度PQ對AML12細胞活力的影響

如圖1所示，與對照組相比，PQ各濃度組均可明顯誘導AML12細胞活力下降(P均<0.05)，且呈現明顯的劑量-效應關系(r=-0.94，P<0.01)。PQ濃度從25 μmol/L升高至300 μmol/L時，細胞活力損傷程度從0.84降至約0.5。

與對照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05.圖1 PQ對AML12細胞活力的影響(n=6)

2.2 不同濃度PQ對AML12細胞凋亡的影響

如圖2所示。對照組正常細胞占98.1%，凋亡細胞為0.5%；與對照組相比，PQ在200 μmol/L以內對AML12細胞均未引起明顯的凋亡(P>0.05)；而當PQ的濃度達到300 μmol/L時，細胞凋亡率顯著增加至約20%(P<0.05)，提示300 μmol/L的PQ可以誘導細胞發(fā)生凋亡。

Annexin V-FITCA：不同濃度的PQ處理24 h后用AnnexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡結果；B：Ⅱ象限+Ⅳ象限的凋亡細胞百分率(%). 與對照組比較，*P<0.05.圖2 PQ對AML12細胞凋亡的影響(n=3)

2.3 不同濃度PQ對細胞內ROS的影響

用流式細胞儀CFlow Plus軟件分析細胞內ROS如圖3所示。與對照組相比，不同濃度的PQ處理后細胞內ROS峰值發(fā)生右移，25、50、100、200、300 μmol/L的PQ處理后，ROS升高的細胞比例從空白對照組的50%依次升高至65%、72.2%、87.9%、91.1%、95.1%，如圖3A；分析熒光強度發(fā)現，隨著PQ濃度的依次增加，峰值整體右移，檢測細胞內ROS染料的熒光強度依次增加(P均<0.05)，如圖3B和3C。因此，PQ處理可以顯著增加細胞內ROS的水平，并存在明顯的劑量-效應關系(r=0.96，P<0.01)。

A：不同濃度的PQ處理24 h后對AML12細胞內ROS峰值的影響；B：不同處理組AML12細胞內ROS峰值的比較；C：對各組熒光強度的統計分析結果. 與對照組比較，*P<0.05.圖3 不同濃度的PQ對AML12細胞內ROS的影響(n=3)

2.4 不同濃度PQ對mtROS的影響

如圖4所示，MitoSOX染色AML12細胞內的mtROS熒光強度分析結果顯示：與對照組相比，25~100 μmol/L的PQ處理24 h后，紅色熒光逐漸增強(P均<0.05)，至100 μmol/L時達到最大，200、300 μmol/L的PQ使熒光明顯降低，差異均具有統計學意義(P均<0.05)。這說明PQ在25~100 μmol/L范圍內可以劑量依賴性地增加mtROS的水平(r=0.98， P<0.05)，而200和300 μmol/L的PQ使mtROS水平下降。

2.5 細胞內ROS、mtROS與細胞活力、晚期凋亡細胞比例的相關性分析

經相關性分析，我們發(fā)現細胞活力下降與細胞內ROS升高呈現負相關，細胞內ROS越高，細胞活力越低(r=-0.90，P<0.05，如圖5A)；而細胞活力與mtROS的變化無明顯相關性(r=0.17，P>0.05)。晚期凋亡細胞的比例與細胞內ROS呈正相關關系(r=0.96，P<0.01，如圖5B)；而晚期凋亡細胞的比例與mtROS無明顯相關關系(r=-0.48，P>0.05)。

2.6 不同濃度PQ對線粒體膜電位的影響

JC-1檢測線粒體膜電位結果和熒光強度分析如圖6、7所示。與對照組相比，25~100 μmol/L的PQ處理后，紅綠熒光的比值逐漸增加(P均<0.05)，至100 μmol/L時達最大值，200 μmol/L的PQ使熒光強度開始降低，但高于對照組水平(P<0.05)，而300 μmol/L的PQ可以明顯降低紅綠熒光的比值，并低于對照組水平(P< 0.05)，這說明PQ在25~200 μmol/L范圍內可以增加線粒體膜電位，而300 μmol/L PQ可顯著降低線粒體膜電位。

A：MitoSOX染色后激光共聚焦檢測結果；B：Image-Pro Plus 6.0軟件進行熒光強度分析結果. 與對照組比較，*P<0.05.圖4 不同濃度的PQ對mtROS的影響(n=6)

A：細胞活力相對水平與細胞內ROS相關性分析圖；B：晚期凋亡細胞比例與細胞內ROS相關性分析圖.圖5 相關性分析

圖6 激光共聚焦測定不同濃度PQ對線粒體膜電位的影響(JC-1染色)

與對照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05.圖7 Image-Pro Plus 6.0軟件分析線粒體膜電位紅綠熒光比值

3 討 論

目前對百草枯中毒尚無特異性解毒藥物。百草枯中毒的機制尚不清楚，研究發(fā)現氧化應激在百草枯中毒中起著重要作用[11]。百草枯進入細胞后可作為電子受體，在細胞內與多種分子發(fā)生氧化還原反應，產生過量的ROS，如過氧化氫和超氧陰離子自由基，擾亂細胞內正常的氧化還原平衡，導致細胞內蛋白質、脂質和DNA的氧化損傷，從而引發(fā)細胞功能障礙，最終導致細胞凋亡和壞死[12]。線粒體在維持正常的細胞生理活動中起著非常關鍵的作用，可以調控細胞的生存和死亡[13]。

ROS作為重要的凋亡誘導因子，在線粒體途徑的凋亡過程中具有重要的調控作用。正常情況下，線粒體電子傳遞鏈中會有部分電子“漏出”，稱為“電子漏”，從“電子漏”產生的超氧陰離子是胞內ROS的主要來源，占細胞內ROS總量的98%左右，可以滿足胞內對適量ROS的需求[14]。而各種因素導致“電子漏”即線粒體活性氧增加時，會導致線粒體功能改變、氧化還原水平失衡，發(fā)生氧化應激反應，進而誘導細胞發(fā)生凋亡。

本文對PQ誘導AML12細胞凋亡過程中線粒體活性氧的作用進行了初步探究，發(fā)現25~300 μmol/L的PQ處理后可以劑量依賴性的降低細胞活力，雖然隨著PQ濃度的增加，細胞活力逐漸下降，但由于MTT實驗的固有局限性，尚不能判斷細胞活力下降原因是由于PQ抑制細胞增殖還是促進凋亡壞死，故對PQ處理過的細胞進行凋亡的檢測。凋亡檢測結果發(fā)現300 μmol/L的PQ可以顯著誘導細胞發(fā)生凋亡，這與Chang等[15]報道的大于1 μmol/L的PQ誘導神經祖細胞發(fā)生凋亡的結果不一致，這可能是神經元前體細胞的抗氧化防御能力較弱，對各種氧化損傷更敏感的原因[16-18]。

我們發(fā)現隨著PQ濃度的增加，細胞內整體ROS水平逐漸增加。Castello等[7]研究腦組織的損傷時提出PQ引起的細胞內ROS增加主要來源于線粒體，我們用MitoSOX檢測線粒體ROS水平發(fā)現，PQ在25~100 μmol/L范圍內可以劑量依賴性地增加線粒體活性氧的水平，與細胞內ROS變化不同，200、300 μmol/L的PQ會降低線粒體活性氧水平，這其中的機制暫不清楚，有待進一步研究。

為了明確PQ誘導細胞損傷與細胞內ROS及mtROS的關系，我們對細胞內ROS和mtROS與細胞活力、晚期凋亡細胞比例進行了相關性分析，發(fā)現雖然低劑量的PQ可以增加mtROS的水平，但真正與細胞損傷相關的是細胞內整體ROS水平的增加。因為在PQ誘導細胞氧化還原紊亂過程中線粒體ROS的增加先于胞漿中的ROS[7]，因此，mtROS增加引發(fā)的細胞水平的ROS升高在PQ誘導細胞凋亡過程中可能位于初始環(huán)節(jié)。目前常使用維生素C等光譜抗氧化劑治療PQ中毒患者[19-20]，但療效常不肯定，可能是有兩個原因：一是ROS發(fā)揮生物學效應具有細胞內隔室效應，一般光譜抗氧化劑很難到達ROS存在位點，限制了其抗氧化效果；二是對PQ中毒患者往往不能早期給藥。因此，使用具有線粒體靶向的抗氧化劑如MitoQ進行早期治療[21-25]是否更有效值得進一步研究。

正常情況下，線粒體內膜通透性很小，線粒體將電子傳遞鏈產生的質子(H+)儲存于線粒體內膜，形成橫跨線粒體內膜的電化學質子梯度和電位差，以維持線粒體膜電位。為明確ROS增加對線粒體功能膜電位的影響，我們還檢測了不同濃度PQ處理后線粒體膜電位的變化，發(fā)現300 μmol/L以下濃度的PQ使線粒體膜電位增加，其意義可能為促進PQ進入線粒體[6，26]；300 μmol/L的PQ可以明顯降低線粒體膜電位水平，提示細胞已進入凋亡的早期階段[27]。以上結果均說明百草枯誘導AML12細胞凋亡過程主要由細胞整體水平的ROS介導，提示mtROS并未直接參與百草枯誘導的肝損傷過程。

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收稿日期：2015-09-01；

修訂日期：2015-11-30

中圖分類號：R994.6

文獻標志碼：A

文章編號：1004-616X(2016)01-0001-07

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.001