郭子平,翟清華,曾令鋒,鄧西平,楊淑慎

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西 楊凌　712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室,陜西 楊凌　712100)

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小麥TaGAPC定點突變體基因載體構(gòu)建及其原核表達

郭子平1,翟清華1,曾令鋒1,鄧西平2,楊淑慎1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西 楊凌712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室,陜西 楊凌712100)

摘要：為了研究催化活性半胱氨酸Cys154、Cys158殘基對小麥細(xì)胞質(zhì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(TaGAPC)蛋白酶活性的影響,利用重疊延伸PCR法分別將這2個位點的半胱氨酸突變成絲氨酸,并分別連入pET28a(+)原核表達載體。在25 ℃條件下，TaGAPC及其定點基因TaCys154S/TaCys158S經(jīng)0.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后高效表達,SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示,目標(biāo)重組蛋白均為可溶性且大小約為40 kDa,與預(yù)測結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上,經(jīng)超聲波破菌及鎳柱純化獲得3種純化重組蛋白。這為后續(xù)TaGAPC及其定點突變體蛋白酶活性測定及活性位點分析提供試驗材料。

關(guān)鍵詞：TaGAPC;重疊延伸PCR;定點突變;原核表達;蛋白純化

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為糖酵解反應(yīng)的一種關(guān)鍵酶,在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶Ⅰ)和無機磷酸鹽存在的情況下,催化3-磷酸-甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油醛[1]。GAPDH普遍存在于原核和真核生物中,具有高度種屬保守序列[2-3]。長期以來,GAPDH由于在同種組織或細(xì)胞中相對恒定的表達量,所以一直被當(dāng)作“管家基因”和內(nèi)參[4]。然而近年來大量研究發(fā)現(xiàn),GAPDH除參與糖酵解反應(yīng)外,還參與許多其他代謝過程,是一種多功能蛋白質(zhì)。在哺乳動物細(xì)胞中,GAPDH作為一種介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間信息傳遞的穿梭蛋白,其廣泛的生理功能涉及DNA復(fù)制與修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡、前體tRNA的運輸、組蛋白基因的表達調(diào)控、端粒結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、核膜融合和微管成束等[5-9]。然而有關(guān)植物GAPDH參與非糖酵解途徑的功能研究則不甚清楚。

在高等動植物中,局部序列比對顯示GAPDH蛋白底物結(jié)合位點區(qū)的第150-161的氨基酸序列高度保守,而位于第154位(Cys154)、第158位(Cys158)的半胱氨酸Cys(相應(yīng)在擬南芥中的編號分別為Cys149和Cys153)是GAPDH蛋白酶催化活性位點[10]。GAPDH蛋白活性位點的Cys殘基巰基易受不同種類的翻譯后氧化還原修飾(PTMs)以響應(yīng)不同的ROS-和RNS-依賴的氧化還原信號[11]。GAPDH蛋白的PTMs包括磺酸化、亞硝基化和谷胱甘肽化等,這些修飾不但影響GAPDH酶活性導(dǎo)致其部分或全部失活,并且進一步影響GAPDH與其他蛋白的相互作用,導(dǎo)致GAPDH蛋白定位改變,引發(fā)其多樣性功能[10,12-13]。在擬南芥中,細(xì)胞質(zhì)AtGAPC (AtGAPC1和AtGAPC2)活性位點半胱氨酸殘基巰基S-亞硝基化導(dǎo)致蛋白可逆失活[14-15],而AtGAPC1酶活性嚴(yán)格依賴催化Cys149,并且該殘基對H2O2極為敏感,但定點突變Cys153對酶活性幾乎無影響[16]。H2O2通過修飾活性位點的Cys殘基巰基促進AtGAPC與磷脂酶Dδ(Phospholipase Dδ,PLDδ)的相互作用,進而介導(dǎo)響應(yīng)ABA和水分脅迫[17]。在粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)中,GAPDH的Cys殘基被H2O2瞬時氧化后促進GAPDH與MAPK途徑中Mcs4相互作用,但是點突變Cys152造成該相互作用減弱,進而影響H2O2脅迫信號傳導(dǎo)[18]。Piattoni等[19]推測小麥細(xì)胞質(zhì)TaGAPC蛋白活性位點的Cys154可能至少是受H2O2等氧化作用的一個重要氨基酸,但并未有后續(xù)試驗對該推測及另外一個位點Cys158對酶活性的影響進行證實和研究。

本試驗在已構(gòu)建成功的pMD19T-TaGAPC載體的基礎(chǔ)上,通過重疊延伸PCR技術(shù)分別獲得TaGAPC保守區(qū)活性位點Cys154、Cys158定點突變基因全長TaCys154S、TaCys158S,然后構(gòu)建原核表達載體,在大腸桿菌中用IPTG誘導(dǎo)表達得到可溶性的重組蛋白并進行了純化,這為后續(xù)TaGAPC及其定點突變體蛋白酶活性測定及TaGAPC催化活性位點的分析提供論證基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試劑和載體及菌種

高保真DNA聚合酶pfu、DNA聚合酶Taq、T4DNA 連接酶、IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、克隆載體pGEM-T easy、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自TIANGEN公司;限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ、DNA分子量標(biāo)記DL15000和DL2000購自THERMO公司;Ni-Agrose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)購自CWBIO公司;大腸桿菌DH5α菌株和pMD19T載體為西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊淑慎教授實驗室保存。pET28a(+)原核表達質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳坤明教授惠贈。

1.2引物

所有引物均合成于北京奧科鼎盛生物科技有限公司,其序列如下(表1)。

表1　本試驗所用引物

注：斜體部分為保護堿基；下劃線部分為酶切位點；粗體部分為引入的定點突變堿基。

Note:Italics sections are protective bases；Underlined sequences are restriction enzyme sites；Bold sequences are the site-directed bases.

1.3試驗方法

1.3.1pET28a(+)-TaGAPC表達載體的構(gòu)建以野生型靶基因TaGAPC(NCBI登錄號:N° EF592180,基因全長1 014 bp,已克隆在pMD19T載體上,重組質(zhì)粒命名為pMD19T-TaGAPC)為模板,設(shè)計引物TaGAPC-for、TaGAPC-rev擴增TaGAPC基因,PCR擴增體系為20 μL:TaqBuffer 4 μL,MgCl21.5 μL,dNTP 0.8 μL,正、反向引物各0.5 μL,模板1 μL,Taq聚合酶0.2 μL,ddH2O 11.5 μL;PCR反應(yīng)體系為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,32個循環(huán);72 ℃延伸7 min。反應(yīng)完成后在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測PCR產(chǎn)物,DNA膠回收試劑盒純化回收位置正確的條帶。之后對純化的PCR產(chǎn)物、pET28a(+)質(zhì)粒進行NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切并連接。連接反應(yīng)體系為10 μL:TaGAPC片段6 μL、pET28a(+)載體2.0 μL、T4Buffer 1 μL、T4連接酶1 μL輕柔混勻后16 ℃連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,然后涂布于LB平板上(含100 mg/mL卡那霉素)培養(yǎng)至長出單菌落,挑取單菌落進行PCR檢測和提取重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證,并送交北京奧科公司測序驗證。

1.3.2pGEM-T easy-TaCys154S/TaCys158S載體的構(gòu)建利用重疊延伸PCR法將TaGAPC基因第154,158位的半胱氨酸殘基突變成絲氨酸[20-22]。以TaGAPC基因為模板,采用pfu聚合酶,在第一輪PCR中,以TaGAPC-for/TaCys154S-down、TaCys154S-up/TaGAPC-rev,或TaGAPC-for/TaCys158S-down、TaCys158S-up/TaGAPC-rev這4對引物分別擴增TaCys154S/TaCys158S基因小片段。PCR反應(yīng)體系為50 μL:10×pfu Buffer(+MgSO4) 5 μL,dNTP 5 μL,正、反向引物各1 μL,模板1 μL,pfu聚合酶1 μL,ddH2O 36 μL。反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸40 s,32個循環(huán);72 ℃延伸7 min。反應(yīng)完成后在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測PCR產(chǎn)物,DNA膠回收試劑盒純化回收位置正確的條帶。

以上述分別獲得的TaCys154S/TaCys158基因小片段為模板,進行第二輪PCR反應(yīng)合成相應(yīng)的全長片段。PCR反應(yīng)體系為20 μL:10×pfu Buffer(+MgSO4) 5 μL,dNTP 1 μL,TaGAPC-for、TaGAPC-rev引物各0.5 μL,模板分別為2 μL/1 μL,pfu高保真聚合酶0.2 μL,ddH2O 9.8 μL。反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,32個循環(huán);72 ℃延伸7 min。反應(yīng)完成后電泳檢測PCR產(chǎn)物,取條帶位置正確的PCR產(chǎn)物進行末端加尾反應(yīng),體系為100 μL:4 μL dNTP,0.5 μLTaq聚合酶,95.5 μL PCR產(chǎn)物,于72 ℃,PCR延伸15 min,反應(yīng)完成后DNA膠回收試劑盒純化回收產(chǎn)物。

將TaCys154S/TaCys158S基因全長片段分別連接至pGEM-T easy載體。將基因全長片段5.7 μL、pGEM-T easy載體0.3 μL、T4Buffer 3 μL、T4連接酶1 μL共10 μL輕柔混勻后16 ℃連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,然后涂布于LB平板上(含100 mg/mL卡那霉素,24 mg/mL IPTG,及20 mg/mL X-gal),37 ℃倒置培養(yǎng)。挑取單克隆進行菌落PCR檢測和提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證,將陽性質(zhì)粒送交北京奧科公司測序。

1.3.3pET28a(+)-TaCys154S/TaCys158S原核表達載體的構(gòu)建對重組質(zhì)粒pGEM-T easy-TaCys154S/TaCys158S進行NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切試驗。雙酶切體系為50 μL:10×Tango Buffer 5 μL,NdeⅠ0.5 μL,BamHⅠ0.5 μL,質(zhì)粒20 μL,ddH2O 24 μL。酶切反應(yīng)于37 ℃水浴中保持12 h后,利用DNA膠回收試劑盒純化回收位置正確的條帶。然后將其連接到同樣經(jīng)NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切的pET28a(+)載體。連接反應(yīng)體系為10 μL:TaCys154S/TaCys158S基因全長片段6 μL、pET28a(+)載體2.0 μL、T4Buffer 1 μL、T4連接酶1 μL輕柔混勻后16 ℃連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,然后涂布于LB平板上(含100 mg/mL卡那霉素),37 ℃倒置培養(yǎng)。挑取單克隆進行菌落PCR檢測和提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證,將陽性質(zhì)粒送交北京奧科公司測序。

1.3.4TaGAPC和TaCys154S/TaCys158S基因的原核表達純化將已構(gòu)建的原核表達載體pET28a(+)-TaGAPC/TaCys154S/TaCys158S分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達,方法參照[16,23],但略有優(yōu)化。在37 ℃培養(yǎng)的LB平板(含100 mg/mL卡那霉素)上挑取陽性單菌落進行擴大培養(yǎng),至OD600為0.4~0.6,于25 ℃,0.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達12 h,6 500 r/min離心收集菌體,25 mmol/L Tris-HCl(pH值7.5)清洗2次后放于-80 ℃保存。超聲波工作條件為:250 W,工作4 s,間歇6 s,共1 h。SDS-PAGE電泳檢測表達蛋白均為可溶性蛋白,10 400 r/min離心2次取上清,使用Ni-Agrose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)純化蛋白,按照說明書中的步驟操作。SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化效果。

2結(jié)果與分析

2.1pGEM-T-easy-TaCys154S/TaCys158S克隆重組載體的構(gòu)建

通過重疊延伸PCR法在TaGAPC基因中引入定點突變,即將Cys154、Cys158殘基定點突變成絲氨酸,之后連接pGEMT-easy載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌并培養(yǎng)單克隆。對菌落PCR檢測為陽性的單克隆進行測序，結(jié)果顯示定點突變成功。重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、BamH Ⅰ雙酶切的電泳檢測結(jié)果如圖1所示。

2.2 pET28a(+)-TaGAPC/TaCys154S/TaCys158S原核表達重組載體的構(gòu)建

對擴增的TaGAPC產(chǎn)物及重組質(zhì)粒pGEMT-easy-TaCys154S/TaCys158S,分別經(jīng)NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切后電泳檢測,并分別純化回收目的條帶,將其連接到經(jīng)同樣NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切的pET28a(+)表達載體。選取菌落PCR檢測為陽性的單菌落,搖菌提取質(zhì)粒進行雙酶切及測序驗證,得到約1 014 bp片段(圖2),與預(yù)期大小一致,說明重組原核表達載體pET28a(+)-TaGAPC/TaCys154S/TaCys158S構(gòu)建成功。

M.DL15000分子量標(biāo)準(zhǔn);1.pGEM-T easy-TaCys154S

A:M.DL15000分子量標(biāo)準(zhǔn);1.pET28a(+)-TaGAPC雙酶切片段;B:M.DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn);1.pET28a(+)-TaCys154S雙酶切片段;2.pET28a(+)-TaCys158S雙酶切片段。

A:M.DL15000 DNA Marker;1.Restriction enzyme fragments of pET28a(+)-TaGAPC;B:M.DL2000 DNA Marker;1.Restriction enzyme fragments of pET28a(+)-TaCys154S;2.Restriction enzyme fragments of pET28a(+)-TaCys158S.

圖2重組質(zhì)粒pET28a(+)-TaGAPC(A)和

pET28a(+)-TaCys154S/TaCys158S(B)酶切鑒定

Fig.2Restriction enzyme digestion of the recombinant

expression vectors pET28a(+)-TaGAPC(A) and

pET28a(+)-TaCys154S/TaCys158S(B)

2.3TaGAPC和TaCys154S/TaCys158S重組蛋白的原核表達及純化

將TaGAPC及其TaCys154S/TaCys158S原核表達重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),于37 ℃條件下,200 r/min搖菌至OD600為0.4～0.6,在25 ℃條件下,0.25 mmol/L ITPG誘導(dǎo)表達12 h,離心收集菌體,經(jīng)超聲波破菌及Ni-IDA柱純化得到可溶性重組蛋白(圖3)。從圖3可看出,純化蛋白分子量約為40.0 kDa(純化蛋白N端含6×His標(biāo)簽),與預(yù)期結(jié)果一致,并且獲得較高純度的重組蛋白。

M.蛋白Marker(LOW);WT.TaGAPC蛋白;

3討論

作為糖酵解代謝的一種關(guān)鍵酶,GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化為生命活動提供能量[1]。GAPDH基因幾乎在各組織或器官中相對穩(wěn)定且高水平表達,故被廣泛用作標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參研究生物體內(nèi)其他基因和蛋白的表達[4,24]。但最近大量研究表明,GAPDH 是一種多功能蛋白質(zhì),除參與糖酵解以外,還參與其他非生物代謝過程[5-9]。相對于動物細(xì)胞僅含有一種GAPDH同工酶,高等植物GAPDH包含4種由不同基因編碼的同工酶,不同的同工酶由于其亞細(xì)胞定位不同導(dǎo)致其參與的生理過程具有多樣性[7]。

在高等植物中,位于GAPDH底物結(jié)合區(qū)約150-161的氨基酸序列高度保守,而位于該保守區(qū)的活性殘基Cys154、Cys158對GAPDH酶活性及調(diào)節(jié)GAPDH參與非糖酵解代謝過程至關(guān)重要[10]。在擬南芥中,細(xì)胞質(zhì)AtGAPC1活性嚴(yán)格依賴Cys149,該位點的突變導(dǎo)致該酶幾乎無活性,而殘基Cys153的突變對酶活性影響甚微[16]。小麥細(xì)胞質(zhì)GAPDH底物(G3P和NAD+)結(jié)合試驗表明,Cys154可能至少是受氧化作用的活性位點之一,該研究與在人類或擬南芥GAPDH同源酶中的發(fā)現(xiàn)相同[19]。GAPDH蛋白活性位點的Cys殘基巰基容易受生理或體外H2O2、NO、GSH等作用發(fā)生氧化還原修飾,如磺酸化、硝基化和谷胱甘肽化等,導(dǎo)致GAPDH蛋白可逆或不可逆失活,而失活的GAPDH通過與其他蛋白相互作用改變其亞細(xì)胞定位,參與不同生理過程[12-13,17-18]。

本研究在獲得小麥細(xì)胞質(zhì)TaGAPC基因cDNA全長序列的基礎(chǔ)上,采用重疊延伸PCR法對其催化活性位點的Cys154、Cys158殘基分別進行定點突變,連接pGEM-T easy克隆載體進行測序等驗證突變成功,并且未引入其他突變位點。然后構(gòu)建了原核表達載體pET28a(+)-TaCys154S/TaCys158S,并采用鎳柱純化技術(shù)獲得可溶性重組蛋白,為后續(xù)TaGAPC的Cys154、Cys158這2個重要半胱氨酸活性位點分析及研究TaGAPC在小麥細(xì)胞中參與的調(diào)控機制提供試驗材料。本研究在TaGAPC基因中引入突變位點時采用了重疊延伸PCR技術(shù)。該技術(shù)運用廣泛、靈活,不受突變位置及突變類型的限制,可對DNA片段進行定點突變甚至多點突變,在闡明基因的調(diào)控機理、改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用價值[22]。

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Construction ofTaGAPCSite-directed Mutagenesis Gene Vector and Prokaryotic Expression Analysis from Wheat

GUO Ziping1,ZHAI Qinghua1,ZENG Lingfeng1,DENG Xiping2,YANG Shushen1

(1.College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling712100,China;2.State Key Laboratory of Soil Erosion and Dryland Farming on Loess Plateau,Northwest A&F University,Yangling712100,China)

Abstract：In order to elucidate the roles of catalytic active Cys154,Cys158in Triticum aestivum L.cytoplasmic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TaGAPC),these two cysteins were site-directed mutated into serine by overlap-extension PCR.Then recombinant prokaryotic expression vectors of TaGAPC and its mutants TaCys154S/TaCys158S were constructed and transformed into E.coli BL21.The recombinant protein were induced by 0.25 mmol/L IPTG at 25 ℃ and subsequently purified by Ni2+-IDA column.These researches could lay the foundation for the enzyme activity assay of TaGAPC and its mutants TaCys154S/TaCys158S and cysteine active sites.

Key words:TaGAPC;Overlap-extension PCR;Site-directed mutagenesis;Prokaryotic expression;Protein purification

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.008

中圖分類號：Q78;S512.03

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0046-05

作者簡介：郭子平(1989-),男,河南商丘人,在讀碩士,主要從事植物逆境細(xì)胞分子生物學(xué)研究。通訊作者：楊淑慎(1956-),女,陜西黃陵人,教授,博士,主要從事植物抗逆生理、植物細(xì)胞培養(yǎng)工程方面的研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31271625);黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室專項 (10502)

收稿日期：2015-11-27