陳佩，顏家保，，武文麗，胡茜茜（武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 43008；武漢科技大學(xué)教務(wù)處，湖北 武漢 43008）

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鄰二甲苯高效降解菌的分離及其降解特性

陳佩1，顏家保1，2，武文麗1，胡茜茜1
（1武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081；2武漢科技大學(xué)教務(wù)處，湖北 武漢 430081）

摘要：以鄰二甲苯作為唯一碳源，從長期受焦化廢水污染的土壤中分離得到一株能降解鄰二甲苯的高效菌株LJ5，經(jīng)生理生化和16S rDNA鑒定，該菌株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。菌株LJ5適宜的降解條件為：培養(yǎng)溫度35℃，pH=7.0～8.0，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。菌株LJ5在鄰二甲苯濃度高達(dá)2500mg/L時，對其的去除率在30h內(nèi)可達(dá)到73%，它對鄰二甲苯的降解過程符合Monod動力學(xué)方程，當(dāng)鄰二甲苯濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于64.32mg/L時，LJ5降解底物速率最高，達(dá)到43.29mg/(L?h)。菌株LJ5能在實際焦化廢水中很好的生長，菌液投加48h后可使COD降解率達(dá)到34.74%。

關(guān)鍵詞：鄰二甲苯；分離；降解；動力學(xué)

第一作者：陳佩（1990—），女，碩士研究生。E-mail 504532896@qq.com。聯(lián)系人：顏家保，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為環(huán)境友好化工新技術(shù)。E-mail 972787445@qq.com。

焦化廢水含有大量有毒有機(jī)物，如酚類、苯系物及吡啶等雜環(huán)化合物[1]。鄰二甲苯是一種典型的苯系物污染物，由于其毒性大和難生物降解的性質(zhì)使得傳統(tǒng)生物法對其處理效果不佳[2]。任源等[3]研究發(fā)現(xiàn)焦化廢水經(jīng)生物處理后的出水中仍含有苯類物質(zhì)，因此，向生物處理系統(tǒng)中投加從自然界中篩選出的高效菌[4]，從而提高對目標(biāo)污染物的去除率，受到了國內(nèi)外廣大環(huán)保者的關(guān)注。目前，已報道的降解苯系物的微生物有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）等，但其對苯系物的降解速率都較低并且對高濃度的苯系物的耐受性較差[5-7]。

本研究從長期受焦化廢水污染的土壤中篩選得到一株能以鄰二甲苯為唯一碳源的高效降解菌，對該菌進(jìn)行了生理生化和16S rDNA鑒定，并就其降解和生長特性進(jìn)行了研究，為對鄰二甲苯的生物強(qiáng)化處理提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

實驗所用菌源取自武漢平煤武鋼聯(lián)合焦化有限責(zé)任公司污水處理廠內(nèi)長期受焦化廢水污染的土壤，呈黑色。

1.2 試劑

鄰二甲苯及正己烷為色譜純標(biāo)準(zhǔn)，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 培養(yǎng)基

LB富集培養(yǎng)基：NaCl 1.0g，蛋白胨 1.0g，酵母提取物0.5g，蒸餾水定容至100mL，調(diào)節(jié)pH=7.2左右。

鄰二甲苯無機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2HPO41.5g，KH2PO41.5g，(NH4)2SO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02g， CaCl20.01g，2mL微量元素儲備液，蒸餾水定容至1000mL，pH值約為7.0，120℃、0.1～0.15MPa高壓鍋內(nèi)滅菌后加入鄰二甲苯作為唯一碳源。

平板培養(yǎng)基：每100mL LB液體培養(yǎng)基中各加入約2g左右瓊脂粉。

1.4 主要儀器

T6-新世紀(jì)型紫外可見光分光光度計，北京譜析儀器有限責(zé)任公司。

1.5 菌株的篩選

稱取15g土壤加入裝有100mL自來水的錐形瓶中，振蕩24h，靜置后離心，取5mL上清液接種于已滅菌的LB培養(yǎng)基內(nèi)富集培養(yǎng)24h。取2mL富集的菌液轉(zhuǎn)接至含有100mg/L鄰二甲苯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中于30℃、150r/min下培養(yǎng)，待培養(yǎng)基由澄清變渾濁后取2mL菌液接入底物濃度更高的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中同條件下培養(yǎng)，以此來馴化鄰二甲苯降解菌，鄰二甲苯的濃度分別為100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L、2000mg/L。因為鄰二甲苯難溶于水且易揮發(fā)，本實驗在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入0.7%（體積比）吐溫-80助溶[6]，并用封口膜封住瓶口，保證鄰二甲苯基本不揮發(fā)。將馴化后的菌液采用稀釋涂布平板和平板劃線法分離、純化得到單菌落，然后檢測各菌株對底物的降解率。

1.6 菌種的鑒定

將降解速率最高的一株單菌菌液稀釋涂布到LB平板上，于35℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，從菌落的外形、大小、顏色等方面來觀察。生理生化特征實驗參考文獻(xiàn)[8]來進(jìn)行。提取細(xì)菌DNA[9]，16S rDNA PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物回收純化后送至武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.7 高效菌降解特性

（1）將高效菌接入含有1000mg/L鄰二甲苯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，探究不同溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速對其降解能力的影響，找出其適宜的生長條件，研究不同底物濃度時菌株的降解特性，每組實驗均設(shè)置對照組。

（2）對菌株降解鄰二甲苯的過程進(jìn)行動力學(xué)研究。

（3）將高效菌按接種量2%分別接入含有250mg/L的苯、甲苯、喹啉、己二酸二辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯、吡啶、苯酚和鄰甲酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在其適宜的生長條件下培養(yǎng)，間隔一段時間取樣檢測菌密度。

（4）將高效菌加入實際焦化廢水中，考察其對COD的降解情況。錐形瓶中溶液的組成如下：①實驗組，12mL廢水原水+83mL蒸餾水+5mL菌液；②對照組，12mL廢水原水+88mL蒸餾水。將錐形瓶放在35℃、150r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，定時取樣檢測COD的濃度。

1.8 分析方法

（1）細(xì)菌的菌密度由紫外分光光度計測定培養(yǎng)液在波長600nm處的吸光度值表示；鄰二甲苯含量的測定采用紫外分光光度法。由于鄰二甲苯難溶于水，本實驗均采用正己烷等體積整瓶萃取培養(yǎng)基中剩余的底物，于波長210nm處測定鄰二甲苯含量；COD的測定采用重鉻酸鉀法。

（2）鄰二甲苯降解率的計算如式(1)。

式中，C0為對照組中殘留底物濃度，mg/L；C1為實驗組中殘留底物濃度，mg/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效菌的篩選與鑒定

經(jīng)過分離純化，得到10株能夠降解鄰二甲苯的菌株，選取其中降解能力最好的一株LJ5來進(jìn)行后續(xù)研究。菌株LJ5為革蘭氏陰性菌，菌落呈圓形，微凸，表面濕潤光滑。通過菌落形態(tài)和生理生化試驗結(jié)果初步推斷菌株LJ5與假單胞菌（Pseudomonas sp.）相似。

對菌株LJ5進(jìn)行16S rDNA測序后，將測得的基因序列輸入到Blast中在線進(jìn)行比對，得到分析數(shù)據(jù)，其中與菌株LJ5序列相關(guān)性達(dá)到99%甚至更高的均是假單胞菌，因此可以判斷LJ5在分子生物學(xué)上歸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

2.2 高效菌的降解特性

2.2.1 溫度對菌株降解鄰二甲苯的影響

溫度主要通過影響微生物體內(nèi)酶的活性從而對細(xì)菌的生長和降解性能產(chǎn)生一定的促進(jìn)或抑制作用。溫度過高或過低都會使酶的活性降低，只有適宜的溫度才有利于微生物的生長和代謝。在pH值為7.0、搖床轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下，不同溫度對鄰二甲苯降解率的影響如圖1所示。

圖1 溫度對菌株LJ5降解性能的影響

從圖1中可以看出，在25～35℃之間，隨著溫度升高，鄰二甲苯的降解率增大，在35℃時達(dá)到98.75%，而40℃時有所下降。這可能是因為25℃時溫度過低使得微生物體內(nèi)酶的活性較差，從而降解能力變差；40℃時溫度過高，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)酶的活性降低甚至失活。在24h之前，30℃、35℃和40℃時的降解曲線基本重合，這可能是因為前期營養(yǎng)物質(zhì)豐富，環(huán)境對其影響不大，隨著時間的延長，底物被消耗，溫度對高效菌的影響開始顯著。因此，菌株LJ5的適宜生長和降解溫度為35℃。2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對菌株降解鄰二甲苯的影響

pH值能夠影響微生物的細(xì)胞膜所帶的電荷和改變培養(yǎng)基中有機(jī)物的離子化程度，因此是保證微生物能否正常生長和代謝的一個重要因素。在培養(yǎng)溫度為35℃、搖床轉(zhuǎn)速150r/min的條件下，不同培養(yǎng)基初始pH值對鄰二甲苯降解率的影響如圖2所示。

從圖2可以看出，pH=5.0時，48h后，菌株LJ5對鄰二甲苯的降解率為25.2%，該株菌在酸性條件下很難生長。當(dāng)pH=7.0～8.0時，30h后其降解率均可達(dá)到90%以上，隨著pH值的繼續(xù)增大其降解率又有所下降，表明菌株LJ5對環(huán)境pH值比較敏感，其適宜pH范圍為7.0～8.0，這與焦化廢水生化處理時的水質(zhì)條件相吻合。經(jīng)過約48h培養(yǎng)后測定各搖瓶中培養(yǎng)液的終態(tài)pH值，初始pH值為5.0～9.0的錐形瓶中的終態(tài)pH值分別變?yōu)?.14、4.03、5.11、6.18、6.64。結(jié)果顯示，搖瓶中的終態(tài)pH值均略有下降，這可能是因為菌株LJ5在生長過程中產(chǎn)生了酚類等顯酸性物質(zhì)。

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對菌株降解鄰二甲苯的影響

搖床轉(zhuǎn)速影響體系內(nèi)的溶解氧溶度和微生物與底物的充分接觸，因為本實驗用封口膜封住瓶口，因此主要影響因素應(yīng)該為后者。在溫度為35℃，培養(yǎng)基初始pH值為7.0的條件下，不同搖床轉(zhuǎn)速對鄰二甲苯降解率的影響如圖3所示。

圖2 培養(yǎng)基初始pH值對菌株LJ5降解性能的影響

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對菌株LJ5降解性能的影響

從圖3可以看出，搖床轉(zhuǎn)速為100r/min時菌株對鄰二甲苯的降解率較低，這可能是因為轉(zhuǎn)速過低導(dǎo)致菌株與底物不能充分接觸或者反應(yīng)時間較短。當(dāng)轉(zhuǎn)速在150～250r/min時，48h后鄰二甲苯的降解率都達(dá)到了90%以上，差別不明顯，結(jié)合實際生產(chǎn)中的可行性和成本考慮，選擇菌株LJ5的適宜搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。

2.2.4 菌株LJ5對不同濃度鄰二甲苯的降解特性

在溫度為35℃、培養(yǎng)基初始pH值為7、搖床轉(zhuǎn)速為150r/min的條件下，將菌株LJ5按接種量2%接入分別含50mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L鄰二甲苯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)30h，得到鄰二甲苯降解率結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，當(dāng)鄰二甲苯濃度低于200mg/L時，其降解速率隨著鄰二甲苯濃度的提高而增加；鄰二甲苯濃度200mg/L時，降解速率達(dá)到99%，在此之前細(xì)菌與底物表現(xiàn)為聯(lián)合控制階段；鄰二甲苯濃度高于500mg/L后，降解速率開始下降，但保持在90%以上；當(dāng)鄰二甲苯濃度增加至1500mg/L之后，其降解率明顯下降，底物的毒性對細(xì)菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但其降解率仍然高于70%。段云霞等[10]篩選出的菌株TD3在甲苯濃度高于50mg/L時其降解率開始下降，而LJ5對比其對高濃度苯系物具有更強(qiáng)的耐受性，在處理較高濃度廢水時具有明顯的優(yōu)勢。

圖4 鄰二甲苯濃度對菌株LJ5降解率的影響

2.2.5 菌株LJ5的降解動力學(xué)

采用Monod方程[式(2)]對菌株LJ5在鄰二甲苯濃度為1000mg/L時的降解動力學(xué)實驗數(shù)據(jù)（圖5）進(jìn)行擬合，并由雙倒數(shù)法作圖得出1/v與1/S的關(guān)系（圖6），通過回歸分析得出Monod方程的參數(shù)。

式中，v、vmax為底物的降解速率和最大底物的降解速率，mg/(L?h)；Ks半飽和常數(shù)，mg/L；S為底物濃度，mg/L。

圖5 菌株LJ5的降解曲線

圖6 1/v～1/S關(guān)系圖

由圖6得出菌株LJ5降解鄰二甲苯的動力學(xué)方程見式(3)。

得Km=64.32mg/L，當(dāng)S?64.32mg/L時，最大降解速率vmax=43.29mg/(L?h)?；舻と旱萚11]篩選的一株甲苯降解菌的最大降解速率僅為0.221mg/(L?h)，高效菌LJ5在降解鄰二甲苯時具有快速的降解速率，對比已查閱文獻(xiàn)中篩選到的苯系物降解菌具有更大的實際意義。

2.2.6 菌株LJ5的降解廣譜性分析

菌株LJ5在含不同底物的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長48h后的菌密度如表1所示，在含有苯、甲苯這類苯系物的無機(jī)鹽培養(yǎng)中LJ5生長良好，因為它們與鄰二甲苯有相似的分子結(jié)構(gòu)，LJ5能耐受這類化合物的毒性將其作為唯一碳源，合成自身生長所需的物質(zhì)；喹啉和吡啶均屬于氮雜環(huán)類化合物，但LJ5僅能在喹啉中生長，這可能是因為喹啉的分子結(jié)構(gòu)中含有一個苯環(huán)，更易于被LJ5利用；己二酸二辛酯和鄰苯二甲酸二丁酯這類增塑劑在生物處理時很難被微生物利用，而LJ5在其中具有一定的生長能力和去除效果；對于苯酚和鄰甲酚這些酚類物質(zhì)，LJ5則不具有降解能力。由表1可看出，LJ5在處理成分復(fù)雜的廢水體系中能同時去除多種有機(jī)物，這對降低廢水COD有巨大的潛力。

表1 廣譜性分析

為檢驗菌株LJ5在實際廢水中的降解能力，將菌液投加至稀釋的焦化廢水（COD = 610mg/L）中，48h后COD降為398.11mg/L，降解率達(dá)到34.74%，未加入菌液的對照組COD基本沒變。這說明LJ5能很好地適應(yīng)焦化廢水中種類繁多的有機(jī)物的毒性，并能將其中部分有機(jī)物降解，這與表1中LJ5的廣譜性相吻合，LJ5具有很大的實際應(yīng)用價值。

3 結(jié) 論

（1）以鄰二甲苯作為唯一碳源，從長期受焦化廢水污染的土壤中分離得到一株鄰二甲苯高效降解菌LJ5，結(jié)合菌株菌落形態(tài)、生理生化特征實驗和16S rDNA測序分析，菌株LJ5為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）細(xì)菌。

（2）通過單因素實驗得到菌株LJ5的適宜降解條件為：培養(yǎng)溫度35℃，pH=7.0～8.0，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。菌株LJ5在鄰二甲苯濃度高達(dá)2500mg/L時，對其的去除率在30h內(nèi)可達(dá)到70%，它對鄰二甲苯的降解符合Monod動力學(xué)方程，當(dāng)鄰二甲苯濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于64.32mg/L時，LJ5降解底物的速率最高，達(dá)到43.29mg/(L?h)。

（3）菌株LJ5能在多種有機(jī)物中生長，將菌液投加至焦化廢水48h后可使廢水COD從610mg/L降為398.11mg/L，降解率達(dá)到34.74%。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 朱強(qiáng)，王祖文，劉建如. 焦化廢水處理技術(shù)現(xiàn)狀與研究進(jìn)展[J]. 有色金屬科學(xué)與工程，2011，2（5）：93-94.

[2] INOUE A，HORIKOSHI K．A Pseudomonas thrives in high concentration of toluene[J]. Nature，1989，338：264-266.

[3] 任源，韋朝海，吳超費(fèi)，等. 焦化廢水水質(zhì)組成及其環(huán)境學(xué)與生物學(xué)特性分析[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，27（7）：1094-1100.

[4] 靳茂霞，劉桂林．提高焦化廢水生化處理的方法[J]. 上海環(huán)境科學(xué)，1997，16（2）：13-14，18．

[5] 段傳人，胡江，宋永安. 1株甲苯降解真菌的篩選鑒定及其降解甲苯的特性[J]. 微生物學(xué)雜志，2011，31（3）：41-47.

[6] 章劍麗，仵彥卿，張小凡. 苯系化合物降解的微生物篩選及其特性初探[J]. 凈水技術(shù)，2010，29（3）：29-33.

[7] 王琳，邵宗澤. 4 株苯系物降解菌菌株的篩選鑒定、降解特性及其降解基因研究[J]. 微生物學(xué)報，2006，46（5）：753-757.

[8] 袁麗紅. 微生物學(xué)實驗[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[9] 馮廣達(dá)，陳美標(biāo)，羊宋貞，等. 用于PCR擴(kuò)增的細(xì)菌DNA提取方法比較[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，34（3）：339-442.

[10] 段云霞，唐運(yùn)平，呂晶華，等. 甲苯降解菌的降解特性及生物強(qiáng)化作用的研究[J]. 環(huán)境污染與防治，2011，33（37）：50-53.

[11] 霍丹群，孫興福，饒佳家，等. 甲苯降解菌的分離、鑒定及其對甲苯的降解特性[J]. 化工環(huán)保，2005，25（5）：337-340.

研究開發(fā)

Separation and biodegradation characteristics of a o-xylene degrading strain

CHEN Pei1，YAN Jiabao1，2，WU Wenli1，HU Xixi1
（1Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081，Hubei，China；2Officer of Academic Affairs of Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081，Hubei，China）

Abstract：With o-xylene as the sole carbon source，a strain (LJ5) was separated from the soil which was contaminated in the long-term by coking waste water. This strain was identified as Pseudomonas sp. based on its morphology，and 16S rDNA gene sequence. The optimum initial temperature，pH，and shaking speed for B1 utilizing pyridine are 35℃，pH=7.0—8.0 and 150 r/min，respectively. The o-xylene degradation rate was 73% when LJ15 was cultured under o-xylene concentration of 2500mg/L，and the degradation kinetics of o-xylene could be described by the Monod model. When o-xylene concentration was ?64.32mg/L，the degradation rate of strain LJ5 reached an maximum of 43.29mg/(L?h). Strain LJ5 could grow well in the coking waste water which allowed the degradation rate of COD to be 34.74%.

Key words：o-xylene; separation; degradation; kinetics

基金項目：湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目（2011CDA054）、武漢科技大學(xué)研究生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金重點(diǎn)項目（JCX0006）及武漢科技大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201310488009）。

收稿日期：2015-06-30；修改稿日期：2015-07-13。

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.02.035

中圖分類號：X 784

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）02–0565–05