劉小東，王 偉，黃 勇，張湘莉蘭，孫 強，安小平，米志強，童貽剛

◇基礎醫(yī)學研究◇

一株弗氏檸檬酸桿菌噬菌體IME-CF2的分離、測序及全基因組分析

劉小東1，2，王 偉2，黃 勇2，張湘莉蘭2，孫 強2，安小平2，米志強2，童貽剛1，2

目的從醫(yī)院污水中分離一株能裂解弗氏檸檬酸桿菌的噬菌體，觀察其形態(tài)，并進行全基因組測序和全基因組分析，為治療和控制弗氏檸檬酸桿菌感染提供基礎。方法以弗氏檸檬酸桿菌為宿主，從醫(yī)院污水分離噬菌體，用透射電鏡觀察其形態(tài)；使用Ion Torrent測序平臺進行噬菌體全基因組測序，測序后進行噬菌體全基因組序列組裝、注釋、進化分析和比較分析。結果成功分離一株弗氏檸檬酸桿菌噬菌體，命名為IME-CF2；電鏡觀察顯示，該噬菌體具有二十面體的頭部，形態(tài)類似肌尾噬菌體科；IME-CF2核酸類型為DNA，基因組全長為177 685 bp，GC含量為43.2%；編碼267個編碼區(qū)（CDS），2個tRNA；進化分析表明，IME-CF2屬于T4類噬菌體，全基因組比較分析表明，IME-CF2與檸檬酸桿菌噬菌體Miller同源性最高。結論分離鑒定了一株弗氏檸檬酸桿菌噬菌體，進行了全基因組測序和分析，為噬菌體治療多重耐藥細菌奠定了基礎。

弗氏檸檬酸桿菌；噬菌體；全基因組測序；基因組分析

弗氏檸檬酸桿菌屬腸桿菌科枸櫞酸桿菌屬，是發(fā)酵型革蘭陰性菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，是人體腸道正常菌群，也是條件致病菌。近年來，隨著抗生素的濫用，弗氏檸檬酸桿菌對常見的抗生素產(chǎn)生耐藥［1］，給臨床感染治療帶來極大挑戰(zhàn)。噬菌體是一種能特異性感染細菌的病毒，廣泛存在于自然環(huán)境中，毒性噬菌體能引起宿主菌裂解死亡［2］。噬菌體是一種潛在的抗生素替代品，能有效治療細菌性感染，同時減輕細菌耐藥的發(fā)生。目前，噬菌體與抗生素聯(lián)合用藥及多種噬菌體雞尾酒療法對細菌性感染的治療效果較好［3-4］。該研究從醫(yī)院污水中分離一株毒性弗氏檸檬酸桿菌噬菌體IME-CF2，并對其進行了全基因組測序、基因組分析及進化分析?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1材料弗氏檸檬酸桿菌分離于中國人民解放軍307醫(yī)院檢驗科，經(jīng)過生化性質(zhì)鑒定和16S rDNA測序鑒定，保藏于本實驗室。

1.2方法

1.2.1 IME-CF2的分離與鑒定 取未經(jīng)處理的解放軍307醫(yī)院污水，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，并通過0.45μm的濾膜。取上述過濾液0.100 ml，加入到5 ml對數(shù)期指示菌弗氏檸檬酸桿菌中，于37℃震蕩過夜培養(yǎng)。第2天，取培養(yǎng)液12 000 r/min離心10 min，收集上清液，并通過0.45μm的濾器，所得過濾液即為噬菌體原液。使用噬菌體原液點滴法檢測是否分離到敏感性噬菌體。在鋪有指示菌的雙層平板2區(qū)域滴加0.001 5 ml的噬菌體原液，1區(qū)域滴加0.001 5 ml的PBS（磷酸鹽緩沖液）作為陰性對照組；觀察有無噬菌斑。

將上述敏感性噬菌體原液梯度系列稀釋后與對數(shù)期指示菌混勻鋪板做空斑形成實驗。37℃溫箱孵育6 h，挑取單個噬菌斑接種到對數(shù)期的指示菌中；37℃震蕩培養(yǎng)6 h后，再次鋪雙層瓊脂板觀察噬菌斑，重復3次挑取單個空斑過程，分離到純種噬菌體。

1.2.2 IME-CF2電鏡觀察 噬菌體樣品使用磷鎢酸染色2 min，室溫干燥后在Philips TECNAI-10型透射電子顯微鏡（TEM）下觀察噬菌體的形態(tài)。

1.2.3 IME-CF2基因組DNA提取 參照Lu et al［5］的方法（略有改動），抽提核酸。取0.600 m l的噬菌體液（滴度約4.3×1012PFU/L），加入胰DNaseⅠ和RNase A至終濃度1 mg/L，37℃過夜處理，隨后80℃滅活15 min，以使上述酶失活。然后加入0.5 mol/L EDTA（終濃度0.02 mol/L），20 g/L蛋白酶K（終濃度50 mg/L），10%SDS（終濃度0.5%），56℃水浴1 h。加入等體積酚抽提核酸，10 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層水相到一新的1.5 ml離心管中。向上述離心管中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1），溫和混勻后10 000 r/min離心5 min，以去除蛋白、糖類等物質(zhì)污染。取上述離心管中水相到一個新的離心管中，并加入等體積異戊醇，-20℃下靜止3 h后12 000 r/min離心25 min，收集沉淀。用75%的冰乙醇洗滌上述DNA沉淀，室溫干燥后用去離子水重懸浮上述DNA沉淀。

1.2.4 IME-CF2高通量測序文庫的構建與上機取0.100 mg的高質(zhì)量噬菌體基因組DNA加水稀釋到0.050 mg，超聲打斷約20 min，末端補平，兩端鏈接接頭。加入1.8倍體積的AMPure XP Beads純化DNA，使用E-Gel膠選擇長約380 bp的DNA片段。PCR擴增上述DNA片段，加入1倍體積的AMPure XP Beads純化PCR擴增產(chǎn)物。隨后取上述工作庫進行油包水PCR反應，堿法制備單鏈DNA測序模板。最后將帶有模板的微磁珠離心到318C芯片的微孔中，上機測序。

1.2.5 IME-CF2全基因組序列分析 IME-CF2全基因組序列組裝使用Newbler v2.9（454 Life Sciences Corporation）軟件。全基因組使用RAST（Rapid Annotation using Subsystem Technology）［6］和BASys（Bacterial Annotation System）在線注釋。序列相似性比對分析使用BLAST在線工具及mauve v.2.3.1，使用MEGA5.0建立進化樹。使用DNAPlot1.11繪制基因組圈圖。

2 結果

2.1IME-CF2的形態(tài)弗氏檸檬酸桿菌888分離于解放軍307醫(yī)院患者血液，抗生素耐藥性見表1。以上述弗氏檸檬酸桿菌888作指示菌，成功從污水中分離到一株毒性弗氏檸檬酸桿菌噬菌體，命名為IME-CF2。IME-CF2能在鋪有指示菌的雙層平板上2區(qū)形成透亮的圓形噬菌環(huán)，而點有PBS的對照區(qū)1區(qū)無明顯變化，見圖1A。IME-CF2能形成直徑約1 mm清晰透亮的噬菌斑，見圖1B。電鏡照片表明該噬菌體具有典型的二十面體結構和以收縮的尾部，頭部直徑約0.080μm，尾部長約0.120μm，歸屬于肌尾噬菌體科，見圖2。根據(jù)國際委員會關于噬菌體命名的方法，該噬菌體可命名為vB_CFRMIME-CF2。

2.2IME-CF2全基因組測序和組裝約0.600 ml的噬菌體液（滴度約4.3×1012PFU/L）用于基因組DNA提取，成功提取濃度為178 g/L的高質(zhì)量噬菌體核酸。約0.100 mg的噬菌體基因組DNA用于構建測序文庫，測序約產(chǎn)生694 679條平均長度287 bp的高質(zhì)量測序片段（Reads），約200 543 826個堿基，測序深度高達1 129倍（200 543 826÷177 689≈1 129）。約有17 280條平均長度約266 bp的Reads用于基因組序列組裝，參與組裝堿基約4 606 735個，平均覆蓋倍數(shù)為26（4 606 735÷177 689≈26）倍。噬菌體IME-CF2基因組組裝結果產(chǎn)生長約177 kbp的單一contig（重疊群），隨后成功環(huán)化此重疊群，即測序數(shù)據(jù)分析可知該噬菌體基因組是環(huán)狀的。環(huán)化后完整基因組長度為177 685 bp。

2.3IME-CF2高通量測序（HTS）高頻序列分析

噬菌體末端序列通常在其基因組復制、包裝等方面有重要作用。序列分析發(fā)現(xiàn)，噬菌體高通量測序中高頻出現(xiàn)的測序序列就是該噬菌體末端序列［7］。根據(jù)文獻［8］建立的病毒基因組末端結構分析方法，通過把所有原始高通量測序的Reads映射到（mapping）到組裝好基因組上，統(tǒng)計分析所有Reads的出現(xiàn)次數(shù)，并根據(jù)出現(xiàn)次數(shù)從高到底排序。大部分高通量測序Reads重復次數(shù)小于10，沒有特別高頻的測序Reads出現(xiàn)，見圖3（X軸表示Reads重復次數(shù)取值范圍。例如，X=10表示Reads重復次數(shù)在0到10之間的所有測序Reads總數(shù)，X=15表示Reads重復次數(shù)在10到15之間的所有測序Reads總數(shù)。Y軸表示Reads條數(shù)的統(tǒng)計）。高通量測序Reads的排序，見圖4，只列出前20條。從該圖可以看出最高頻的序列大概出現(xiàn)20多次，沒有特別高頻的序列出現(xiàn)，符合上述統(tǒng)計。所以，IME-CF2沒有固定的基因組末端序列，復制時開環(huán)及末端切割是隨機的。

2.4IME-CF2基因組分析IME-CF2全基因組長度為177 685 bp，基因組A、C、G、T堿基含量分別為28.3%、21.8%、21.4%和28.5%，GC含量為43.2%，共有269個開放閱讀框（ORFs），包括267個CDS和2個tRNA。269個ORF中大部分ORF的起始密碼是ATG，約占91%。CDS核酸序列長度在117～3 360 bp，對應的蛋白質(zhì)序列長度在38～1 219 aa。全部的ORF共含166 089 bp的堿基，基因組基因密度高達94%。圖5為IME-CF2全基因組圈圖：共6圈，由外到內(nèi)依次為線性基因組長度代表、位于正鏈CDS、位于負鏈CDS、gene和tRNA、GC含量和GC偏移。由圖可以看出編碼區(qū)在該噬菌體正負鏈上長度大約相等，基因成簇分布，相似功能的基因鄰近，符合T4類噬菌體基因組特征。BLASTN比對表明IME-CF2與檸檬酸桿菌噬菌體Miller（178 Kbp）的同源性最高，其次是腸道菌噬菌體RB43（179 Kbp），比對覆蓋率分別為97%和92%。Miller分離于美國、RB43分離于法國，核酸序列GenBank登錄號分別為KM236237和HE858210。表2為三株噬菌體堿基組成比較。圖6為MAUVE v.2.3.1所作三株噬菌體之間的同源分析圖，可見基因組高度同源，沒有發(fā)現(xiàn)大的插入、缺失等突變，基因組間同源性較高。

2.5IME-CF2功能性ORF分析使用BLASTP分析，將具有推定基因功能的ORF分成4類：結構與包裝模塊（紅色）；生物合成與代謝模塊（藍色）；裂解相關基因（黃色）；假想蛋白（灰色），見圖5。

使用BLASTP對蛋白序列分析表明，ORF262（噬菌體末端酶大亞基）和ORF264（噬菌體末端酶小亞基）在噬菌體包裝時起重要作用。ORF259（噬菌體口蛋白）編碼的蛋白質(zhì)能使細菌細胞膜形成空洞，這有利于噬菌體基因組核酸注入到受體細菌，同時該蛋白還具有鏈接噬菌體頭部與尾部的功能。通常上述三個ORF在基因組上臨近。結構蛋白ORF254（主要衣殼蛋白）1 575 bp是噬菌體主要衣殼蛋白，與包裝蛋白鄰近。ORF201～ORF207編碼噬菌體尾部相關蛋白，ORF93～ORF100主要負責噬菌體尾部基底板，這兩個基因簇在噬菌體感染、吸附宿主菌時發(fā)揮重要作用。

噬菌體DNA復制及調(diào)控相關基因主要包括：ORF159（DNA聚合酶），ORF162（DNA引物酶），ORF187（DNA拓撲異構酶），ORF251（單鏈DNA結合蛋白），ORF248（DNA解旋酶）和ORF184（轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）等。ORF160（噬菌體重組蛋白）與噬菌體基因組DNA整合到宿主基因組有關。

ORF50（噬菌體裂解酶）和ORF200（溶菌蛋白）是噬菌體裂解相關基因。ORF200編碼穿孔蛋白，使細菌細胞膜穿孔。該噬菌體可能是通過同時表達上述兩種蛋白來介導宿主細胞裂解的。

2.6IME-CF2進化分析為了分析IME-CF2與其他噬菌體之間的關系，采用噬菌體IME-CF2主要衣殼蛋白（ORF254）序列構建了進化樹。ClustalW multiple alignments軟件比對主要衣殼蛋白氨基酸序列，使用Neighbor-Joining建樹。括號為用于比對的各噬菌體蛋白質(zhì)序列登錄號。（圖7）。IME-CF2與檸檬酸桿菌噬菌體Miller及腸道菌噬菌體RB43處于同一分支，即IME-CF2與Miller及RB43親緣關系最近，屬T4類噬菌體，與全基因組比較分析相吻合。

3 討論

噬菌體是細菌病毒，是自然界中最具多樣性的生物之一。相對于抗生素治療，噬菌體療法具有其突出優(yōu)勢，噬菌體是自然界存在的生物，生產(chǎn)成本低，對細菌有高度特異性，不破壞有益菌群，一旦目標細菌被清除噬菌體也自動消失［9］。面對日益嚴峻的細菌耐藥問題，噬菌體療法重新獲得人們的關注，展現(xiàn)出廣闊的前景。為了解決抗生素耐藥問題，美國在20世紀90年代興起一些噬菌體研究公司［10］。由于噬菌體具有嚴格的宿主特異性，以及細菌在與噬菌體相互進化過程中會對噬菌體產(chǎn)生耐受，單一噬菌體制劑將不能滿足治療要求。噬菌體混合制劑雞尾酒療法及個性化噬菌體治療方法可能是未來噬菌體治療的研究方向之一。此外，有些噬菌體攜帶耐藥基因甚至毒力基因，使得它們不可直接用于治療［11］。因此，對噬菌體進行分離、鑒定、全基因組測序及基因組學分析顯得十分重要，不僅能夠獲得該噬菌體全面清晰的遺傳信息及進化信息而且能為噬菌體治療奠定理論基礎。

綜上所述，本實驗利用分離于307醫(yī)院檢驗科的耐藥弗氏檸檬酸桿菌作指示菌，成功從醫(yī)院污水中分離一株毒性噬菌體，命名為IME-CF2。該噬菌體可在鋪有指示菌的雙層平板上形成清晰透亮的噬菌斑，預示著IME-CF2是一株毒性弗氏檸檬酸桿菌噬菌體，在預防和治療弗氏檸檬酸桿菌感染方面具有潛在應用價值。電鏡下IME-CF2具有典型的二十面體結構及可收縮的尾部，具有典型的肌尾噬菌體科噬菌體形態(tài)。基因組學分析表明，IME-CF2與Miller及RB43相似，功能相關基因成簇分布，具有典型的T4類噬菌體基因結構，同時進化分析表明三者聚類到同一分支。綜合以上分析，可以確定噬菌體IME-CF2屬雙鏈DNA噬菌體下有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科的T4類噬菌體。噬菌體IME-CF2生物學活性實驗與動物實驗值得深入研究。

（噬菌體IME-CF2全基因組核酸序列GenBank登錄號：KR869820）

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Isolation，sequencing and comp lete genome sequence analysis of bacteriophage IME-CF2 infecting Citrobacter freundii

Liu Xiaodong1，2，WangWei2，Huang Yong2，et al
（1AnhuiMedical University，Hefei 230032；2State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity，Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology，Beijing 100071）

ObjectiveTo isolate a lytic bacteriophage against Citrobacter freundii from hospital sewage，study its morphology and analyze its genome so as to provide basis for treatment and infection control of antibiotics-resistant Citrobacter freundii.MethodsA bacteriophagewas isolated from hospital sewage using Citrobacter freundii as host cell.Phagemorphology was observed using a transmission electronmicroscope and its genomewas sequenced using Ion Torrent sequencing platform.Genome annotation，comparative and evolutionary analysis were performed after the complete genome sequence was assembled.ResultsA lytic bacteriophage designed as IME-CF2 was successfully isolated against Citrobacter freundii.Transmission electronmicroscopy analysis indicated that the isolated bacteriophage IME-CF2 had an icosahedral head and displayedmorphology resembling Myoviridae family.The complete genome of IME-CF2 was 177 685 bp circular dsDNA and had a G+C content of 43.2%.The genome encodes 2 putative tRNA and 267 coding sequences（CDSs）.Phylogenetic analysis demonstrated that IME-CF2 belonged to T4-like virus and comparative analysis showed that IME-CF2 has the highest homology with previously reported Citrobacter phage Miller.ConclusionIsolation and characterization of a lytic Citrobacter phage，lay a foundation of the treatment ofmultiple drug resistant bacteria in the future.

Citrobacter freundii；bacteriophage；whole genome sequencing；genomic analysis

Q 939.48

A

1000-1492（2016）03-0315-05

時間：2016/1/28 14：23：09 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.002.html

2016-01-08接收

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（編號：2012AA022003、2014AA021402）；國家科技重大專項課題（編號：2013ZX10004605、2013ZX10004217-002-003）

1安徽醫(yī)科大學軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所，合肥 230032

2軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

劉小東，男，碩士研究生；

童貽剛，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：tong62035@gmail.com