于 蕊，劉紅霞，孫世杰，王惠國，李文哲

B細胞受體核心巖藻糖基化調節(jié)成熟B細胞的信號轉導

于 蕊1，劉紅霞2，孫世杰2，王惠國1，李文哲2

目的探討核心巖藻糖基轉移酶（Fut8）對成熟B細胞信號轉導的影響。方法利用Fut8-siRNA逆轉錄病毒載體建立Fut8基因沉默成熟B細胞株（3-83-KD細胞），并將PLHCX-Fut8質粒導入3-83-KD細胞建立Fut8基因恢復成熟B細胞株（3-83-KD-Re）。用Real time-PCR、Western blot和HPLC法檢測Fut8 mRNA、蛋白表達和Fut8酶活性，流式細胞儀和凝集素免疫印跡檢測BCR的表達量和核心巖藻糖基化水平，Western blot技術檢測細胞內(nèi)酪氨酸磷酸化水平。結果與3-83細胞相比，3-83-KD細胞的BCR核心巖藻糖基化水平明顯下降，而3-83-KD-Re細胞其表達得到恢復。Fut8基因沉默使3-83-KD細胞BCR介導的信號傳導明顯減弱，而3-83-KD-Re細胞的信號傳導恢復正常。結論Fut8修飾的核心巖藻糖基化在BCR介導的細胞信號轉導過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。

核心巖藻糖基轉移酶；siRNA；B細胞受體；信號轉導

成熟B細胞的抗原識別及B細胞受體（B cell receptor，BCR）介導的細胞信號轉導是體液免疫應答調節(jié)的重要組成部分［1］。質譜分析表明IgG-BCR分子是富含有核心巖藻糖基的糖蛋白［2］，核心巖藻糖基修飾對IgG-BCR的生物活性具有重要的調節(jié)作用。但目前核心巖藻糖基化對IgG-BCR介導的信號傳導尚不清楚。核心巖藻糖基轉移酶（α-1，6-fucosyltransferase，F(xiàn)ut8）是催化核心巖藻糖修飾的唯一的糖基轉移酶，是以GDP-巖藻糖為活化的糖基供體，以α-1，6糖苷鍵的形式把巖藻糖移交到N-糖鏈還原末端的乙酰葡糖胺，形成核心巖藻糖基［3］。研究［4-6］顯示Fut8在B細胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。該實驗以成熟B細胞株即3-83細胞，該細胞為BCR轉基因模型，在p31刺激下，表達IgG2a-BCR［7］）為研究對象，通過RT-PCR、實時定量PCR、Western blot、流式細胞術等，研究Fut8對成熟B細胞活化過程的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料逆轉錄病毒載體PSINsi-hU6、PLHCXFut8-mutant cDNA質粒為本實驗室保存；3-83細胞株購自美國ATCC公司；逆轉錄酶、dNTP mixture、RNase抑制劑、DNA連接試劑盒、Ex Taq酶、質粒提取試劑盒購于大連TaKaRa公司實驗室常規(guī)試劑購于上海生工公司；G418購自美國AMRESCO公司；Anti-mouse IgG2a等一抗購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG購自江蘇碧云天公司；生物素標記-AOL購自日本TCI；抗GAPDH（FL-355）抗體購自美國Santa Cruz（sc-25778）；生物素標記p31由北京中科亞光公司合成；膜蛋白提取試劑盒（BSP049）購自上海生工生物公司。

1.2 細胞模型的制備篩選出最佳的Fut8 siRNA序列，siRNA-sense：5′-GATCCTCTCAGAATTGGCGCTATGT-TCAAGAGACATAGCGCCAATTCTGAGACTTTTTTAT-3′；siRNA-antisense：5′-CGATAAAAAAGGTATCGCGGTTAA-GACTCTTCTCTTGAAAGAGTCTTAACCGCGATACCG-3′，該序列位于小鼠Fut8基因（NM_016893）的1386～1404位。Fut8基因沉默細胞（3-83-KD）模建立：準備階段：5×105個3-83細胞置于6孔板內(nèi)，37℃培養(yǎng)。感染階段：利用聚凝胺處理細胞后，加入含F(xiàn)ut8-siRNA的逆轉錄病毒液，37℃，CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，再追加1ml培養(yǎng)液到6孔板中過夜培養(yǎng)。G418篩選階段：加入G418（400μg/ml）的培養(yǎng)液，每2 d更換一次G418的培養(yǎng)液，兩周后挑選單個克隆置于96孔板中培養(yǎng)擴大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定遺傳的沉默細胞模型命名為3-83-KD。Fut8恢復細胞（3-83-KD-Re）模型建立：準備階段：5×1053-83-KD細胞置于6孔板內(nèi)，37℃培養(yǎng)。轉染階段：將梭華-Sofast和Fut8-pLHCX質粒按一定比例混合，并轉染至3-83-KD細胞，37℃孵育6 h，然后再加入1ml含20%血清的DEME培養(yǎng)液，37℃，CO2培養(yǎng)箱中孵育24～48 h。篩選階段：加入潮霉素（200μg/ml）于培養(yǎng)液中，每隔3 d換一次含潮霉素的培養(yǎng)液，2周后挑取單個克隆細胞進行擴大培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定遺傳的具有潮霉素抗性的Fut8基因恢復細胞株，命名為3-83-KD-Re。

1.3 實時定量PCR按TRIzol RNA提取試劑盒的操作說明提取細胞總RNA。以Oligo（dT）為起始引物，按照反轉錄說明書操作進行反轉錄合成cDNA。PCR程序：變性：94℃3 min，退火：93℃10 s，60℃20 s，72℃1 min 35個循環(huán)，延伸：72℃10 min。引物序列為：5-AACAGCTTGTTAAGGCCAA AG-3 and 5-GCATGTCTTTGGAGTTCATTTC-3（Fut8）（NM_016893）；5-GCAAGAGCTACAGCATGAGAG-3 and 5-TGCCGCCAGCGAAGAGACGCT-3（Fut4）（NM_ 010242）；5-TCAAGCCATCAACATCAAC-3 and 5-GTGGCGGATGTACTCGAAGG-3（GnT III）（NM_010795）；5-CAGCGCCAGCAACTCGACTA-3 and 5-TCGATTGAA CATGGTGTCTCCAG-3（β4GalT-Ⅰ）（NM_022305）；5-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3 and 5-TGAAGGGGT CGTTGATGG-3（GAPDH）（NM_001001303）。

1.4 高效液相色譜（HPLC）檢測酶活性底物為PABA［4-（2-pyridylamino）butylamine］標記的GnGnbi-Asn-PABA（S）。通過HPLC對其產(chǎn)物（GnGnFucbi-Asn-PABA）（P）進行分析，F(xiàn)ut8酶活性［pmol/（h ·mg）］按照公式［P（pmol）/反應時間（h）蛋白含量（mg）］來計算。

1.5 流式細胞術分析細胞表面BCR的表達首先利用BSA-抗-CD16/CD32（2.4G2）抗體混合液對細胞表面的Fc受體進行封閉，然后加入熒光標記抗體在冰上反應15 min。利用流式細胞儀（FACSCalibur）進行分析。

1.6 免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）純化膜蛋白根據(jù)膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白，測定蛋白濃度后取蛋白（約500μg）與抗-IgG2a以及G-Sepharose充分混勻4℃搖晃過夜，之后用PBS洗兩次，加無變性劑loading buffer 100℃煮5 min待用。

1.7 Westernblot和lectinblot法分析細胞內(nèi)蛋白的表達按標準方法進行SDS-PAGE，將蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%BSA封閉2 h后，加入合適的一抗或生物素標記-AOL（米曲霉素，特異性識別核心巖藻糖基），搖床過夜，洗膜后加入二抗，孵育1 h，洗膜后ECL顯色并掃描。

2 結果

2.1 3-83-KD細胞及3-83-KD-Re細胞特性利用含F(xiàn)ut8-siRNA的重組逆轉錄病毒及Fut8-pLHCX質粒，建立3-83-KD細胞及3-83-KD-Re細胞。RTPCR結果顯示，與正常3-83細胞相比，3-83-KD細胞中Fut8 mRNA的表達量明顯減少（圖1A），而在3-83-KD-Re細胞中其表達得到恢復。實時定量PCR結果也顯示，38-3-KD細胞的Fut8 mRNA表達量小于3-83細胞的5%（圖1B），但Fut4，GnTⅢ和β4GalT-I等其它糖基轉移酶的表達量并沒有明顯的變化（圖1B）。Western blot實驗結果進一步顯示，與正常3-83細胞相比，F(xiàn)ut8蛋白含量明顯減少（圖1C），而在3-83-KD-Re細胞中得到恢復。此外，通過HPLC技術檢測了Fut8的酶活性，結果顯示3-83細胞和3-83-KD-Re細胞在20 min處出現(xiàn)特異性Fut8酶產(chǎn)物，而3-83-KD細胞在20 min處并沒有出現(xiàn)特異性Fut8酶產(chǎn)物（圖1D）。

2.2 細胞表面的IgG-BCR是核心巖藻糖基化糖蛋白BCR介導的信號是B細胞活化、增殖和分化的關鍵。流式細胞術檢測結果顯示，3-83、3-83-KD、3-83-KD-Re細胞之間IgG2a-BCR的表達量沒有明顯的差別（圖2A）。但是Lectin blot結果表明3-83-KD細胞中IgG2a-BCR的核心巖藻糖基化修飾缺失，在3-83-KD-Re細胞中又得到恢復（圖2B）。

2.3 核心巖藻糖基化修飾影響B(tài)CR介導的下游信號分子磷酸化BCR復合物是由識別抗原的膜表面免疫球蛋白（the membrane surface immunoglobulin，m Ig）與傳遞抗原刺激信號的CD79a/CD79b（cluster of differentiation，CD）異源二聚體所組成。BCR與特異性抗原表位結合后，由CD79a和CD79b把此激活信號轉入細胞內(nèi)，并通過Fyn、Lyn、Syk、Vav、PLCγ2及鈣離子流出，激活B細胞［8］。3-83細胞表面的BCR特異性識別p31抗原肽（HDWRSGFGGFQHLCC）。為了更進一步確認核心巖藻糖基修飾對BCR介導的細胞信號傳導的影響，用p31作用不同種類的3-83細胞，檢測細胞內(nèi)信號分子的酪氨酸磷酸化情況。用p31（0.1μg/ml）處理后，與正常的3-83細胞相比，3-83-KD細胞在5 min和15 min時酪氨酸磷酸化水平明顯的下降，但在3-83-KD-Re細胞中磷酸化水平又得到恢復（圖3a）。進一步的研究結果顯示，3-83-KD細胞中BCR下游信號分子，如CD79a和Syk分子的磷酸化水平明顯下降，而在3-83-KD-Re細胞中又得到恢復（圖3b）。

3 討論

BCR介導的信號是B細胞活化的第一信號，是B細胞成熟和活化的關鍵步驟。最新研究［9］表明，糖基化對BCR功能具有重要的影響，如糖基化在維系BCR水溶性和立體構象中起重要作用，糖基化程度低下，會使BCR肽鏈缺乏剛性；糖基化過度，會遮住BCR的Ag結合位點，影響與Ag的結合。

Fut8是修飾核心巖藻糖基化的唯一的糖基轉移酶。基因敲除小鼠實驗［5-6］表明Fut8在B細胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。闡明某個基因的功能，目前常用的方法是利用siRNA，抑制該基因表達，觀察其相應功能的丟失；然后細胞內(nèi)重新導入該基因，建立轉基因恢復模型，觀察其丟失功能的恢復。與正常3-83細胞相比，3-83-KD細胞中Fut8 mRNA明顯減少，而Fut4、GnT-Ⅲ及β4-GalT-ⅠmRNA的表達量沒有變化，說明復制缺陷型Fut8-siRNA重組逆轉錄病毒（pSINsi-hU6）沒有脫靶現(xiàn)象。將PLHCX-Fut8質粒導入3-83-KD細胞建立Fut8基因恢復成熟B細胞株（3-83-KD-Re），發(fā)現(xiàn)在3-83-KD-Re細胞中Fut8 mRNA、蛋白表達和Fut8酶活性表達得到恢復。IgG-BCR是富含核心巖藻糖基化糖蛋白，也是Fut8的重要的靶蛋白。Fut8基因沉默并沒有影響IgG2a-BCR的表達量，只是影響了IgG2a-BCR核心巖藻糖基化水平。進一步研究表明，核心巖藻糖修飾能夠調節(jié)IgG-BCR與抗原肽（p31）之間的相互作用。Fut8基因沉默使IgG-BCR介導的信號傳導（p31刺激細胞）明顯減弱，而3-83-KD-Re細胞的信號傳導得到恢復。本實驗結果提示核心巖藻糖基化修飾在BCR介導的細胞信號轉導過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，為從糖基化角度揭示B細胞活化規(guī)律提供新的科學思路。

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Core fucosylation of B cell receptor regulates the signal transduction ofmature B cells

Yu Rui1，Liu Hongxia2，Sun Shijie2，et al
（1College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622；2College of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian 116044）

ObjectiveTo investigate the role of core fucosyltransferase（Fut8）on the signal transduction via B cell receptor in mature B cells.MethodsFirstly，F(xiàn)ut8 gene knockdown mature B cells（3-83-KD cells）were established by using retroviruses containing Fut8-siRNA，and Fut8 gene restored mature B cells（3-83-KD-Re）were generated by transfections of PLHCX-Fut8 plasmid into 3-83-KD cells.The expressions of Fut8mRNA，protein and enzyme activity were detected by real time PCR，Western blot and HPLC，and the expressions of BCR and core fucosylation levelwere detected by flow cytometry and lectin blot，and intracellular tyrosine phosphorylation levelwas detected by Western blot.ResultsThere were no differences on the expression of IgG2a-BCR in 3-83，3-83-KD，3-83-KD-Re cells，while core fucosylation of IgG2a-BCR was abolished in 3-83-KD cells，and rescued by reintroduction of Fut8，as evidenced by AOL blot.Compared to 3-83 cells，the tyrosine phosphorylation was substantially reduced in 3-83-KD cellswith p31 stimulation，and then completely restored by re-introduction of the Fut8 gene to 3-83-KD cells.ConclusionIn summary，core fucosylationmodified by Fut8 plays an important role in the cellular signal transduction via BCR.

Fut8；siRNA；BCR；signal transduction

R 392.11

A

1000-1492（2016）03-0320-04

時間：2016/1/28 14：23：09 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.004.html

2015-12-08接收

國家自然科學基金項目（編號：31270864、30972675）

1大連大學生命科學與技術學院生物學專業(yè)，大連116622

2大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，大連 116044

于 蕊，女，碩士研究生；

李文哲，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：liwenzhe46@hotmail.com

王惠國，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：wanghuiguo126@126.com