馬　延，王　媛，羅智敏，?！〈?，傅　強(qiáng)*(.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安　7006；. 西安新通藥物研究有限公司，西安　70077)

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HPLC法測(cè)定埃索美拉唑鈉的有關(guān)物質(zhì)

馬延1，2，王媛2，羅智敏1，常春1，傅強(qiáng)1*(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安710061；2. 西安新通藥物研究有限公司，西安710077)

摘要：目的建立HPLC法測(cè)定埃索美拉唑鈉的有關(guān)物質(zhì)。方法采用Capcell Pak C18色譜柱，流動(dòng)相采用0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=7.6±0.2)4-乙腈梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。結(jié)果在選定的色譜條件下，主成分與各已知雜質(zhì)分離度良好。H431/41、H118/87、H168/66、埃索美拉唑鈉、H193/61和奧美拉唑硫醚進(jìn)樣量分別在0.8～66.3 ng(r=0.999 9)、2.0～59.1 ng(r=0.999 5)、1.0～75.6 ng(r=0.999 9)、0.5～149.7 ng(r=0.999 9)、1.0～74.7 ng(r=1.000 0)和1.4～94.8 ng(r=0.999 5)范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系。RSD均在0.54%～0.82%范圍內(nèi)，精密度良好。供試品溶液在室溫下不穩(wěn)定，應(yīng)臨用新配。結(jié)論該法可用于檢測(cè)埃索美拉唑鈉的產(chǎn)品質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：埃索美拉唑鈉；有關(guān)物質(zhì)；反相高效液相色譜法

埃索美拉唑鈉是奧美拉唑的S-異構(gòu)體，目前已在國內(nèi)批準(zhǔn)上市，主要用于胃食管反流性疾病(GERD)-糜爛性反流性食管炎的治療[1-2]。各國藥典均未收載埃索美拉唑鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)，僅收載了其鎂鹽標(biāo)準(zhǔn)[3-5]。國內(nèi)關(guān)于埃索美拉唑鈉鹽和鎂鹽的有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定報(bào)道很多[6-8]，但在測(cè)定有關(guān)物質(zhì)時(shí)，僅考慮了已知雜質(zhì)和工藝雜質(zhì)，且選擇在埃索美拉唑鈉母體藥物的最大吸收波長(zhǎng)下(302 nm)測(cè)定的有關(guān)物質(zhì)，存在一定的局限性。本文在文獻(xiàn)方法的基礎(chǔ)上，以樣品在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過程中的降解雜質(zhì)為主，選擇280 nm作為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)，采用自身對(duì)照法進(jìn)行定量，進(jìn)一步優(yōu)化并建立HPLC法對(duì)埃索美拉唑鈉中雜質(zhì)的控制方法，并對(duì)該法進(jìn)行了全面的方法學(xué)研究，擬建立一種專屬性強(qiáng)、靈敏度高、能對(duì)埃索美拉唑鈉中雜質(zhì)進(jìn)行有效控制的方法。埃索美拉唑及其主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1埃索美拉唑鈉及其主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式

a.H431/41；B.H118/87；C.H168/68；D.埃索美拉唑鈉；E.H193/61；F.奧美拉唑硫醚

Fig.1 Structures of esomeprazole sodium and its related substances

a.1，4-2H-1-(5-methoxy-1H-benzimidazole-2-xy)-3，5-dimethyl-4-oxy-2-pyridinecarboxylic acid； B.5-methoxy-2-mercaptobenzimidazole；C.omeprazole sulfone；.D.esomeprazole sodium；E.1-methyl-5-methoxy-2-((4-methoxy-3，5-dimethyl-2-pyridyl) methyl) sulfinyl-benzimidazole；F.omeprazole sulfide

1儀器與試藥

1.1儀器島津LC-2010AHT高效液相色譜儀；島津LC-Solution 色譜工作站。

1.2試藥埃索美拉唑鈉原料(西安新通藥物研究有限公司，批號(hào)140301，140302，140303)；A(蘇州朗科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120716)；B(天津卡普?？萍加邢薰?，批號(hào)CAPC052402)；C(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)100838-200601)；E(蘇州朗科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120224)；F(西安新通藥物研

究有限公司，批號(hào)131101)；乙腈為色譜純，購自Merck公司；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件采用Capcell Pak C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相采用0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=7.6±0.2)(A)-乙腈(B)梯度洗脫(表1);流速為1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;進(jìn)樣量為20 μL。

表1梯度洗脫順序表

Tab.1 Gradient elution program

時(shí)間/minAB08812107525303565318812408812

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液取埃索美拉唑鈉10 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，臨用新配。

2.2.2對(duì)照溶液精密吸取供試品溶液5 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取上述溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性分別取A，B，C，D，E和F各10 mg，精密稱定，置于同一50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取250 μL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。

2.4專屬性取埃索美拉唑鈉50 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶中，作為未破壞溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。精密吸取儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為0.3%的過氧化氫溶液1 mL，搖勻，室溫放置10 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為氧化破壞溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。精密吸取儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1的鹽酸溶液1 mL，搖勻，室溫放置5 min，加入0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1 mL中和，加甲醇稀釋至刻度，搖勻作為酸破壞溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。精密吸取儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液1 mL，搖勻，室溫放置12 h，加入0.1 mol·L-1的鹽酸溶液1 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為堿破壞溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。精密吸取儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，在高溫條件(60 ℃)下放置3 h，作為高溫破壞溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。精密吸取儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，在光照條件(4 500±500 lx)下放置12 h，作為光破壞溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。見圖3。

圖2系統(tǒng)適用性HPLC圖

1.H431/41；2.H118/87；3.H168/68；4.埃索美拉唑鈉；5.H193/61；6.奧美拉唑硫醚

Fig.2 HPLC chromatograms of system suitability

1.1，4-2H-1-(5-methoxy-1H-benzimidazole-2-xy)-3，5-dimethyl-4-oxy-2-pyridinecarboxylic acid； 2.5-methoxy-2-mercaptobenzimidazole；3.omeprazole sulfone；.4.esomeprazole sodium；5.1-methyl-5-methoxy-2-((4-methoxy-3，5-dimethyl-2-pyridyl)methyl)sulfinyl-benzimidazole；6.omeprazole sulfide

圖3破壞實(shí)驗(yàn)HPLC圖

a.未破壞樣品; B.氧化破壞; C.酸破壞; D.堿破壞; E.高溫破壞; F.光照破壞;1.H431/41；2.H118/87；3.H168/68；4.埃索美拉唑鈉；5.H193/61；6.奧美拉唑硫醚

Fig.3 HPLC chromatograms of degradation test

a.sample undestroyed; B.destroyed by oxidation; C.destroyed by acid; D.destroyed by alkali; E.destroyed by heat; F.destroyed by strong light; 1.1，4-2H-1-(5-methoxy-1H-benzimidazole-2-xy)-3，5-dimethyl-4-oxy-2-pyridinecarboxylic acid； 2.5-methoxy-2-mercaptobenzimidazole；3.omeprazole sulfone；4.esomeprazole sodium；5.1-methyl-5-methoxy-2-((4-methoxy-3，5-dimethyl-2-pyridyl)methyl)sulfinyl-benzimidazole；6.omeprazole sulfide

破壞實(shí)驗(yàn)與已知雜質(zhì)相關(guān)性：埃索美拉唑鈉原料在溶液狀態(tài)下對(duì)氧化、酸、堿、高溫、光照均不穩(wěn)定，雜質(zhì)A在高溫、光照破壞下均降解產(chǎn)生；雜質(zhì)B在高溫下由硫醚鍵斷裂產(chǎn)生；雜質(zhì)C為氧化破壞的主要雜質(zhì)，由結(jié)構(gòu)中的亞砜氧化成砜；雜質(zhì)E和F主要在酸和高溫破壞下產(chǎn)生。

2.5峰純度實(shí)驗(yàn)選用破壞雜質(zhì)較多的高溫破壞后的供試液與未破壞供試液，在帶光二極管陣列檢測(cè)器的液相色譜儀中進(jìn)樣，檢測(cè)峰純度，高溫破壞樣品及未破壞樣品的主峰峰純度大于其單點(diǎn)純度閾值，可表明在此實(shí)驗(yàn)條件下，能夠檢測(cè)到可能產(chǎn)生的雜質(zhì)，且主峰中未包裹其他雜質(zhì)，表明本系統(tǒng)適用性良好。

2.6線性與范圍精密稱取A，B，C，D，E和F適量，配制成1 mL含0.2 mg·mL-1的溶液，作為各雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液。分別精密吸取各雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液適量，配制成1 mL分別含A，B，C，D，E和F 2.5 μg的混合溶液，分別進(jìn)樣不同體積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見表2。

表2各雜質(zhì)線性范圍測(cè)定結(jié)果

Tab.2 The results of linear regression of the investigated impurities

化合物回歸方程線性范圍/ngrH431/41Y=1673．9X-49．770．8～66．30．9999H118/87Y=916．3X+386．962．0～59．10．9995H168/66Y=1462．8X+59．7551．0～75．60．9999H193/61Y=1567．1X+105．361．0～74．71．0000奧美拉唑硫醚Y=1260．5X+760．631．4～94．80．9995埃索美拉唑鈉Y=1411．5X+551．990．5～149．70．9999

2.7精密度實(shí)驗(yàn)取埃索美拉唑鈉原料及各雜質(zhì)(H431/41、H118/87、H168/66、H193/61、奧美拉唑硫醚)適量，稀釋制成1 mL含埃索美拉唑鈉及各雜質(zhì)均約2.5 μg的混合溶液，6種混合溶液的主峰及各個(gè)雜質(zhì)峰峰面積的RSD均在0.54%～0.82%范圍內(nèi)，滿足系統(tǒng)適用性要求(≤2%)，表明該方法的精密度良好。

2.8溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)配制供試品溶液，在室溫下連續(xù)進(jìn)樣12 h。供試品溶液在室溫下保存不穩(wěn)定，雜質(zhì)個(gè)數(shù)及雜質(zhì)量均有所增加，因此應(yīng)臨用新配。

2.9流動(dòng)相pH值的考察將流動(dòng)相的pH值調(diào)至7.40，7.60和7.80，分別在不同色譜條件下，取系統(tǒng)適用性溶液，進(jìn)樣進(jìn)行比較，見圖4。結(jié)果表明，pH值影響各峰的相對(duì)保留時(shí)間以及各峰之間的分離度，但各峰之間的分離度均能符合規(guī)定，因此該方法對(duì)流動(dòng)相在pH值為7.6±0.2的范圍內(nèi)波動(dòng)具有良好的耐用性。

2.10樣品測(cè)定取本品3樣品埃索美拉唑鈉10 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，臨用新配。精密量取供試品溶液5 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液20 μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分峰的峰高約為滿量程的10%～20%；再精密量取對(duì)照溶液及供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。用自身對(duì)照法計(jì)算各雜質(zhì)的量及雜質(zhì)總和。結(jié)果見表3。

圖4不同pH值流動(dòng)相系統(tǒng)適用性溶液HPLC圖

a. 流動(dòng)相pH為7.40系統(tǒng)適用性溶液； B.流動(dòng)相pH為7.60系統(tǒng)適用性溶液； C.流動(dòng)相pH為7.80系統(tǒng)適用性溶液;

1.H431/41；2.H118/87；3.H168/68；4.埃索美拉唑鈉；5.H193/61；6.奧美拉唑硫醚

Fig.4 HPLC chromatograms of different mobile phase pH

a.system suitability solution with mobile phase pH 7.40;B.system suitability solution with mobile phase pH 7.60;C.system suitability solution with mobile phase pH 7.80;1.1，4-2H-1-(5-methoxy-1H-benzimidazole-2-xy)-3，5-dimethyl-4-oxy-2-pyridinecarboxylic acid； 2.5-methoxy-2-mercaptobenzimidazole；3.omeprazole sulfone；.4.esomeprazole sodium；5.1-methyl-5-methoxy-2-((4-methoxy-3，5-dimethyl-2-pyridyl)methyl)sulfinyl-benzimidazole；6.omeprazole sulfide

表3有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

Tab.3 Content determination results of the related substances

雜質(zhì)1403011403021404014A---B---C(%)0．020．030．04E---F---未知雜質(zhì)(%)0．030．030．03雜質(zhì)個(gè)數(shù)2．002．002．00總雜(%)0．050．060．07

注：-表示為未標(biāo)注。

3討論

文獻(xiàn)中，埃索美拉唑鈉、埃索美拉唑鎂及奧美拉唑類原料或制劑有關(guān)物質(zhì)波長(zhǎng)多選擇在280 或302 nm，本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器對(duì)已知雜質(zhì)及高溫破壞下未知雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，以觀察雜質(zhì)的吸收波長(zhǎng)。結(jié)果，在系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中，埃索美拉唑鈉主峰與已知雜質(zhì)A，B，C，E和F都在302 nm附近有最大吸收；而高溫破壞溶液色譜圖中，各未知雜質(zhì)均在280 nm附近有最大吸收，分析其原因，可能是有關(guān)物質(zhì)控制雜質(zhì)的側(cè)重點(diǎn)不同，考慮到已知雜質(zhì)有對(duì)照品可參考，且樣品在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過程中以降解雜質(zhì)為主，因此本實(shí)驗(yàn)中，擬定選擇280 nm作為有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)波長(zhǎng)，重點(diǎn)控制未知雜質(zhì)的含量。

在線性實(shí)驗(yàn)中得出,已知雜質(zhì)的線性回歸方程：Y=aX+b，通過比較埃索美拉唑鈉的斜率與各已知雜質(zhì)的斜率之比可得到各已知雜質(zhì)的校正因子。結(jié)果表明，雜質(zhì)C、E和F的校正因子均在0.9～1.1之間，雜質(zhì)的量可以按照不加校正因子的自身對(duì)照法來進(jìn)行計(jì)算。雜質(zhì)A的校正因子為0.84，如果按照加校正因子的自身對(duì)照法來計(jì)算，即主峰自身對(duì)照的峰面積乘以校正因子0.84，計(jì)算結(jié)果比不加校正因子的自身對(duì)照法相比，該雜質(zhì)的含量偏低。為了能更嚴(yán)格的控制雜質(zhì)的量，且該雜質(zhì)的校正因子接近0.9，因此對(duì)該雜質(zhì)的計(jì)算仍然按照不加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算其含量。雜質(zhì)B的校正因子不在0.9～1.1之間，需要采用加校正因子的自身對(duì)照法來計(jì)算其含量。

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Related substances analysis for esomeprazole sodium by HPLC

MA Yan1，2，WANG Yuan2，LUO Zhimin1，CHANG Chun1，F(xiàn)U Qiang1*(1.School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China；2.Xi′an Xintong Pharmacy Limited Company, Xi′an 710077，China)

Abstract:Objective To establish an HPLC method for the determination of related substances of esomeprazole sodium. Method The determination was performed on a Capcell Pak C18column. The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.01 mol·L-1phosphate buffer(pH=7.6±0.2).The flow rate was 1.0 mL·min-1and the detection wavelength was 280 nm. Results Related substances were completely separated from the main constituent. H431/41, H118/87, H168/66, esomeprazole sodium, H193/61 and omeprazole sulfide showed good linearity over the ranges of 0.8-66.3 ng(r=0.999 9)，2.0-59.1 ng(r=0.999 5),1.0-75.6 ng(r=0.999 9)，0.5-149.7 ng(r=0.999 9)，1.0-74.7 ng(r=1.000 0) and 1.4-94.8 ng(r=0.999 5)，respectively. The RSD was 0.54%-0.82% and the precision was satisfactory. Conclusion The esteblished method can be used for testing the product quality of esomeprazole sodium.

Key words:esomeprazole sodium；related substances；HPLC

(收稿日期：2015-06-11)

*通信作者：傅強(qiáng)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師

作者簡(jiǎn)介：馬延，男，在職碩士研究生

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)02-0154-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.013