何林姣，劉曉靜，黃金莎，莊偉,3，應漢杰,3

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氨基樹脂表面活化提高固定化核酸酶P1連續(xù)催化性能

何林姣1,2，劉曉靜1,2，黃金莎1,2，莊偉1,2,3，應漢杰1,2,3

（1南京工業(yè)大學材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；2南京工業(yè)大學制藥與生物工程學院國家生化工程技術研究中心，江蘇 南京 211816；3南京工業(yè)大學江蘇先進生物與化學制造協同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 211816）

考察了固定化酶常用載體-氨基樹脂幾何結構及表面活化過程對固定化核酸酶P1性能的影響，并進行了動力學和連續(xù)催化穩(wěn)定性研究。FESEM、BET及FTIR等表征發(fā)現，氨基樹脂具有大量酶可利用的孔，在固定化過程中核酸酶P1主要利用的孔徑范圍為4～30 nm。相對游離的核酸酶P1而言，所得固定酶耐酸、耐熱性增強；米氏動力學研究表明各組固定酶對底物的親和力下降，最大反應速率下降；后交聯組的重復利用性相對物理吸附、化學交聯組明顯增強。優(yōu)化的固定化條件為：酶和載體比例為3:20（質量比），酶濃度為0.8 g·L-1，酶液pH為6.0，固定時間為10 h，在優(yōu)化條件下所得固定酶的單位載體酶活為10013 U·g-1。同時設計及優(yōu)化柱連續(xù)反應器操作條件，確定反應溫度為65℃，進料流量為0.75 ml·min-1，使得產品的核苷酸濃度維持30 g·L-1（水解率為60%）以上的累計時長達120 h，有利于核酸酶P1連續(xù)生產核苷酸的工業(yè)化應用。

氨基樹脂；核酸酶P1；交聯；表面活化；柱連續(xù)反應器

引 言

近年來，由于生物催化具有底物特異性和綠色化學的優(yōu)勢而受到關注，然而游離酶生物催化在工業(yè)化應用中存在穩(wěn)定性、工業(yè)環(huán)境耐受性、重復利用性差及分離困難等因素，使得其在工業(yè)應用上受到限制。解決酶催化工業(yè)應用的關鍵技術就是固定化[1-2]。

核苷酸是核酸的單體分子，廣泛分布于生物體內各器官、組織的細胞核及細胞質中，并作為核酸的組成成分參與生物的遺傳、發(fā)育、生長等基本生命活動，是一類具有重要生理功能的物質，在農 業(yè)[3]、醫(yī)藥[4]、食品[5]、飼料[6]和營養(yǎng)保健品[7-8]領域用途廣泛。目前核苷酸的生產方法有水解法(包括酶解法、酸解及堿解)[9]、發(fā)酵法[10]、化學合成法及自溶法[11]等，化學合成法用到有毒的化工原料，與提倡綠色產品的理念相違背；微生物發(fā)酵法目前僅有肌苷酸和鳥苷酸實現了工業(yè)化生產；自溶法產物濃度低，總收率較低，提取困難；酶解法利用核酸水解酶水解酵母核酸，由于原料來源豐富、價格低廉、綠色無污染，仍是目前核苷酸生產的主要方法[12]。

核酸酶P1（E.C.3.1.30.1）是酶法生產5′-核苷酸的主要工業(yè)用酶，它是由桔青霉產生的一種能將單鏈DNA和RNA水解為5′-核苷酸的磷酸二酯 酶[13-14]。游離核酸酶P1釜式反應酶解酵母核酸的工藝雖然已經被廣泛應用，但由于酶利用率低、產物底物雙抑制、產品分離純化困難等問題，導致核苷酸游離酶生產工藝效益不高，因此研究者一直致力于核苷酸的固定化酶連續(xù)生產以期提高其生產效 益[15]。Rokugawa等[9,16-17]以離子作用先將純化的核酸酶Pl固定在鈦化纖維素上，酶活回收率為83%，隨后又分別以鈦化離子交換樹脂和鈦化無機載體（包括大孔硅膠珠、大空玻璃珠和浮石等）為載體固定化核酸酶P1，其酶活回收率均大于50%，同時設計固定床柱反應器水解1%的RNA，底物完全水解且可連續(xù)運行24 d以上。Shi等[18-20]以共價和交聯法先后將核酸酶Pl粗酶固定在纖維素及殼聚糖微球上，其酶活回收率均大于50%。Li等[21]利用大孔吸附樹脂交聯核酸酶P1，明顯提高了酶的熱穩(wěn)定性。楊大令等[22]及石陸娥[23]用酶膜反應器實現了核酸 RNA 的連續(xù)水解生產核苷酸，平均核酸水解率達80%以上，且可將多個膜反應器串聯連續(xù)使用10次。但酶膜反應器水解一定時間后膜出現堵塞，需要再生處理，且維護費用較高，難以實現工業(yè)化[24]。因此尋求穩(wěn)定性高、載酶量大、易于連續(xù)生產的載體是實現核苷酸高效生產的必要前提。

氨基功能化樹脂作為一種人工合成的介孔多聚物，具有機械強度高、穩(wěn)定性好、載酶量大[25]、易于分離、可重復使用等優(yōu)點，已經被廣泛用作固定化酶載體[26-28]。張豐華等[29]比較了環(huán)氧基和氨基樹脂兩種載體對β-半乳糖苷酶固定性能的影響，結果表明氨基功能載體酶固定化率（氨基樹脂的負載率是72%，比環(huán)氧樹脂高出3倍）、熱穩(wěn)定性及重復利用性均高于環(huán)氧基樹脂。Li等[30]用聚乙烯亞胺活化弱堿性陰離子樹脂，可逆并選擇性地從粗酶液中固定核酸酶P1，同時進行了連續(xù)低濃度的核糖核酸水解。然而該固定酶仍舊存在固定量及酶活性偏低、穩(wěn)定性不夠等問題。因此可從樹脂的孔徑、固定方法的選擇出發(fā)，尋找酶活性高、穩(wěn)定性好的制備固定酶的方法[25]。

本文將采用氨基功能化樹脂對核酸酶P1固定化進行研究，通過調控固定化條件，設計連續(xù)酶解反應器及優(yōu)化連續(xù)酶解工藝參數，同時還將考察其酶學性質、儲存穩(wěn)定性及重復利用性，以解決游離酶穩(wěn)定性、重復利用及分離困難等難題，實現復合物連續(xù)酶解核酸的穩(wěn)定工藝。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑及儀器

核酸酶P1粗酶液和核糖核酸（RNA≥90%）均購自同凱兆業(yè)有限公司；50%戊二醛（C5H8O2）購自上海阿拉丁試劑，為分析純；磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、醋酸（HAc）、醋酸鈉（NaAc）、氫氧化鈉（NaOH）等均購自上海凌峰化學試劑有限公司，為分析純；實驗用水為商業(yè)可用純凈水。

本實驗所用固定化酶載體HA樹脂為南京工業(yè)大學國家生化中心應漢杰課題組提供，該樹脂的主要理化性質見表1。

表1 HA樹脂的理化性質

主要儀器：紫外可見分光光度計（UV-2000, UNICO, USA），恒流泵（BT300-1J，蘭格，保定），離心機（Centrifuge 5810R, Eppendorf, Germany），節(jié)能型智能恒溫槽（DC-2015，新芝，寧波），中空纖維超濾機（MW 6000，大川，天津），高效液相色譜儀（1200，Agilent，USA）。

1.2 核酸酶P1初步純化

核酸酶P1來自桔青霉發(fā)酵液，首先用中空纖維超濾機將約100 L的粗酶液濃縮至1/100。然后將濃縮液在70℃下熱處理15 min，冷卻至室溫后8600離心10 min除去在熱處理過程中形成的沉淀[13]。純化酶的蛋白濃度為1.04 g·L-1，比酶活為2.169×106U·g-1。

1.3 酶的固定化

載體活化：100 g載體加入400 ml，0.1 mol·L-1pH 8.0的PBS緩沖液，攪拌15 min后，測pH維持 pH 7.8～8.2，1 h后過濾抽干；處理后的載體加入400 ml，2%的戊二醛PBS緩沖液，25℃下攪拌1 h，過濾，用去離子水洗滌載體至水清[25]，得到的活化載體記為HA-GA。

固定酶（物理吸附法）：取1 g空白HA載體于三角瓶中，加入一定量的酶液，并調節(jié)酶液pH，120 r·min-1室溫攪拌，一定時間后分離上清并用水洗去表面結合松散的蛋白，抽濾干燥，冰箱4℃保存。同時考察不同酶量、酶濃度、酶液pH及固定時間對酶固定化效果的影響[31]，收集剩余固定液以備檢測蛋白濃度，得到的固定酶記為HA-E。

固定酶（交聯法）：取1 g活化好的載體HA-GA于三角瓶中，加入一定量的酶液，其余操作同物理吸附法，記為HA-GA-E。

固定酶（后交聯法）：取1 g活化好的載體HA-GA于三角瓶中，加入一定量的酶液，并調節(jié)酶液pH，120 r·min-1室溫攪拌，一定時間后加入1%的戊二醛水溶液[50%（質量）]，繼續(xù)攪拌1 h后分離上清并水洗抽濾干燥，冰箱4℃保存，記為HA-GA-E-GA。

1.4 蛋白固定量檢測

采用考馬斯亮藍法[32]，以牛血清白蛋白為標品測定蛋白量，依據式（1）計算蛋白固定量。

loading capacity (mg·g-1)(1)

式中，為固定化所用的酶溶液的體積，ml；0為固定化之前酶溶液的蛋白含量，g·L-1；為固定化之后酶溶液中蛋白含量，g·L-1；為加入酶溶液中載體質量，g。

1.5 酶活測定

核酸酶P1的活力測定采用紫外法[13,15,33]。將一定體積的底物溶液（5% RNA與0.2 mol·L-1pH 5.0 的醋酸緩沖液1:1混合）于70℃恒溫水浴，10 min后加入一定量的游離酶或固定酶，70℃保溫15 min后加入等體積核酸沉淀劑（0.25%鉬酸銨-2.5%過氯酸），冰水浴10 min后離心、取上清液，用蒸餾水稀釋一定倍數，測定其260 nm處的吸光值260。以先加沉淀劑者作為對照，其他操作同前。在上述條件下，每分鐘所生成的核苷酸在260 nm處的吸光值的差值為1.0時定義為1個酶活力單位。其計算公式如下

式中，1為游離酶酶活，U·ml-1；2為固定酶酶活，U·g-1；為反應液的總體積，ml；為游離酶的稀釋倍數；為離心上清液的稀釋倍數；為加入游離酶的體積，ml；為加入固定酶的質 量，g。

固定酶酶活回收率計算公式如下

activity recovery (%)(4)

1.6 核苷酸含量的HPLC法檢測

精密稱取4種核苷酸的標品配制成質量濃度約為0.1 g·L-1的標準品水溶液；將經預處理的樣品用水稀釋至約0.1 g·L-1，并用0.22 μm微孔膜進行過濾。

色譜柱：美國賽分科技有限公司Sepax HP-C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：A：20 mmol·L-1的NH4H2PO4溶液+3.5%（體積）甲醇 （用超純水配制）；B：甲醇，梯度洗脫；流速：1 ml·min-1；溫度：室溫；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μl[34]。

1.7 固定酶催化的最適pH、溫度及動力學研究

參照酶活測定方法，調節(jié)反應底物緩沖液pH 3.6～7.0，反應溫度30～80℃，其余操作不變，考察pH及溫度對各種固定酶催化效果的影響。

保持反應pH、溫度相同，設置不同濃度底物2～12 g·L-1，反應一段時間取樣檢測核苷酸生成量，計算其產物生成速率，以產物生成速率對底物濃度作圖，米氏動力學方程擬合計算米氏常數m及最大反應速率max[35-36]。

1.8 固定化酶的重復利用性研究

在每一批次催化完成后，將固定化酶濾出，用去離子水洗滌，然后用于下一批次的催化，以此類推，得出固定化酶的重復利用效果。

1.9 固定化酶的連續(xù)催化

（1）取按上述優(yōu)化條件固定的酶50 g裝入到直徑2.7 cm，高22 cm的玻璃柱內，測得固定化酶的床層高11 cm。

（2）將5%的RNA溶液（50 g·L-1）以一定流量由上至下流經固定酶床層，每隔一段時間取1 ml流出液，用HPLC測其核苷酸生成量[37]。

1.10 表征

采用場發(fā)射高分辨率掃描電子顯微鏡（FESEM，Hitachi S-4800）觀察納米材料的形貌和微觀結構，樣品制備方法：將少量經真空冷凍干燥的樹脂微球剖開并固定在載物臺的導電膠上進行表征；通過紅外光譜分析儀（PerkinElmer，Spectrum BX II）在4000～400 cm-1范圍掃描得到紅外光譜；氮氣吸附-脫附曲線采用全自動氮吸附比表面和孔隙分析儀（TristarⅡ3020，Micromertics）測試，并分別通過BET方程和BJH模型計算得到材料的比表面積、孔容和孔徑數據。

2 結果與討論

2.1 氨基樹脂微球形貌結構表征

圖1是對氨基樹脂微球的形貌表征結果。如圖1(a)所示，通過FESEM表征可看出樹脂微球樣品呈球狀形貌，直徑約0.5 mm。圖1(b)為樹脂微球橫截面的FESEM圖，可見微球內部結構蓬松、孔道豐富。圖1(c)，(d)分別是對微球表面和截面的放大，可清晰看出孔道和內部多孔結構的存在，這在N2吸附-脫附表征中也可以證明。

圖1 氨基樹脂微球形貌結構表征的FESEM圖譜

2.2 氨基樹脂固定核酸酶P1

固定條件在很大程度上決定了酶分子在載體表面的構象變化，影響固定酶的活性及穩(wěn)定性。本實驗優(yōu)化了HA氨基樹脂固定核酸酶P1的條件。

蛋白表面電荷豐富，與載體間靜電作用的強弱會顯著影響固定化酶的吸附量和穩(wěn)定性。調控pH是調節(jié)表面電荷的關鍵因素之一。結果如圖2所示，蛋白負載量隨pH增加而增加，但在pH 5.0～7.0之間變化不明顯，說明在該條件下吸附和共價交聯反應已經達到平衡，pH對蛋白負載量無明顯影響；單位載體酶活隨pH增加呈現急劇的先增后減趨勢，在pH 6.0時取得最大酶活值，說明pH對酶活影響較大，這與游離核酸酶P1的耐受范圍為pH 4.0～7.0有關[13]，故選擇固定液最適pH為6.0。

圖2 酶液pH對核酸酶P1固定效果的影響

氨基樹脂微球具有介孔材料大孔道、高比表面積、高孔容、酶負載量大的特性?？疾烀讣恿繉潭感阅艿挠绊?，不僅可以充分利用載體表面活性位點，而且可以避免蛋白堆疊作用對固定酶酶活及穩(wěn)定性造成的消極影響。結果如圖3所示，蛋白負載量隨酶加量增加而增加，最終達到吸附飽和；單位載體酶活隨酶加量增加呈現緩慢的先增后減趨勢，在酶加量為150 mg·(g載體)-1時取得最大酶活值，說明該固定量下蛋白處于最佳構象狀態(tài)[38]。

圖3 酶加量對核酸酶P1固定效果的影響

固定過程中，酶濃度高低會影響載體表面位點對酶分子結合的選擇性。考察相同酶加量下不同酶濃度對酶固定化效果的影響，結果如圖4所示，酶濃度對蛋白負載量幾乎沒有影響，而對單位載體酶活影響強烈。單位載體酶活隨酶濃度降低先急劇上升而后趨于穩(wěn)定，當酶濃度降低至0.8 g·L-1時，取得最大單位載體酶活[39]。

圖4 酶濃度對核酸酶P1固定效果的影響

固定時間的長短對酶分子在載體表面保持穩(wěn)定構象具有積極作用。結果如圖5所示，隨固定時間的延長，蛋白負載量呈現緩慢的先增后減趨勢，表明載體表面結合位點在2 h時已達到飽和狀態(tài)，隨時間延長，表面依靠蛋白與蛋白相互作用連接的過載蛋白分子開始脫落，而單位載體酶活增加較明顯，當固定時間為10 h時取得最大值，說明表面過載蛋白的脫落更有利于酶活性的發(fā)揮和蛋白構象的保持[40]。

圖5 固定時間對核酸酶P1固定效果的影響

驗證實驗在優(yōu)化條件下所得固定酶的單位載體酶活為10013 U·g-1，酶活回收率為35.7%。固定化核酸酶P1制備前人已有很多報道，數據對比如表2所示，其中與本文采用同樣類別載體樹脂的Li 等[30]利用聚乙烯亞胺（PEI）活化樹脂固定核酸酶P1，制備的固定酶單位載體酶活為530 U·g-1，本實驗所得固定酶相比前人工作，雖然酶活回收率有所下降，但單位載體酶活相比Li等高出約18倍，體現了本文表面活化的顯著效果。

表2 核酸酶P1固定化酶文獻對比

樹脂微球的粒徑尺寸、孔道結構及孔徑大小變化都可以反映酶在載體表面的狀態(tài)并對酶的擴散及固定化量產生顯著影響。圖6為固定過程載體的氮氣吸-脫附等溫線和孔徑分布曲線，從圖6(a)可以看出樣品的氮氣吸附等溫線是Ⅰ型和Ⅳ型的耦合，說明具有介孔和微孔復合結構。從圖6(b)中可看出空白HA載體的孔徑分布集中在4～30 nm，戊二醛修飾后（HA-GA）孔徑在20～30 nm之間的數量明顯減少，連接酶后（HA-GA-E）孔徑分布曲線左移，小孔數目增加，說明固定核酸酶P1主要利用的孔尺寸為4～30 nm（核酸酶P1的尺寸為5.7 nm×4.3 nm×2.3 nm[43]）。樣品的比表面積、最可幾孔徑和孔容列于表3中，可以發(fā)現表面活化會降低比表面積、孔徑和孔容，但是孔分布范圍基本不變。固定化核酸酶P1后，不僅會造成比表面積、孔徑和孔容的降低，而且由于酶會使大孔變小孔，造成孔分布區(qū)間中小孔的比例大幅提升。

表3 固定過程載體的結構參數

① The specific surface areas were calculated from the adsorption data in the relative pressure range of 0.05 to 0.3 using the BET method;

② The total pore volume was estimated from the amount adsorbed at a relative pressure of 0.90;

③ Pore sizes at maxima of the pore size distribution calculated based on the adsorption branch using the BJH method.

圖7為HA樹脂固定化核酸酶P1過程的FTIR圖譜，戊二醛修飾后（HA-GA）的圖譜在3500 cm-1處的NH2，2850 cm-1處的NH吸收峰強度均減弱，1715 cm-1處的CHO峰強增加，表明戊二醛通過一個醛基與HA表面NH2形成席夫堿而成功實現連接[25]。連接酶后（HA-GA-E）的圖譜在1715 cm-1處的CHO峰消失，3500 cm-1處的NH2峰增加，說明酶蛋白分子與戊二醛上另一個CHO反應，同時引入部分氨基殘基。

圖7 固定過程的FTIR圖譜

2.3 HA樹脂固定核酸酶P1酶學性質研究

圖8考察了pH及溫度對酶催化活性的影響，從圖8(a)可以看出，游離酶反應的最適pH為5.5，而固定酶的最適pH為5.0，表現出耐酸性增強耐堿性下降。分析原因可能是載體表面的氨基中和了溶液中的質子，使得固定酶分子周圍的微環(huán)境酸性降低，表現出酸耐受性增強，同理，表面氨基增強了固定酶分子微環(huán)境的堿性，表現出耐堿性下降。從圖8(b)可以看出，各種酶反應的最適溫度均為75℃，且耐熱性都有不同程度的提高，物理吸附法、交聯法、后交聯法耐熱性依次增強，這與載體及戊二醛提高酶構象穩(wěn)定性有關。

圖8 酶催化活性影響因素的考察

圖9為酶催化的動力學曲線比較，動力學參數統計如表4所示，擬合相關性2均大于0.9，說明該酶反應動力學符合米氏動力學方程。固定酶的米氏常數m相對游離酶均增加，最大反應速率max均降低，表明固定酶對底物的親和力下降，最大反應速率下降。這主要是由于固定化一定程度上降低了酶與底物接觸的機會，且限制了底物與產物的傳質速率，同時固定化過程也會引起酶構象變化[36]。

圖9 不同形式酶的催化動力學曲線比較

表4 不同形式酶的催化反應參數比較

圖10為HA樹脂不同方法固定核酸酶P1的重復利用性，隨使用次數增加，固定酶酶活保留率均降低，其中后交聯組重復使用8批次后，仍保留初始酶活的50%以上，穩(wěn)定性相對物理吸附組及交聯組明顯增強，說明后交聯能顯著增強固定酶的穩(wěn)定性。

圖10 HA樹脂不同方法固定核酸酶P1的重復利用性

2.4 HA樹脂固定核酸酶P1柱連續(xù)反應器設計及優(yōu)化

為實現固定化酶連續(xù)催化降解核酸，本實驗在前人基礎上設計出柱連續(xù)反應器，簡要示意圖見圖11，其中柱1起過濾、脫色及脫除加熱過程中料液中產生的氣體的作用，柱2為固定酶催化降解RNA的反應柱。相比前人工作，本實驗設計了底物預處理裝置，可以延緩因反應過程中產生的沉淀或雜質而堵塞反應柱。

圖11 柱連續(xù)反應器示意圖

圖12為固定化酶連續(xù)固定床反應器操作條件優(yōu)化。圖12(a)考察了反應溫度對連續(xù)催化的影響，隨著催化時間延長，各溫度下生成核苷酸濃度逐漸下降，70℃下生成核苷酸濃度維持35 g·L-1的時間僅30 h，后期急劇下降。相比其他溫度條件，65℃時生成核苷酸濃度維持時間更長，因為降低反應溫度可以減緩核酸酶P1酶活下降速率，故長時間連續(xù)催化應該降低反應溫度。從圖12(b)可以看出，進料流量增加，核苷酸濃度增長加快，但隨著酶解時間延長，核苷酸濃度急劇下降。當進料流量為0.75 ml·min-1時，產品的核苷酸濃度比較穩(wěn)定。

圖12 優(yōu)化固定酶連續(xù)固定床反應器的反應溫度(a)和進料流量(b)

圖13為優(yōu)化條件下固定酶連續(xù)水解5% RNA的穩(wěn)定性，連續(xù)酶解一定時間后，產品濃度下降，故需下柱洗滌固定酶微球之間及微球內部微孔的雜質[37]。連續(xù)4次上柱催化反應，產品的核苷酸濃度維持30 g·L-1（水解率為60%）以上的累計時長達120 h，可見本實驗得到的固定酶穩(wěn)定性良好。相比前人工作（如表2所示），本實驗連續(xù)酶解的底物濃度由0.5%提高到5%，提濃10倍仍能保持良好的穩(wěn)定性。2014年Li等[30]用聚乙烯亞胺活化弱堿性陰離子樹脂固定核酸酶P1連續(xù)降解2%的核糖核酸累積運行12 h。本實驗設計的固定床反應器相比Li等底物處理濃度提高1.5倍，連續(xù)運行時間提高10倍以上，這都歸功于反應器設計中柱1的過濾、脫色及脫氣功能。

圖13 優(yōu)化條件下固定酶連續(xù)水解RNA的穩(wěn)定性

3 結 論

（1）選取HA氨基樹脂作為固定化核酸酶P1的載體，FESEM、BET及FTIR圖譜證明該樹脂微球直徑為0.3～0.5 mm，固定化過程主要利用的孔徑范圍為4～30 nm。

（2）優(yōu)化HA氨基樹脂固定核酸酶P1的固定條件：酶和載體比例為3:20（質量比），酶濃度為0.8 g·L-1，酶液pH為6.0，固定時間為10 h，在優(yōu)化條件下所得固定酶的單位載體酶活為10013 U·g-1。同時比較物理吸附、化學交聯及后交聯3種固定方法所得固定酶的酶學性質，相對游離的核酸酶P1，最適反應pH向酸性偏移，熱穩(wěn)定性增強，固定酶對底物的親和力下降，最大反應速率下降，后交聯組的重復利用性相對物理吸附組及交聯組明顯增強。

（3）設計及優(yōu)化HA樹脂固定核酸酶P1柱連續(xù)反應器操作條件，確定連續(xù)催化反應溫度為 65℃，進料流量為0.75 ml·min-1，使得產品核苷酸濃度維持30 g·L-1（水解率為60%）以上的累計時長達120 h。

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Fortified continous catalytic properties of immobilized nuclease P1with surface activated HA amino resin

HE Linjiao1,2, LIU Xiaojing1,2,HUANG Jinsha1,2, ZHUANG Wei1,2,3, YING Hanjie1,2,3

(1Sate Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, Jiangsu, China;2National Engineering Research Center for Biotechnology, School of Biological and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, Jiangsu, China;3The Synergetic Innovation Center for Advanced Materials, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, Jiangsu, China)

The effect of HA amino resin (immobilized enzyme widely-used carrier) geometry and surface activated process on the immobilized nuclease P1’s properties was studied. In addition, the dynamic analysis and continuous catalytic properties were also investigated. FESEM, BET and FTIR characterization were utilized to verify that HA amino resin had a great deal of enzymes available hole and the scope of the main hole was 4—30 nm in the immobilized process. Compared with free nuclease P1, the acid resistance and heat resistance of the immobilized enzymes were improved. The study on Michael’s Mention kinetics indicated that the substrate affinity and maximum reaction rate of immobilized enzymes decreased; the reusability of after crosslinking group was significantly enhanced compared to physical adsorption and chemical crosslinking groups. The optimized conditions of immobilization were as follows: the enzyme to carrier ratio of 3:20 (mass ratio), enzyme concentration of 0.8 g·L-1and 10 h immobilized time at pH 6.0. Under these conditions, the immobilized enzyme activity was about 10013 U·g-1. Furthermore, the operating conditions of column flow reactor were designed and optimized. The continuous running time of the reactor was up to 120 h at 30 g·L-1products nucleotide concentration (hydrolysis rate of 60%), when the reaction temperature was 65℃ with substrate flow rate of 0.75 ml·min-1. This work would be beneficial to the application of nuclease P1in nucleotide continuous industrial production.

amino resin; nuclease P1; crosslinking; surface activation; column flow reactor

Q 814

10.11949/j.issn.0438-1157.20160280

date: 2016-03-09.

Prof. YING Hanjie, yinghanjie@njtech.edu.cn

supported by the National Basic Research Program of China (2013CB733501), the National Natural Science Foundation of China (21506090), the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20130929) and Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

A

0438—1157（2016）09—3850—11

國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目（2013CB733501）；國家自然科學基金項目（21506090）；江蘇省自然科學基金項目（BK20130929）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程項目。

2016-03-09收到初稿，2016-04-28收到修改稿。

聯系人：應漢杰。第一作者：何林姣（1990—），女，碩士研究生。