王海霞，黃琰菁，王琳，陳俊民

(海南省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科一區(qū)，海南 ?？?570311)

Ⅱ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者DNA錯配修復狀態(tài)與其臨床特征及預后的關(guān)系

王海霞，黃琰菁，王琳，陳俊民

(海南省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科一區(qū)，海南 ?？?570311)

目的 分析Ⅱ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者DNA錯配修復(MMR)的狀態(tài)與患者臨床特征及預后的相關(guān)性。方法 選取2007年1月至2010年6月我院腫瘤內(nèi)科收治的308例行腫瘤根治術(shù)Ⅱ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者的組織標本，以免疫組織化學法檢測MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表達，將其結(jié)果分為MMR缺失(dMMR)組及MMR完整(pMMR)組，比較兩組患者的臨床特征及預后，并采用Cox比例風險模型分析MMR狀態(tài)與結(jié)腸癌預后的相關(guān)性。結(jié)果 本組結(jié)腸癌dMMR的發(fā)生率為20.8%(64/308)，pMMR為79.2%(244/308)。dMMR組患者中，年齡≤60歲、Ⅱ期、低分化癌、近端結(jié)腸癌及含黏液分泌癌患者的比例較pMMR組顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。dMMR組患者的復發(fā)轉(zhuǎn)移率及病死率分別為18.8%(12/64)、12.5%(8/64)，明顯低于pMMR組的31.6%(77/244)、23.0%(56/244)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；dMMR組患者的5年無病生存率及5年總生存率分別為82.8% (53/64)、87.5%(56/64)，明顯高于pMMR組的69.3%(169/244)、77.0%(188/244)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。經(jīng)Cox比例風險模型分析結(jié)果提示，結(jié)腸癌MMR狀態(tài)是影響患者無病生存時間及總生存時間的一個獨立因素(P＜0.05)。結(jié)論 結(jié)腸癌不同MMR狀態(tài)有著不同的臨床特征，dMMR更多發(fā)生在年齡≤60歲、Ⅱ期、低分化癌、近端結(jié)腸癌及含黏液分泌癌的患者中，其可作為預測結(jié)腸癌預后較好的一個標志物。

結(jié)腸腫瘤；臨床分期；DNA錯配修復；預后

臨床上結(jié)直腸癌患者中以直腸癌發(fā)病率為更高，但有報道顯示，近年來結(jié)腸癌發(fā)病率的增長較迅速[1]。結(jié)腸癌行腫瘤根治性切除術(shù)仍是目前主要治療手段，但Ⅱ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者即使施行根治性切除后復發(fā)轉(zhuǎn)移率仍為20%～50%[2]。近年來有報道提示，DNA錯配修復(DNA mismatch repair，MMR)的狀態(tài)與結(jié)腸癌預后存在著密切聯(lián)系，而結(jié)腸癌中MMR缺失(defective DNA mismatch repair，dMMR)的患者有一定的臨床特征[3]。本研究回顧性分析308例結(jié)腸癌患者不同MMR狀態(tài)與臨床特征及預后的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2007年1月至2010年6月我院收治的結(jié)腸癌308例患者，其中男性188例，女性120例；年齡37～79歲，平均(58.9±12.1)歲；Ⅱ期169例，Ⅲ期139例。入選標準：(1)腫瘤為原發(fā)性結(jié)腸癌；(2)均經(jīng)病理診斷而確診；(3)均行結(jié)腸癌根治切除術(shù)；(4)依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會的分期標準均為Ⅱ～Ⅲ期；(5)手術(shù)前未行放化療且未接受其他抗腫瘤的治療方案；(6)隨訪資料完整；(7)不包括家族性腺瘤性息肉癌變的病例。

1.2MLH1、MSH2、MSH6、PMS2檢測方法 以免疫組織化學法檢測，所用試劑均為丹麥Dako公司生產(chǎn)，包括即用型MLH1、MSH2、MSH6、PMS2四種鼠抗人單克隆抗體，均嚴格按產(chǎn)品說明書要求進行操作。取患者術(shù)后保存結(jié)腸癌組織的蠟塊，選擇腫瘤細胞＞50%的區(qū)域進行取材，切片給予常規(guī)的脫蠟水化處理，以EDTA抗原修復液1 mmol/L(pH 8.0)給予高壓熱修復；再以H2O2(30 mL/L)孵育10 min后經(jīng)蒸餾水沖洗，再以磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5 min；將兔血清工作液滴加后孵育10 min；滴加一抗(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)，于37℃恒溫下孵育2 h，再以PBS行3次沖洗，3 min/次；滴加二抗后孵育15 min，再以PBS行3次沖洗，3 min/次；滴加三抗步驟同二抗；經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，同時以蘇木素復染，然后脫水、透明及封片。陰性對照以PBS代替一抗，陽性對照以正常的結(jié)腸黏膜上皮表達情況。

1.3 結(jié)果判定標準 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均于細胞核定位，出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒則為表達陽性，計為(+)；細胞核不著色為表達缺失，計為(-)。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均表達為(+)判為MMR完整(pMMR)，而MLH1、MSH2、MSH6、PMS2中任意一種表達為(-)則判為dMMR[4]。

1.4 隨訪內(nèi)容 (1)無病生存時間(DFS)：自手術(shù)后至腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移或任何原因致患者死亡的時間；(2)無病生存率；(3)總生存時間(OS)：自手術(shù)后至任何原因致患者死亡的時間；(4)總生存率。隨訪方法為門診復診及電話回訪，隨訪時間截至2015年6月。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以百分數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，以Kaplan-Meier法及Log rank檢驗進行生存分析，以Cox比例風險模型進行單因素、多因素分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌的MMR狀態(tài) 本組結(jié)腸癌dMMR的發(fā)生率為20.8%(64/308)，pMMR為79.2%(244/ 308)。dMMR組中，36例患者為MLH1(-)MSH2(+) MSH6(+)PMS2(-)，13例患者為MLH1(+)MSH2(-) MSH6(-)PMS2(+)，8例患者為MLH1(+)MSH2(+) MSH6(+)PMS2(-)，2例患者為MLH1(+)MSH2(+) MSH6(-)PMS2(+)，2例患者為MLH1(+)MSH2(+) MSH6(-)PMS2(-)，1例患者為 MLH1(-)MSH2(-) MSH6(-)PMS2(-)，1例患者為 MLH1(-)MSH2(+) MSH6(-)PMS2(-)，1例患者為MLH1(+)MSH2(-) MSH6(+)PMS2(+)。結(jié)腸癌組織中MLH1(因MSH2、MSH6、PMS2與MLH1的細胞核染色結(jié)果一致，圖片省略)的表達或缺失情況見圖1、圖2。

圖1 結(jié)腸癌組織中MLH1表達陽性，免疫組化染色×400；

圖2 結(jié)腸癌組織中MLH1表達陰性，免疫組化染色×400

2.2 兩組患者的臨床特征比較 dMMR組在年齡≤60歲、Ⅱ期、低分化癌、近端結(jié)腸癌及含黏液分泌癌各因素的發(fā)生比例較pMMR組顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.3 兩組患者的預后比較 dMMR組復發(fā)轉(zhuǎn)移12例(18.8%)，死亡8例(12.5%)；pMMR組復發(fā)轉(zhuǎn)移77例(31.6%)，死亡56例(23.0%)，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=7.309、5.098，P＜0.05)。dMMR組、pMMR組的5年無病生存率分別為82.8%(53/64)和69.3%(169/244)，5年總生存率分別為87.5%(56/64)和77.0%(188/244)，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=6.411、4.023，P＜0.05)。dMMR組的DFS、OS分別為(36.3±7.2)個月、(54.9±6.6)個月，而pMMR組分別為(22.5±5.9)個月、(30.6±4.9)個月，差異均有統(tǒng)計學意義(t=4.140、3.971，P＜0.05)。

2.4 結(jié)腸癌手術(shù)預后的影響因素 經(jīng)統(tǒng)計學單因素分析結(jié)果提示，與結(jié)腸癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)的因素包括年齡、腫瘤的分化程度、臨床分期、MMR的狀態(tài)(P＜0.05)；而與結(jié)腸癌的死亡明顯相關(guān)的因素包括年齡、腫瘤的分化程度、臨床分期、治療方式以及MMR的狀態(tài)(P＜0.05)。經(jīng)統(tǒng)計學多因素分析結(jié)果提示，影響結(jié)腸癌DFS的獨立因素包括MMR狀態(tài)、臨床分期以及腫瘤的分化程度(P＜0.05)，而影響結(jié)腸癌OS的獨立因素包括MMR狀態(tài)、臨床分期、治療方式以及腫瘤的分化程度(P＜0.05)，見表2和表3。

表1 兩組患者的臨床特征比較

表2 影響結(jié)腸癌預后的單因素分析

表3 影響結(jié)腸癌預后的多因素分析

3 討 論

臨床上盡管仍以TNM分期作為首要指標來判斷結(jié)腸癌患者的預后，但有很多學者發(fā)現(xiàn)雖有著相同TNM分期的結(jié)腸癌患者但其預后可能差距甚遠[5]。因此，為給結(jié)腸癌患者提供一個更合理個體化的治療方案，急切需要臨床上尋找其他更合適的標志物以指導患者術(shù)后所進行的輔助治療。結(jié)腸癌患者群中約85%是因染色體不穩(wěn)定(CIN)而導致腫瘤發(fā)生，另15%的結(jié)腸癌患者群則是因MMR缺陷所致。在DNA的復制過程中逃脫DNA聚合酶的錯配堿基主要是靠MMR系統(tǒng)來進行修復，而以此對基因組維持其穩(wěn)定性，避免細胞發(fā)生突變而間接抑制腫瘤產(chǎn)生。MMR基因(包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)的修飾(如甲基化)或突變可致MMR發(fā)生缺失[6]。Sinicrope等[7]報道，相比pMMR的結(jié)腸癌患者，dMMR結(jié)腸癌患者的預后要更好，dMMR可作為一個判定結(jié)腸癌預后的生物學指標。也有報道提示，MMR狀態(tài)在預測結(jié)腸癌的療效方面與術(shù)后輔助化療的獲益有相關(guān)性，其中pMMR患者能在術(shù)后輔助化療中獲得更多益處，而dMMR患者的獲益較少，且Ⅱ期結(jié)腸癌dMMR患者術(shù)后以氟尿嘧啶單藥化療還可使OS縮短[8]。

國內(nèi)目前關(guān)于結(jié)腸癌dMMR患者的療效及預后相關(guān)報道比較少。本研究我們通過檢測MLH1、MSH2、MSH6、PMS2這4種抗體以判定MMR是否發(fā)生表達缺失，與以往文獻僅以檢測MLH1、MSH2的方案相比，能夠發(fā)現(xiàn)更多單純MSH6及PMS2發(fā)生表達缺失的dMMR人群。本研究中dMMR的發(fā)生率為20.8%不同，主要參照國外文獻的標準[4]，僅將MLH1、MSH2、MSH6、PMS2這4種蛋白是否出現(xiàn)缺失來綜合分析，并未對陽性表達即pMMR患者的強度進一步做分析。本研究結(jié)果顯示，dMMR組患者在Ⅱ期(70.3%)、低分化癌(34.4%)、近端結(jié)腸癌(67.2%)及含黏液分泌癌(40.6%)各因素中的發(fā)生比例要較pMMR組(分別為50.4%、20.1%、46.3%、19.3%)顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義；與國外研究結(jié)果相似[9]。但本研究顯示，在我國結(jié)腸癌≤60歲的患者群中dMMR發(fā)生率更高(67.2%)，明顯高于pMMR組的47.5%。而國外的報道結(jié)果提示結(jié)腸癌患者年齡的分布與發(fā)生dMMR的關(guān)系并不顯著[10]，究其原因本研究未能排除遺傳性非息肉性結(jié)腸癌患者，而該類結(jié)腸癌患者的發(fā)病年齡呈年輕化趨勢且伴有dMMR[11]，另外有報道國人的結(jié)直腸癌發(fā)病年齡要比國外患者早8～10年[12]，均導致本研究的dMMR發(fā)生比例在≤60歲患者群中現(xiàn)在增高。本研究結(jié)果未見在性別構(gòu)成、淋巴結(jié)清掃、治療方式等因素中MMR狀態(tài)存在差異。目前我國的醫(yī)療機構(gòu)還未能開展對MMR狀態(tài)進行常規(guī)檢測，故可通過本研究提示的各臨床特征來初步判定MMR的狀態(tài)。

目前大多研究結(jié)果提示MMR的狀態(tài)與結(jié)腸癌患者手術(shù)后的預后有相關(guān)性。Zaanan等[13]的報道結(jié)果提示，結(jié)腸癌患者經(jīng)單純根治切除術(shù)治療的dMMR組5年無病生存率及5年總生存率分別為80%、85%，而pMMR組分別為56%、66%(P＜0.01)。本研究的結(jié)果與之相似，dMMR組的5年無病生存率、5年總生存率分別為82.8%、87.5%，而pMMR組分別為69.3%、77.0%，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；同時本研究增加對兩組患者DFS、OS的比較，dMMR組的DFS、OS均pMMR組明顯延長，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?？梢娊Y(jié)腸癌患者dMMR是預測患者術(shù)后有著相對較好預后的一個新的生物標志物，分析其原因可能為于顯微鏡下可見dMMR患者的腫瘤細胞周圍有著豐富淋巴細胞浸潤，通過一定的免疫反應而抑制腫瘤細胞的擴散及轉(zhuǎn)移。Win等[14]對1 263例結(jié)腸癌患者回顧性分析其MMR狀態(tài)，共268例患者發(fā)生dMMR，且單因素及多因素分析均提示發(fā)生dMMR是患者預后較好的因素且在Ⅱ、Ⅲ期患者群中更顯著(P＜0.01)。本研究的單因素分析結(jié)果提示與結(jié)腸癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移、死亡均呈明顯相關(guān)的因素為年齡、腫瘤的分化程度、臨床分期、MMR的狀態(tài)(P＜0.05)；而多因素分析顯示，影響結(jié)腸癌DFS、OS的獨立因素為MMR狀態(tài)、臨床分期以及腫瘤的分化程度(P＜0.05)，與上述文獻報道相符。

綜上所述，結(jié)腸癌不同MMR狀態(tài)有著不同的臨床特征，dMMR更多發(fā)生在年齡≤60歲、Ⅱ期、低分化癌、近端結(jié)腸癌及含黏液分泌癌的患者中，且5年無病生存率、5年總生存率均較pMMR患者升高，且DFS、OS明顯延長，可作為預測結(jié)腸癌預后較好的一個標志物。

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Relationship between DNA mismatch repair status and its clinical features and prognosis in patients with stageⅡ/Ⅲ colon cancer.

WANG Hai-xia,HUANG Yan-jing,WANG Lin,CHEN Jun-min.First Department of Medical Oncology,People's Hospital of Hainan Provincial,Haikou 570311,Hannan,CHINA

Objective To analyze the relationship between DNA mismatch repair(MMR)and clinical features and prognosis in patients with stagesⅡ/Ⅲcolon cancers.Methods The tissue specimen of 308 patients with stageⅡ/Ⅲcolon cancer who underwent radical tumor resection in Department of Medical Oncology in our hospital from January 2007 to June 2010 were selected.The expression of MLH1,MSH2,MSH6 and PMS2 were detected by immunohistochemistry,which were divided into defective MMR(dMMR)group and complete MMR(pMMR)group.The clinical features and prognosis between the two groups were compared.Cox proportional hazard model was used to analyze the relationship between MMR status and prognosis of colon cancer.Results The incidence of colon cancer dMMR was 20.8%(64/308)in dMMR group,and 79.2%(244/308)in pMMR group.In dMMR group of patients,the proportion of patients within 60 years old,stageⅡ,poorly differentiated carcinoma,proximal colon and mucinous carcinoma were significantly increased compared with pMMR group(P＜0.05).The recurrence rate and mortality rate of patients in dMMR group were 18.8%(12/64),12.5%(8/64),respectively,which were significantly lower than those in pMMR group[31.6%(77/244),23.0%(56/244),P＜0.05].The 5 year disease-free survival rate and overall survival rate in dMMR group were 82.8%(53/64),87.5%(56/64),respectively,which were significantly higher than those in pMMR group[69.3%(169/244),77.0%(188/244),P＜0.05].Cox proportional hazard model analysis showed that MMR status was an independent factor that affected the disease-free survival and overall survival time of patients(P＜0.05). Conclusion Different MMR states of colon cancer have different clinical features,and dMMR is mostly occurred in patients within 60 years old,stageⅡ,poorly differentiated carcinoma,proximal colon and mucinous carcinoma.It can be used as a marker to predict the prognosis of colon cancer.

Colonic neoplasms;Clinical stage;DNAmismatch repair(MMR);Prognosis

R735.3+5

A

1003—6350（2016）17—2768—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.17.006

2016-04-18)

王海霞。E-mail：wanghaixia74@163.com