時(shí)祝帥,王德霞,聶青松

·檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)·

2010-2015年揚(yáng)州地區(qū)淋球菌耐藥性和流行株質(zhì)粒譜的研究

時(shí)祝帥,王德霞,聶青松

目的：檢測揚(yáng)州地區(qū)臨床分離淋球菌的耐藥性和質(zhì)粒譜，為臨床合理用藥和質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性動(dòng)態(tài)改變提供參考。方法：2010-2015年臨床分離191株淋球菌，采用紙片酸度法檢測產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株(PPNG)。采用WHO推薦瓊脂稀釋法測定菌株對5種抗生素(頭孢曲松、壯觀霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素)的藥物敏感性。用堿裂解法分析菌株的質(zhì)粒譜。結(jié)果：191株對壯觀霉素全部敏感；108株對頭孢曲松敏感，占56.54%，中度敏感83株，占43.46%，無耐藥；環(huán)丙沙星、四環(huán)素、青霉素耐藥菌株分別為187株(97.90%)、163株(85.34%)、162株(84.82%)，PPNG 81株(42.41%)，質(zhì)粒介導(dǎo)的四環(huán)素高度耐藥株(TRNG)98株(51.31%)。146株(76.44%)檢出質(zhì)粒，7種質(zhì)粒譜型。結(jié)論：壯觀霉素可作為揚(yáng)州地區(qū)淋病治療首選用藥，其次為頭孢曲松，使用頭孢曲松應(yīng)隨時(shí)觀察其療效。揚(yáng)州地區(qū)淋球菌耐藥性以質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥為主，TRNG陽性率發(fā)生顯著變化，建立當(dāng)?shù)亓芮蚓退幜餍写氐姆肿由飳W(xué)檔案，可為菌株的溯源提供流行病學(xué)依據(jù)。

耐藥性；質(zhì)粒譜；淋球菌

由于抗生素的不規(guī)則應(yīng)用，淋球菌耐藥性不斷發(fā)生變化，并逐年增加，加重了臨床治療難度。淋球菌產(chǎn)生的耐藥機(jī)制與以質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥以及染色體基因突變等有關(guān)，不同地區(qū)、不同時(shí)期淋球菌質(zhì)粒譜各有特點(diǎn)[1-3]，了解其變化有助于區(qū)別流行株，從分子水平上為菌株流行病學(xué)研究提供客觀可靠的信息。揚(yáng)州地區(qū)自2010年起連續(xù)6年檢測臨床分離的淋球菌191株，研究本地區(qū)淋球菌對抗生素的敏感性和質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥率及其變遷特點(diǎn)，根據(jù)細(xì)菌耐藥情況及耐藥原因針對性指導(dǎo)臨床合理用藥，減少耐藥菌株流行，同時(shí)結(jié)合質(zhì)粒譜分析對淋病患者進(jìn)行傳染源的追蹤。現(xiàn)將結(jié)果作一報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 從2010-2015年揚(yáng)州市皮膚病

性病防治所性病門診患者泌尿生殖道分泌物分離培養(yǎng)獲得191株淋球菌，所有菌株經(jīng)革蘭染色、氧化酶、糖發(fā)酵試驗(yàn)初步鑒定后傳代1次，洗于脫脂牛奶中，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?biāo)準(zhǔn)菌株由中國藥品生物制品鑒定所提供。

1.1.2 主要試劑 抗生素頭孢曲松、壯觀霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)粉劑由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所提供；GC瓊脂為英國Oxiod公司生產(chǎn)；質(zhì)粒提取試劑盒E．Z．N．A．TMPlasmid Mini Kit I為OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 最小抑菌濃度(MIC)測定 采用瓊脂稀釋法測定臨床分離淋球菌對頭孢曲松、壯觀霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素等5種抗生素的MIC[4]。每批實(shí)驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株。藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)：頭孢曲松MIC≤0.03 μg/mL為敏感(S)，0.06～0.5 μg/mL為中度敏感(D)，≥1 μg/mL為耐藥(R)；壯觀霉素MIC≤64 μg/mL為敏感，≥128 μg/mL為耐藥；青霉素和環(huán)丙沙星MIC≤0.03 μg/mL為敏感，0.06～0.5 μg/mL為中度敏感，≥1 μg/mL為耐藥；四環(huán)素≤0.5 μg/mL為敏感，≥1 μg/mL為耐藥，根據(jù)WHO判定標(biāo)準(zhǔn)[5]，四環(huán)素MIC≥16 mg/L判為質(zhì)粒介導(dǎo)的四環(huán)素高度耐藥株(TRNG)陽性。

1.2.2 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株(PPNG)測定 采用紙片酸度定量法[6]測定PPNG，并用已知的β-內(nèi)酰胺酶陽性(E株)和陰性(A株)標(biāo)準(zhǔn)株作對照。

1.2.3 質(zhì)粒提取及質(zhì)粒譜分析 PPNG、TRNG株質(zhì)粒檢測按照文獻(xiàn)[7]，用堿裂解法抽提質(zhì)粒，在用TBE緩沖液配制0．8%瓊脂糖凝膠平板上，5 V/cm電壓，電泳3～4 h。溴乙啶染色，用英國UvI凝膠成像系統(tǒng)分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Marder的電泳結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)，以其相對遷移率為自變量，分子量對數(shù)值為因變量建立回歸方程，然后以待測質(zhì)粒條帶的遷移來計(jì)算其相對分子質(zhì)量大小。

2 結(jié)果

2.1 淋球菌對5種抗生素的敏感性 191株臨床分離的淋球菌對壯觀霉素全部敏感，92株對頭孢曲松中度敏感(48.17%)；對環(huán)丙沙星、四環(huán)素、青霉素耐藥分別為187株(97.90%)、163株(85.34%)、162株(84.82%)；PPNG 81株(42.41%)，TRNG 98株(51.31%)。2010-2015年揚(yáng)州地區(qū)淋球菌對5種抗生素敏感性的檢查結(jié)果見表1。

表1 2010-2015年揚(yáng)州地區(qū)淋球菌對5種抗生素敏感性的檢查結(jié)果[菌株數(shù)(%)]

年度菌株數(shù)四環(huán)素 S R PPNG 陰性 陽性 TRNG 陰性 陽性 2010338(24.24)25(75.76)20(60.60)13(39.40)21(63.64)12(36.36)2011358(22.86)27(77.14)21(60.60)14(40.00)20(57.14)15(42.86)2012294(13.29)25(86.21)16(55.17)13(44.83)14(48.28)15(51.72)2013314(12.90)27(87.10)18(58.06)13(41.94)13(41.94)18(58.06)2014303(10.00)27(90.00)17(56.67)13(43.33)12(40.00)18(60.00)2015331(3.03)32(96.97)18(54.55)15(45.45)13(39.39)20(60.61)合計(jì)191 28(14.66)163(85.34)110(57.59)81(42.41)93(48.69)98(51.31)

2.2 質(zhì)粒檢測 191株淋球菌中146株(76.44%)檢出質(zhì)粒，7種質(zhì)粒譜型。PPNG 有5種質(zhì)粒譜，以4.2 kb+7.4 kb 36株(24.66%)為主；TRNG有5種質(zhì)粒譜，以4.2 kb+39.5 kb+42.5 kb 43株(29.45%)為主。揚(yáng)州地區(qū)146株淋球菌質(zhì)粒分布情況見表2。

3 討論

本研究從2010年連續(xù)6年對揚(yáng)州地區(qū)臨床分離的191株淋球菌進(jìn)行5種抗生素的耐藥檢測，結(jié)果顯示：(1)壯觀霉素6年未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株，廣州、南京和南昌有少數(shù)耐壯觀霉素藥物的菌株報(bào)道[1-3]，說明該抗生素在揚(yáng)州地區(qū)對臨床分離的淋球菌活性最強(qiáng)，具有良好的臨床療效，可以作為揚(yáng)州地區(qū)初次治療淋病的首選藥物，也可作為頭孢菌素過敏患者治療淋病的選擇藥物[8]。191株淋球菌對頭孢曲松中度敏感率(43.46%)顯著高于廣州和南京的報(bào)道[9-10]，且中度敏感菌株從2010年的24.24%逐年增至2015年的51.52%。這一現(xiàn)象提示揚(yáng)州地區(qū)淋球菌對頭孢曲松可能耐藥不斷上升，因此臨床上使用頭孢曲松應(yīng)隨時(shí)觀察其療效，避免不規(guī)則用藥。(2)由于喹諾酮類抗生素的大量使用，使淋球菌對環(huán)丙沙星的耐藥性出現(xiàn)廣泛的播散和流行，造成同一地區(qū)淋球菌對環(huán)丙沙星的耐藥率大幅度上升。揚(yáng)州地區(qū)對環(huán)丙沙星的耐藥率為97．90%，與江蘇地區(qū)淋球菌對環(huán)丙沙星耐藥率99.36%接近[9]，2012-2015年沒有發(fā)現(xiàn)對環(huán)丙沙星敏感的菌株，因此，目前環(huán)丙沙星不宜再作為揚(yáng)州地區(qū)治療淋病的推薦藥物。(3)揚(yáng)州地區(qū)淋球菌對青霉素的耐藥率從2010年的69.70%上升到2015年的93.94%，四環(huán)素的耐藥率從2010年的75.76%上升到2015年的96.97%，表明該兩種藥物也不宜再作為治療淋病的選擇藥物。(4)PPNG和TRNG 是淋球菌中最主要流行的耐藥菌株。本研究結(jié)果顯示，2015年P(guān)PNG陽性率45.45%與2010年陽性率39.40%以及本地區(qū)2004-2007年陽性率41.10%[11]均較接近；2015年TRNG陽性率60.61%與2010年陽性率36.36%及本地區(qū)2004-2007年陽性率27.40%[11]比較上升較快，PPNG/TRNG陽性率與佛山相關(guān)報(bào)道[12]一致，明顯高于國內(nèi)外報(bào)道[1，13]，PPNG/TRNG不同地域的不同檢出率，是否與該地區(qū)臨床有效的診斷、有效的抗菌藥物治療及性活動(dòng)、性行為的變化有關(guān)系，提示對青霉素、四環(huán)素、PPNG/TRNG進(jìn)行淋球菌耐藥追蹤監(jiān)測有重大意義。

表2 2010-2015年揚(yáng)州地區(qū)146株淋球菌質(zhì)粒分布情況

對揚(yáng)州地區(qū)2010-2015年臨床分離146株淋球菌進(jìn)行質(zhì)粒分型，結(jié)果顯示，含7.4 kb的“亞洲型”69株(47.26%)；PPNG首次檢出10株(12.34%)5.3 kb“非洲型”，與上海、佛山等報(bào)道[12,14]結(jié)果相近，提示揚(yáng)州地區(qū)PPNG流行株主要攜帶亞洲型β-內(nèi)酰胺酶基因；42.5 kb質(zhì)粒攜帶TetM基因，介導(dǎo)淋球菌髙水平耐四環(huán)素，結(jié)果顯示含42.5 kb 94株(64.38%)，與國內(nèi)報(bào)道[3,9,12]存在較大差異，表明TRNG攜帶質(zhì)粒分布存在明顯的地區(qū)差異。臨床分離的191株淋球菌共有7種質(zhì)粒譜，其中以4.2 kb+7.4 kb和4.2 kb+39.5 kb+42.5 kb為主，共79株(54.11%)，與王德霞等[11]報(bào)道不同，表明該地區(qū)PPNG/TRNG高耐藥基因的質(zhì)粒分布已發(fā)生變化；檢出7.4+39.5+42.5、4.2+7.4+39.5+42.5 kb共33株(22.60%)，提示PPNG/TRNG質(zhì)粒譜型與淋球菌多重耐藥有一定關(guān)系。淋球菌質(zhì)粒譜作為淋球菌流行病學(xué)監(jiān)測的工具，其敏感性還不夠，所以在揚(yáng)州區(qū)域內(nèi)，充分利用分子分型技術(shù)建立具有某一特性的菌株型別數(shù)據(jù)庫，從而建立起當(dāng)?shù)亓芮蚓餍写氐姆肿由飳W(xué)檔案[14]，可為淋球菌耐藥菌株的溯源提供流行病學(xué)依據(jù)。

[1] 刁興，鄭和平，曹文苓，等.1996-2001年廣州淋球菌耐藥性和質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥株流行趨勢[J].中華皮膚科雜志，2002，35(6)：467．

[2] SU X，JIANG F．Surveillance of antimicrobial susceptibilities in Neisseria gonorrhoeae in Nanjing，China，1999-2006[J].Sex Transm Dis，2007，34(1)：995.

[3] 謝大澤，湛學(xué)軍，陶雪花，等.南昌地區(qū)淋球菌對抗生素的耐藥性及質(zhì)粒譜分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010,12(7)：2605.

[4] 葉順章.淋病實(shí)驗(yàn)室診斷[M]//葉順章，王千秋，王荷英，等.性傳播疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷.2版.北京：科學(xué)出版社，2009：9.

[5] World Health Organization.Sensitivity testing of Neisseria gonorrhoeae．Methodologies for use by participants in the WHO Western Pacific Regional Surveillance Programrnol/Ler[C].In WHO/WPR Regional Antimicrobial Surveillance Working Group Meeting Proceedings，1992．

[6] 葉順章．性傳播疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷[M].黃培堂，等，譯.北京：科學(xué)出版社，2001：53．

[7] 薩姆布魯克J，拉塞爾DW．分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]黃培黨等，譯.3版．北京：科學(xué)出版社,2002：27．

[8] BIGNELL C，F(xiàn)ITZ GM．UK national guideline for the management ofgonorrhea in adults[J]．STD AIDS，2011，22(10)：541.

[9] 黎小東，梁景耀，畢超，等.廣州地區(qū)淋球菌耐藥性的趨勢分析[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，37(4)：472.

[10] ZHU BY，YU RX，YIN Y，etal．Surveillance of antimicrobial suscep-tibilities of Neisseria gonorrhoeae in Nanjing，China，2000 to 2012[J].Sex Transm Dis,2014，41(1)：501．

[11] 王德霞，時(shí)祝帥，聶青松.江蘇省揚(yáng)州地區(qū)淋球菌耐藥性質(zhì)粒譜的研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2008,12(7)：75.

[12] 李燕娃，石正琪，趙培來，等.佛山地區(qū)產(chǎn)青霉素酶淋球菌和高度耐四環(huán)素淋球菌質(zhì)粒譜型的研究[J].中國抗生素雜志，2014,39(3):236.

[13] MARTIN I，SAWATZKY P，ALLEN V，etal.Emergence and characteriza-tion of Neisseria gonorrhoeae isolates with decreased susceptibili-ties to ceftriaxone and cefixime in Canada：2001-2010 [J]．Sex Transm Dis，2012，39(1)：316．

[14] 陳紹椿,尹躍平,戴秀芹,等.淋球菌對頭孢曲松的敏感性及淋球菌多抗原測序分型研究[ J].中華皮膚科雜志,2014,47(5):316.

(本文編輯 劉璐)

2016-07-06

江蘇省揚(yáng)州市疾病預(yù)防控制中心 皮膚病性病防治所，225002

時(shí)祝帥(1975-)，男，主管技師.

1000-2200(2016)12-1681-03

R 378.16

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.12.046