孫 謙，馬國旗，汪庚明，江 浩，周 燕，徐洪波，張亞軍，周育夫

·臨床醫(yī)學(xué)·

Maspin基因在不同轉(zhuǎn)移習(xí)性的人鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)水平的研究

孫 謙，馬國旗，汪庚明，江 浩，周 燕，徐洪波，張亞軍，周育夫

目的：在mRNA和蛋白水平檢測5種不同轉(zhuǎn)移習(xí)性的人鼻咽癌細(xì)胞株中Maspin基因表達(dá)的差異，探討Maspin基因與已知轉(zhuǎn)移習(xí)性人鼻咽癌細(xì)胞株之間的相關(guān)性，為鼻咽癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制及臨床預(yù)測轉(zhuǎn)移風(fēng)險提供理論基礎(chǔ)。方法：體外培養(yǎng)SUNE-1-5-8F、SUNE-1、CNE-2Z、CNE-1、SUNE-1-6-10B 5株不同轉(zhuǎn)移習(xí)性的人鼻咽癌細(xì)胞株。用RT-PCR及Western blot 2種方法在mRNA和蛋白水平檢測5種人鼻咽癌細(xì)胞株中Maspin基因表達(dá)情況。結(jié)果：Maspin基因在SUNE-1-5-8F、SUNE-1、CNE-1及SUNE-1-6-10B細(xì)胞株均有不同程度表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在CNE-2Z細(xì)胞株中不表達(dá)，且在mRNA和蛋白水平Maspin基因表達(dá)具有一致性；Maspin基因在不同轉(zhuǎn)移習(xí)性人鼻咽癌細(xì)胞株中mRNA和蛋白表達(dá)量總體存在差異(P<0.05)，但表達(dá)量不隨鼻咽癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)移習(xí)性增高而降低(P>0.05)。結(jié)論：Maspin基因在不同轉(zhuǎn)移習(xí)性的人鼻咽癌細(xì)胞株中mRNA和蛋白表達(dá)量不同；Maspin基因可能與人鼻咽癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移潛能無相關(guān)性。

鼻咽腫瘤；轉(zhuǎn)移抑制基因；Maspin基因；RT-PCR；Western blot

鼻咽癌是我國高發(fā)惡性腫瘤[1]。頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移在鼻咽癌早期也很多見，且發(fā)生轉(zhuǎn)移率高達(dá)60%。局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因[2]。隨著放療技術(shù)的發(fā)展，局部復(fù)發(fā)明顯減少，由于尚未明確鼻咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移療效仍無明顯提高，因此明確鼻咽癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制可能是提高鼻咽癌療效關(guān)鍵步驟。

Maspin(Mammary Serine Protease Inhibitor)基因是1994年ZOU等[3]在用消減雜交技術(shù)從乳腺上皮細(xì)胞中分離出的，在乳腺正常組織和腫瘤組織中存在差異表達(dá)，正常乳腺組織中呈高表達(dá)，而在乳腺癌中表達(dá)水平明顯降低甚至表達(dá)沉默。隨后大量研究者對其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤轉(zhuǎn)移過程中Maspin基因發(fā)揮抑制作用。通過檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未發(fā)現(xiàn)學(xué)者在抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移方面對Maspin基因的研究。本研究通過RT-PCR法在RNA水平和Western blot法在蛋白水平檢測Maspin基因在5種不同轉(zhuǎn)移習(xí)性人鼻咽癌細(xì)胞株[SUNE-1-5-8F(極高轉(zhuǎn)移性) 、SUNE-1和CNE-2Z (高轉(zhuǎn)移性)、CNE-1(中度轉(zhuǎn)移性)、SUNE-1-6-10B(低轉(zhuǎn)移性)]的Maspin基因mRNA表達(dá)及蛋白定位和表達(dá)是否存在差異，進(jìn)而明確其與不同轉(zhuǎn)移習(xí)性人鼻咽癌細(xì)胞株是否存在相關(guān)性，為本研究進(jìn)一步動物實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)，爭取在明確鼻咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制上提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 5株不同轉(zhuǎn)移習(xí)性的人鼻咽癌細(xì)胞株購買于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室。本研究主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清購自HyClone公司；PCR Marst Mix(2×)購自Thermo公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；Marker購自上海生工；WBKLS0100購自底物顯色劑購自Millipore公司；Maspin抗體購自Anbo公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京中杉公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1、CNE-2Z、CNE-1及SUNE-1-6-10B培養(yǎng)于含10%新生牛血清及雙抗的1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時，加入0.25%胰蛋白酶2 mL消化進(jìn)行傳代及凍存。

1.2.2 RT-PCR檢測Maspin基因mRNA表達(dá)水平 (1)RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：操作過程按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。(2) PCR擴(kuò)增：Maspin和GAPDH引物用Premier 5.0軟件設(shè)計；Maspin基因和內(nèi)參GAPDH引物擴(kuò)增長度分別為170 bp和258 bp。Maspin和GAPDH在不同的反應(yīng)管內(nèi)同時擴(kuò)增，每種細(xì)胞株設(shè)3個復(fù)孔。按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。(3) RT-PCR結(jié)果判定：使用Tanon GIS-3500圖像分析軟件掃描各目的基因與內(nèi)參GAPDH產(chǎn)物條帶的灰度值。Maspin基因mRNA表達(dá)的相對值為各目的基因與GAPDH產(chǎn)物條帶的灰度值比值。

1.2.3 Western blot法檢測5種細(xì)胞株中Maspin蛋白表達(dá) 之前實(shí)驗(yàn)步驟按文獻(xiàn)上步驟進(jìn)行，最后應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室quantity one軟件分析實(shí)驗(yàn)所得各組光密度數(shù)據(jù)。計算公式：相對表達(dá)量=各目的蛋白光密度值/相應(yīng)內(nèi)參GAPDH光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用單因素方差分析和LSD法。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法在mRNA水平檢測Maspin基因mRNA在不同轉(zhuǎn)移習(xí)性鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)水平 在mRNA水平Maspin基因在5株轉(zhuǎn)移習(xí)性不同的人鼻咽癌細(xì)胞株中擴(kuò)增量存在差異，在CNE-2Z中不表達(dá)，其他細(xì)胞株都有不同程度的表達(dá)(見圖1)。根據(jù)管家基因GAPDH值對Maspin基因mRNA的值進(jìn)行標(biāo)化，在mRNA水平比較標(biāo)化后5株不同轉(zhuǎn)移習(xí)性鼻咽癌細(xì)胞株中Maspin基因表達(dá)量有差異(P<0.05)(見表1)。兩兩比較結(jié)果顯示，SUNE-1-6-10B組、CNE-1組、SUNE-1組、SUNE-1-5-8F組4組表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均高于CNE-2Z組(P<0.05)。

分組nMaspin/GAPDH均值FPMS組內(nèi)SUNE-1-6-10B組30.67±0.04CNE-1組30.73±0.01CNE-2Z組30.00±0.0010.14<0.050.002SUNE-1組30.57±0.05SUNE-1-5-8F組30.61±0.04

2.2 Western blot法在蛋白水平檢測Maspin基因在5株鼻咽癌細(xì)胞的表達(dá) 在本實(shí)驗(yàn)室條件下，Maspin蛋白在SUNE-1-5-8F組、SUNE-1組、CNE-1組及SUNE-1-6-10B組細(xì)胞株均有表達(dá)，而在 CNE-2Z細(xì)胞株不表達(dá)(見圖2)。方差分析和兩兩比較結(jié)果顯示，SUNE-1-6-10B組、CNE-1組、SUNE-1組、SUNE-1-5-8F組4組表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均高于CNE-2Z組(P<0.05)(見表2)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是慢性復(fù)雜過程、包括多基因、多階段、多因素參與調(diào)控，轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤獨(dú)有的生物學(xué)行為，同時轉(zhuǎn)移也是惡性腫瘤主要致死原因。目前腫瘤防治的主要困難就是無法在腫瘤轉(zhuǎn)移之前找到評估腫瘤侵襲力、轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的指標(biāo)。在飛速發(fā)展的分子生物學(xué)的帶動下，原癌基因、抑癌基因、轉(zhuǎn)移抑制基因等越來越多的腫瘤基因被發(fā)現(xiàn)。研究[4]發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)移抑制基因?qū)υl(fā)腫瘤生長無抑制作用，而只抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，為了控制腫瘤的轉(zhuǎn)移，更多的了解腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制，因此對腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的研究越來越受到關(guān)注。

鼻咽癌治療失敗的主要原因是局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，隨著放療技術(shù)發(fā)展及同步化療的方法興起，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是目前鼻咽癌治療失敗的主要原因。探討鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，可以為更有效的預(yù)防和治療方法提供理論依據(jù)。

Maspin基因是1994年ZOU等[3]用消減雜交技術(shù)從乳腺上皮細(xì)胞中分離出的腫瘤抑制基因。研究發(fā)現(xiàn)其在正常組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，在腫瘤組織中，隨著腫瘤的不斷進(jìn)展其表達(dá)也逐漸降低，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。BEECKEN等[5]通過免疫組織化學(xué)和RT-PCR的方法檢測了51例膀胱移行細(xì)胞癌，發(fā)現(xiàn)Maspin基因在浸潤癌中表達(dá)最少，在淺表膀胱癌中表達(dá)量中等，在正常的膀胱上皮中高表達(dá)。此外，在食管癌[6]、涎腺腫瘤[7]、黑色素瘤[8]等腫瘤也發(fā)現(xiàn)具有腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用。隨著對Maspin基因研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤中并非隨著其發(fā)展而呈降低趨勢，如胃癌[9]、腦膠質(zhì)瘤[10]、胰腺癌[11]等，這種反表達(dá)可能與上皮細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境改變有關(guān)，也可能與Maspin啟動子的甲基化有關(guān)。Maspin蛋白在癌細(xì)胞核和核外均有表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)的Maspin蛋白表達(dá)提示預(yù)后較好，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)則提示預(yù)后不良[12]。MATSUOKA等[13]用免疫組織化學(xué)法測定101例肺鱗癌患者M(jìn)aspin基因的表達(dá)和定位，結(jié)果顯示在無病生存期方面，其預(yù)后和淋巴轉(zhuǎn)移及病理分期有著明顯的相關(guān)性，Maspin基因在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)可能是肺鱗癌一個獨(dú)立的不良預(yù)后指標(biāo)。

目前對Maspin基因抑制腫瘤的可能機(jī)制尚不完全清楚，通過大量研究表明可能與以下因素有關(guān)：(1) Maspin基因增加細(xì)胞黏附。ENDSLEY等[14]研究發(fā)現(xiàn)Maspin基因作為纖溶酶原激活劑系統(tǒng)和β1整合素之間的橋梁，有利于細(xì)胞的黏附。(2)Maspin基因抑制腫瘤血管生長。SHARMA等[15]研究證實(shí)，在乳腺癌組織中VEGF-A和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(MTA1)的表達(dá)與Maspin基因表達(dá)成反比。(3) Maspin基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MAHAJAN等[16]研究也發(fā)現(xiàn)Maspin基因作為活性氧物的清除劑，利用半胱氨酸巰基抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞的生長，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

Maspin基因已在多種腫瘤中有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，但隨著研究深入發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)作用相反[12]。檢索國內(nèi)外大量文獻(xiàn)，暫未發(fā)現(xiàn)Maspin基因在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中相關(guān)作用的研究。本課題利用RT-PCR、Western blot技術(shù)檢測Maspin基因在5株不同轉(zhuǎn)移習(xí)性的人鼻咽癌細(xì)胞株中mRNA和蛋白表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Maspin基因在SUNE-1-5-8F、SUNE-1、CNE-1及SUNE-1-6-10B細(xì)胞株均有不同程度表達(dá)，在CNE-2Z細(xì)胞株中不表達(dá)，且在mRNA和蛋白水平Maspin基因表達(dá)具有一致性。本研究所選用的5株鼻咽癌細(xì)胞株都是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中最常用的體外細(xì)胞株，已明確其病理及轉(zhuǎn)移習(xí)性，國內(nèi)外學(xué)者在放射生物學(xué)、放療敏感性、耐藥性及轉(zhuǎn)移機(jī)制方面選擇作為實(shí)驗(yàn)的對象。SUNE-1-5-8F為低分化鱗癌和SUNE-1-6-10B高分化鱗癌，CNE-2Z、SUNE-1為低分化鱗癌，CNE-1為高分化鱗癌，其中SUNE-1-5-8F和SUNE-1-6-10B為SUNE-1的2個克隆亞型。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Maspin基因在5株不同轉(zhuǎn)移習(xí)性的人鼻咽癌細(xì)胞株mRNA及蛋白表達(dá)量不同；但是Maspin基因在蛋白和mRNA水平的表達(dá)具有一致性，在CNE-2Z細(xì)胞株中不表達(dá)，在其他細(xì)胞株都有不同程度的表達(dá)，可能是由于Maspin在不同的細(xì)胞類型中作用機(jī)制不同，有著不同的功能表達(dá)，Maspin細(xì)胞亞定位也有重要影響，另外Maspin的轉(zhuǎn)錄因子和啟動子區(qū)甲基化都有可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)其表達(dá)[17]。Maspin基因在不同轉(zhuǎn)移潛能的鼻咽癌細(xì)胞株中的無規(guī)律性表達(dá)，提示了該基因可能與人鼻咽癌腫瘤細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移潛能無相關(guān)性。CNE-2Z和SUNE-1均為高轉(zhuǎn)移性，CNE-2Z在mRNA和蛋白水平均不表達(dá)，可能CNE-2Z細(xì)胞株不含有Maspin基因。

腫瘤轉(zhuǎn)移是治療失敗和患者死亡的主要原因，目前惡性腫瘤的治療所面臨的關(guān)鍵在于對腫瘤轉(zhuǎn)移的控制,腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的研究是今后提高腫瘤療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究證明了Maspin基因在SUNE-1-5-8F、SUNE-1、CNE-1及SUNE-1-6-10B細(xì)胞株均有不同程度表達(dá)，但在CNE-2Z細(xì)胞株中不表達(dá)，不伴隨著細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)而降低。Maspin基因在鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過程中作用有待進(jìn)一步研究。

[1] SUN X,TONG LP,WANG YT,etal.Can global variation of nasopharynx cancer be retrieved from the combined analyses of IARC cancer information (CIN) databases?[J].PLoS One，2011，6(7):e22039.

[2] TAO Y，BIDAULT F，BOSQ J,etal.Distant metastasis of undifferentiated carcinoma of nasopharyngeal type [J].Onkologie，2008,31(11):574.

[3] ZOU Z,ANISOWICZ A,HENDRIX MJ,etal.Maspin,a serpin with tumor-suppressing activity in human mammary epithelial cells[J].Science,1994,263(5146):526.

[4] STEEG PS.PersPectives on classic article:metastasis suppressor genes[J].Natl Cancer Inst，2004,96(6):E4.

[5] BEECKEN WD,ENG T,ENGELS K,etal.Clinical relebance of Maspin expression in bladder cancer[J].World J Urol,2006,24(3):338.

[6] WANG Y,SHENG S,ZHANG J,etal.Elevated maspin expression is associated with better overall survival in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) [J].PLoS One，2013,8(5):e63581.

[7] TARAKJI B,ASHOK N,SHEIRAWAN MK,etal.Maspin as a tumour suppressor in salivary gland tumour [J].J Clin Diagn Res，2014,8(12) ：5.

[8] DENK AE,BETTSTETTER M,WILD PJ,etal.Loss of maspin expression contributes to a more invasive potential in malignant melanoma[J].Pigment Cell Res，2007,20(2):112.

[9] SONG SY，SON HJ，KIM MH,etal.Prognostic significance of maspin expression in human gastric adenocarcinoma[J].Hepatogastroenterology,2007,54(75):973.

[10] XU L,LIU H,YU J,etal.Methylation-induced silencing of maspin contributes to the proliferation of human glioma cells[J].Oncol Rep，2016,36(1)：57.

[11] LU M,LI J,HUANG Z,etal.Aberrant Maspin mRNA Expression is Associated with Clinical Outcome in Patients with Pulmonary Adenocarcinoma.[J].Med Sci Monit，2016,13(22):134.

[12] GOULET B,CHAN G,CHAMBERS AF,etal.An emerging role for the nuclear localization of maspin in the suppression of tumor progression and metastasis[J].Biochem Cell Biol,2012,90(1):22.

[13] MATSUOKA Y,TAKAGI Y,NOSAKA K,etal.Cytoplasmic expression of maspin predicts unfavourable prognosis in patients with squamous cell carcinoma of the lung[J].Histopathology，2016,69(1):114.

[14] ENDSLEY MP,HU Y,DENG Y,etal.Maspin,the molecular bridge between the plasminogen activator system and beta1 integrin that facilitates cell adhesion[J].Biol Chem，2011,286(28):24599.

[15] SHARMA G,MIRZA S,PARSHAD R,etal.Clinical significance of Maspin promoter methylation and loss of its protein expression in invasive ductal breast carcinoma:correlation with VEGF-A and MTA1 expression[J].Tumour Biol,2011,32(1):23.

[16] MAHAJAN N,SHI HY,LUKAS TJ,etal.Tumor suppressive maspin functions as a ROS scavenger:importance of cysteine residues[J].J Biol Chem,2013,288(16):11611.

[17] ROSE SL,FITZGERALD MP,WHITE NO,etal.Epigenetic regulation of maspin expression in human ovarian carcinoma cells[J].Gynecol Oncol,2006,102(2):319.

(本文編輯 劉暢)

Expression of Maspin gene in human nasopharyngeal carcinoma cell line with different metastatic behavior

SUN Qian,MA Guo-qi,WANG Geng-ming,JIANG Hao,ZHOU Yan,XU Hong-bo,ZHANG Ya-jun,ZHOU Yu-fu

(DepartmentofRadiationOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233004,China)

Objective:To explore the differences of the expression levels of Maspin mRNA and protein in 5 kinds of human nasopharyngeal carcinoma cell lines with different metastatic behavior,and investigate its correlation for providing the theory basis in studying the metastasis mechanism of nasopharynx cancer and predicting clinical risk.Methods:The SUNE-1-5-8F,SUNE-1,CNE-2Z,CNE-1 and SUNE-1-6-10B human nasopharyngeal carcinoma cell lines with different metastatic behavior were cultivatedinvitro.The expression levels of Maspin mRNA and protein in 5 kinds of human nasopharyngeal carcinoma cell lines were detected using RT-PCR and Western blot.Results:The differences of the expressions of Maspin gene in SUNE-1-5-8F,SUNE-1,CNE-1 and SUNE-1-6-10B cell lines were not statistically significant(P>0.05),and the Maspin expression in CNE-2Z cell line could not be detected.The expressions of Maspin mRNA and protein were consistent.The total expression contents of Maspin mRNA and protein in human nasopharyngeal carcinoma cell lines with different metastatic behavior were different(P<0.05),and the expression of which did not change with the increasing of metastatic behavior of cancer cells.Conclusions:The mRNA and protein expressions of Maspin gene in human nasopharyngeal carcinoma cell lines with different metastatic behavior are different,and the Maspin expression maybe be no-correlation with the metastatic potential of nasopharynx cancer cells.

nasopharyngeal carcinoma;metastasis suppressor gene;Maspin gene;reverse transcription PCR;Western blot

2016-06-01

蚌埠醫(yī)學(xué)院科研課題(Byky1376)

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 放療科，安徽 蚌埠 233004

孫 謙(1983-)，男，碩士，主治醫(yī)師.

1000-2200(2016)12-1566-04

R 739.63

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.12.008